青蒿素通過(guò)KIT/PI3K/AKT通路抑制黑色素瘤根治術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移
癌癥根治性手術(shù)是黑色素瘤的主要治療方式，但幾乎所有惡性黑色素瘤患者術(shù)后都會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，最終死亡。這一臨床困境迫切需要更好的術(shù)后治療藥物。青蒿素是一種安全有效的抗瘧藥物，已在臨床上使用數(shù)十年。然而，目前尚無(wú)關(guān)于青蒿素對(duì)腫瘤切除后黑色素瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移影響的研究。在本研究中，作者在 Balb/c 裸鼠上建立了術(shù)后腫瘤模型，發(fā)現(xiàn)亞臨床劑量的青蒿素能顯著抑制腫瘤切除后小鼠的黑色素瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并延長(zhǎng)其生存時(shí)間。在 B16 和 A375 細(xì)胞系的體外實(shí)驗(yàn)中也得到了類似結(jié)果。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，青蒿素通過(guò) c-KIT/PI3K/AKT 信號(hào)通路在體外和體內(nèi)抑制根治術(shù)后的黑色素瘤。作者的研究結(jié)果支持青蒿素在惡性黑色素瘤術(shù)后治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。該文章于 2025 年 1 月發(fā)表于《International Journal of Biological Sciences》期刊上，IF：8.2。
研究技術(shù)路線：
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、青蒿素聯(lián)合根治性手術(shù)抑制黑色素瘤體內(nèi)生長(zhǎng)
作者首先闡述了青蒿素在體內(nèi)抑制黑色素瘤的效果。通過(guò)切除 B16 黑色素瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的原發(fā)性皮下黑色素瘤，建立了術(shù)后模型（圖 1A）。癌癥根治性手術(shù)后，將小鼠分為 5 組，包括陰性對(duì)照組（NC）、每天 13.3mg/kg 青蒿素組（Art-13.3mg/kg 組）、每天 40mg/kg 青蒿素組（Art-40mg/kg 組）、每天 40mg/kg 青蒿素 3 次組（Art-40mg/kg×3 組）和順鉑組作為陽(yáng)性對(duì)照，并進(jìn)行相應(yīng)處理。隨后測(cè)量上述處理后小鼠的黑色素瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況和生存時(shí)間。結(jié)果顯示，40mg/kg 青蒿素組、40mg/kg×3 青蒿素組和順鉑組顯著減小了復(fù)發(fā)性腫瘤的大小。40mg/kg 青蒿素組的效果與陽(yáng)性對(duì)照順鉑相似，而 40mg/kg×3 青蒿素組效果最佳（圖 1B）。生存分析還表明，Art-40mg/kg 組和 Art-40mg/kg×3 組的小鼠比 NC 組的小鼠生存時(shí)間更長(zhǎng)（圖 1C）。當(dāng)小鼠因腫瘤負(fù)擔(dān)死亡或達(dá)到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，作者解剖小鼠檢查是否發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，青蒿素抑制了肺轉(zhuǎn)移（圖 1D-E）。
圖 1 青蒿素抑制了黑色素瘤的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并延長(zhǎng)了生存時(shí)間。
同時(shí)，作者使用另一種黑色素瘤細(xì)胞系 A375 來(lái)驗(yàn)證結(jié)果。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，作者發(fā)現(xiàn)了相似的趨勢(shì)，即青蒿素顯著減小了復(fù)發(fā)性腫瘤的大小（圖 1F-G），并延長(zhǎng)了建模小鼠的預(yù)期壽命（圖 1H）。
綜上所述，青蒿素可以抑制黑色素瘤在癌癥根治性切除后的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并延長(zhǎng)生存時(shí)間，其亞臨床劑量的抗黑色素瘤效果與順鉑相似，甚至更好。
2、青蒿素抑制黑色素瘤體外生長(zhǎng)、遷移和侵襲
作者還使用 B16 和 A375 細(xì)胞系證實(shí)了青蒿素在體外抑制黑色素瘤的效果。對(duì) B16 細(xì)胞進(jìn)行 MTT 檢測(cè)，計(jì)算不同濃度青蒿素作用下的細(xì)胞活力（圖 2A），得出青蒿素的半數(shù)抑制濃度（IC50）為 214.89μM。因此，在后續(xù)的一些實(shí)驗(yàn)中，作者選擇 200μM 的青蒿素處理 B16 細(xì)胞。進(jìn)行集落形成實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證青蒿素可以顯著降低 B16 細(xì)胞的增殖能力（圖 2B-C）。此外，作者通過(guò)對(duì) B16 細(xì)胞系進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同組別的遷移能力（圖 2D）。結(jié)果表明，與 NC 組相比，青蒿素（濃度超過(guò) 50μM）可以顯著縮短 B16 細(xì)胞的遷移距離（圖 2E）。隨后進(jìn)行 Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，對(duì)穿過(guò)聚酯（PET）膜的細(xì)胞進(jìn)行成像和計(jì)數(shù)（圖 2F），這也表明青蒿素可以抑制黑色素瘤的遷移（圖 2G）和侵襲（圖 2H）。
圖 2 青蒿素抑制了 B16 和 A375 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。
在 A375 細(xì)胞系上也獲得了類似的效果。劃痕實(shí)驗(yàn)表明青蒿素可以顯著抑制細(xì)胞遷移（圖 2I-J）。Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)和 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，青蒿素顯著降低了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。MTT 檢測(cè)表明青蒿素也抑制了 A375 細(xì)胞的增殖（圖 2K），集落形成實(shí)驗(yàn)也證明了類似的趨勢(shì)。
3、基于 RNA 測(cè)序和高通量分析篩選青蒿素作用通路
在確定青蒿素在體內(nèi)和體外均具有抗黑色素瘤作用后，作者通過(guò) RNA 測(cè)序分析進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。利用術(shù)后模型，作者獲取了一些組織，根據(jù)分組將其命名為原位組（手術(shù)前的原發(fā)性腫瘤）、復(fù)發(fā) - NC 組（N_recur 組，NC 組術(shù)后復(fù)發(fā)性腫瘤）、復(fù)發(fā) - Art 組（T_recur 組，青蒿素治療組術(shù)后復(fù)發(fā)性腫瘤）和肺轉(zhuǎn)移組（Metast 組）。通過(guò)火山圖展示 N_recur 組和 T_recur 組之間（圖 3A）、原發(fā)性腫瘤和肺轉(zhuǎn)移之間（圖 3B）的差異表達(dá)基因。同時(shí)，體外處理的差異基因也在火山圖中展示，包括 B16-NC 組和 B16-Art 組（圖 3C）。然后，基于上述差異基因進(jìn)行 KEGG 通路分析，并展示每次分析中排名前 20 的通路（圖 3D-F）。包括 PI3K-AKT 通路在內(nèi)的幾個(gè)通路參與了所有三項(xiàng)分析，這表明這些通路可能與黑色素瘤轉(zhuǎn)移以及體內(nèi)外青蒿素治療均相關(guān)。
圖 3 基于 RNA 測(cè)序和高通量分析篩選青蒿素作用通路
4、進(jìn)一步篩選青蒿素抑制黑色素瘤的潛在靶點(diǎn)
為了確定與青蒿素相關(guān)的重要通路，作者繪制了維恩圖，展示組織和細(xì)胞系中青蒿素相關(guān)通路的交集（圖 4A）。用氣泡圖展示了 11 個(gè)交集通路（圖 4B），其中 PI3K/AKT 信號(hào)通路包含的基因數(shù)量最多。因此，作者選擇該通路作為青蒿素可能激活的潛在通路。作者進(jìn)一步找出了青蒿素參與 PI3K-AKT 通路的確切差異基因（圖 4C-D），這表明 KIT 在體內(nèi)外均下調(diào)，提示 KIT 是青蒿素的一個(gè)重要靶點(diǎn)。RT-qPCR 檢測(cè)證明青蒿素顯著降低了 B16 黑色素瘤細(xì)胞系中 KIT 的表達(dá)（圖 4E）。為了證實(shí) KIT 在黑色素瘤中的關(guān)鍵作用，作者基于 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的 468 例黑色素瘤患者進(jìn)行生存分析，確定 KIT 是與黑色素瘤患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)的重要生物標(biāo)志物（圖 4F）。
圖 4 高通量分析篩選青蒿素的作用靶點(diǎn)
5、青蒿素靶向 c-KIT/PI3K/AKT 信號(hào)通路
作者在體內(nèi)外將青蒿素應(yīng)用于黑色素瘤，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn) c-KIT 是青蒿素的靶點(diǎn)（圖 5A）。結(jié)果顯示，青蒿素顯著劑量依賴性地降低 c-KIT 表達(dá)（圖 5B）。它還減弱了 PI3K（ser244/249）、AKT（Thr 308）和 NFKB（ser536）的磷酸化（圖 5C-E），這表明青蒿素可能調(diào)節(jié)由 c-KIT 誘導(dǎo)的 PI3K/AKT 信號(hào)通路。
圖 5 青蒿素激活 c-KIT 誘導(dǎo)的通路
作者還研究了青蒿素調(diào)節(jié)的上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標(biāo)志物的表達(dá)（圖 5F）。結(jié)果表明，青蒿素顯著降低了 Snail、N - 鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)，同時(shí)增加了 E - 鈣粘蛋白的表達(dá)（圖 5G-J），支持青蒿素能夠抑制 EMT，進(jìn)而抑制黑色素瘤的遷移和侵襲。
在體內(nèi)研究中也獲得了類似結(jié)果，從術(shù)后模型收集組織樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，包括手術(shù)前的原發(fā)性腫瘤、NC 組術(shù)后復(fù)發(fā)性腫瘤、Art 組術(shù)后復(fù)發(fā)性腫瘤和肺轉(zhuǎn)移組織。與復(fù)發(fā) - NC 組相比，復(fù)發(fā) - Art 組中 c-KIT、磷酸化 AKT、N - 鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)顯著降低（圖 5K-O）。
這些結(jié)果表明，青蒿素可以通過(guò)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活 KIT 誘導(dǎo)的 PI3K-AKT 通路，從而抑制黑色素瘤。
6、c-KIT 基因敲除模擬青蒿素的作用效果
為了研究 c-KIT 的作用，作者使用 gRNA-Cas9 技術(shù)敲除 B16 細(xì)胞中的 c-KIT，隨后探究 c-KIT 敲除組（B16-KIT-gRNA）與野生型對(duì)照組（B16-NC）之間的差異。集落形成實(shí)驗(yàn)表明，敲除 c-KIT 顯著抑制了 B16 細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)（圖 6A-B）。MTT 檢測(cè)也顯示出類似的趨勢(shì)（圖 6C）。進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)研究 c-KIT 敲除對(duì)細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果表明敲除 c-KIT 顯著抑制了 B16 細(xì)胞的遷移（圖 6D-E）。
圖 6 gRNA-Cas9 技術(shù)敲除 c-KIT 顯著抑制黑色素瘤
對(duì)兩組進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（圖 6F）。結(jié)果證實(shí)，與 B16-NC 組相比，B16-KIT-gRNA 組中 c-KIT 的表達(dá)顯著降低（圖 6G）。正如預(yù)期的那樣，c-KIT 的下游靶點(diǎn) AKT（Thr308）的磷酸化被 c-KIT 敲除顯著下調(diào)（圖 6H）。同時(shí)，B16-KIT-gRNA 組中的 EMT 生物標(biāo)志物 N - 鈣粘蛋白和波形蛋 白減少（圖 6I-J）。
這些結(jié)果表明，敲除 c-KIT 可能通過(guò)抑制 c-KIT/AKT 信號(hào)通路來(lái)抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)和遷移。
7、c-KIT 過(guò)表達(dá)減弱青蒿素的抗黑色素瘤作用
為了進(jìn)一步闡明 c-KIT 的作用，作者用過(guò)表達(dá) KIT 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 B16 細(xì)胞。進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)，包括三組：陰性對(duì)照組（NC）、青蒿素治療組（Art）和青蒿素治療加 KIT 過(guò)表達(dá)組（Art + KIT_OE）。
首先，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 KIT/PI3K/AKT 通路（圖 7A）。結(jié)果顯示，青蒿素降低了 c-KIT 的表達(dá)、磷酸化水平，以及 c-KIT 下游靶點(diǎn) PI3K 和 AKT 的磷酸化水平，而過(guò)表達(dá) c-KIT 則逆轉(zhuǎn)了青蒿素的作用（圖 7B-E）。MTT 檢測(cè)顯示，c-KIT 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了青蒿素對(duì) B16 細(xì)胞的抗增殖作用（圖 7F）。劃痕實(shí)驗(yàn)表明，青蒿素抑制了 B16 細(xì)胞的遷移，而 c-KIT 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了青蒿素的作用（圖 7G-H）。B16 細(xì)胞的 Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果，表明 c-KIT 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了青蒿素的作用（圖 7I-K）。
圖 7 青蒿素通過(guò) c-KIT 相關(guān)通路抑制黑色素瘤，而 KIT 過(guò)表達(dá)（OE）的挽救實(shí)驗(yàn)?zāi)孓D(zhuǎn)了這些效果
8、PI3K/AKT 通路抑制劑 LY294002 抑制 B16 和 A375 黑色素瘤細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲，并模擬青蒿素的作用
為了檢驗(yàn)抑制 PI3K/AKT 通路是否能模擬青蒿素的作用，作者使用了 PI3K/AKT 通路抑制劑 LY294002。MTT 檢測(cè)、劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell 實(shí)驗(yàn)表明，PI3K/AKT 通路抑制劑 LY294002 與青蒿素一樣抑制了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（圖 8A-F）。在另一種黑色素瘤細(xì)胞系 A375 中也獲得了類似的結(jié)果（圖 8G-L）。這些結(jié)果表明，PI3K/AKT 通路是體外抑制黑色素瘤細(xì)胞系 A375 和 B16 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
圖 8 PI3K/AKT 抑制劑 LY294002 降低 B16 和 A375 黑色素瘤細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲能力
9、AKT 激活劑減弱青蒿素在 B16 和 A375 黑色素瘤細(xì)胞系中的抗增殖、抗遷移和抗侵襲作用
作者還使用 AKT 激活劑 SC79 進(jìn)一步驗(yàn)證 AKT 在青蒿素體外抗癌作用中的作用，在 B16 和 A375 細(xì)胞系中均進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了三組細(xì)胞：陰性對(duì)照組（NC）、青蒿素組（Art）和青蒿素加 SC79 組（ART+SC79）。MTT 檢測(cè)、劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell 實(shí)驗(yàn)表明，青蒿素抑制了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而 AKT 激活劑減弱了青蒿素在 B16 細(xì)胞和 A375 細(xì)胞中的這些作用（圖 9）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了 Akt 在青蒿素對(duì) B16 和 A375 細(xì)胞系抗癌作用中的作用。
圖 9 AKT 激活劑 SC79 減弱青蒿素在 B16 和 A375 黑色素瘤細(xì)胞中的抗增殖、抗遷移和抗侵襲作用
10、c-KIT 過(guò)表達(dá)促進(jìn)黑色素瘤生長(zhǎng)，而 PI3K/AKT 抑制劑 LY294002 逆轉(zhuǎn)其作用
作者進(jìn)一步進(jìn)行了一系列挽救實(shí)驗(yàn)，以證明 B16 黑色素瘤細(xì)胞系中 c-KIT 與 PI3K/AKT 之間的調(diào)節(jié)關(guān)系。蛋白質(zhì)免疫印跡顯示，c-KIT 過(guò)表達(dá)顯著提高了 AKT 的磷酸化水平，而 LY294002 即使在 c-KIT 過(guò)表達(dá)的情況下也降低了 AKT 的磷酸化水平。然后，一系列體外實(shí)驗(yàn)表明，c-KIT 過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了黑色素瘤的增殖、遷移和侵襲，而 LY294002 逆轉(zhuǎn)了這些趨勢(shì)。這些結(jié)果證實(shí)，c-KIT 可以通過(guò) AKT 磷酸化調(diào)節(jié)黑色素瘤。
11、雙氫青蒿素和青蒿琥酯在癌癥根治術(shù)后抑制黑色素瘤體內(nèi)生長(zhǎng)
作者還檢測(cè)了兩種青蒿素衍生物雙氫青蒿素（DHA）和青蒿琥酯（AS）在癌癥根治術(shù)后對(duì)黑色素瘤的體內(nèi)抑制作用。與青蒿素的實(shí)驗(yàn)類似，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行相應(yīng)處理，并測(cè)量小鼠的黑色素瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和生存時(shí)間。圖 10A 顯示，DHA 和 AS 在 4 周內(nèi)顯著減小了復(fù)發(fā)性腫瘤的大小。AS 的治療效果更好（圖 10B）。圖 10C-D 顯示，DHA 和 AS 抑制了黑色素瘤的轉(zhuǎn)移。生存分析表明，DHA 和 AS 顯著延長(zhǎng)了術(shù)后模型中小鼠的生存時(shí)間（圖 10E）。MTT 檢測(cè)也證實(shí)了 AS 的體外作用，證明 AS 顯著抑制了 B16 細(xì)胞系的生長(zhǎng)（圖 10F）。
圖 10 雙氫青蒿素（DHA）和青蒿琥酯（AS）在癌癥根治術(shù)后體外和體內(nèi)抑制黑色素瘤生長(zhǎng)
作者進(jìn)一步比較了青蒿素及其衍生物在體內(nèi)外的治療效果和可能的副作用。此前，作者已經(jīng)分別證明了 ART、DHA 和 AS 在術(shù)后模型中的作用?，F(xiàn)在，作者在同一批小鼠模型中比較了它們對(duì)抑制復(fù)發(fā)性黑色素瘤的效果。同樣，所有藥物（包括 ART、DHA 和 AS）均以 40mg/kg 的劑量腹腔注射給術(shù)后小鼠，以 10% DMSO 作為陰性對(duì)照（NC）。與 NC 組相比，DHA 和 AS 呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，在抑制術(shù)后黑色素瘤復(fù)發(fā)方面比 ART 更顯著，但 ART 與 DHA/AS 之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后所有組小鼠體重變化均無(wú)顯著差異，這表明 ART 或其衍生物引起的副作用是可耐受的。體外 MTT 檢測(cè)顯示，與順鉑陽(yáng)性對(duì)照相比，DHA 和 AS 在 B16 細(xì)胞系中具有相似的抗增殖作用，且優(yōu)于 ART。另一方面，ART（200μM）和順鉑（100μM）聯(lián)合使用比單獨(dú)使用 ART 能進(jìn)一步抑制黑色素瘤生長(zhǎng)，這表明 ART 和順鉑之間存在協(xié)同作用。
12、青蒿素在癌癥根治術(shù)后抑制乳腺癌和肺癌體內(nèi)生長(zhǎng)
為了研究青蒿素在癌癥根治術(shù)后對(duì)其他癌癥的抗癌作用，作者在類似實(shí)驗(yàn)中使用了乳腺癌和肺癌模型。作者用 MB231 細(xì)胞系建立了乳腺癌術(shù)后腫瘤模型，用 A549 細(xì)胞系建立了肺癌術(shù)后腫瘤模型（圖 11A）。作者檢測(cè)了 MB231 誘導(dǎo)的腫瘤模型在術(shù)后 3 周不同組別的復(fù)發(fā)性腫瘤大小。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，青蒿素在 4 周內(nèi)顯著減小了復(fù)發(fā)性腫瘤的大?。▓D 11B）。在肺癌細(xì)胞系 A549 誘導(dǎo)的術(shù)后模型中也證實(shí)了類似的結(jié)果（圖 11C-D）。此外，體外 MTT 檢測(cè)也表明，青蒿素在體外抑制了 MB231 細(xì)胞系和 A549 細(xì)胞系的生長(zhǎng)（圖 11E-F）。
圖 11 青蒿素在體外和術(shù)后小鼠模型中也抑制乳腺癌和肺癌生長(zhǎng)
結(jié)論：
青蒿素可以抑制黑色素瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并延長(zhǎng)小鼠模型中癌癥根治手術(shù)后生存壽命。青蒿素通過(guò) c-KIT/PI3K/AKT 通路在體內(nèi)和體外發(fā)揮抗黑色素瘤作用，這支持了其在癌癥患者術(shù)后治療中的潛在治療效果。
實(shí)驗(yàn)方法：
RNA 測(cè)序、細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、MTT檢測(cè)、集落形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)、qRT - PCR、Western blot、HE 染色、小鼠皮下腫瘤模型及基于皮下腫瘤模型的術(shù)后腫瘤模型
參考文獻(xiàn)：
Zhou Z, Farhan M, Xing X, Zhou W, Lin R, Zeng S, Li M, Zheng W. Artemisinin Suppressed Melanoma Recurrence and Metastasis after Radical Surgery through the KIT/PI3K/AKT Pathway. Int J Biol Sci. 2025 Jan 1;21(1):75-94. doi: 10.7150/ijbs.97341. PMID: 39744440; PMCID: PMC11667813.