揭示卵巢癌耐藥之謎—組蛋白乳酸化與超級(jí)增強(qiáng)子

         卵巢癌是一種具有最高復(fù)發(fā)率和死亡率的婦科惡性腫瘤。盡管尼拉帕利可以有效影響其進(jìn)展，但藥物耐藥性的挑戰(zhàn)仍然存在。在此，我們構(gòu)建了尼拉帕利耐藥的卵巢癌細(xì)胞系，通過RNA原位構(gòu)象測(cè)序識(shí)別異常激活的增強(qiáng)子和相關(guān)靶基因。值得注意的是，靶基因RAD23A在尼拉帕利耐藥細(xì)胞中顯著上調(diào)，抑制RAD23A恢復(fù)了它們的敏感性。此外，尼拉帕利耐藥細(xì)胞中糖酵解的異常激活誘導(dǎo)了乳酸積累，促進(jìn)了組蛋白H4K12賴氨酸殘基的乳酸化。相關(guān)性分析顯示，關(guān)鍵的糖酵解酶如丙酮酸激酶M和乳酸脫氫酶A在卵巢癌中與RAD23A表達(dá)顯著正相關(guān)。此外，H4K12la通過MYC轉(zhuǎn)錄因子激活了尼拉帕利和RAD23A表達(dá)的超增強(qiáng)子（SE），從而增強(qiáng)了DNA損傷修復(fù)能力，促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的藥物耐藥性?？偟膩碚f，本研究的結(jié)果表明，乳酸積累導(dǎo)致組蛋白H4K12la的乳酸化，從而上調(diào)SE介導(dǎo)的異常RAD23A表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)尼拉帕利的耐藥性，提示RAD23A可能是尼拉帕利耐藥卵巢癌的潛在治療靶點(diǎn)。本文于2025年3月發(fā)表于“Molecular Cancer”（IF=27.7）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）尼拉帕利耐藥卵巢癌細(xì)胞中超增強(qiáng)子與靶基因啟動(dòng)子之間的相互作用圖譜

         為了獲得與卵巢癌尼拉帕利耐藥相關(guān)的超增強(qiáng)子（SEs）及其靶基因之間的相互作用圖譜，我們使用卡鉑（10 μM）處理A2780/Nira和HO8910/Nira細(xì)胞48小時(shí)來模擬藥物誘導(dǎo)的DNA損傷，然后通過藥物濃度梯度法誘導(dǎo)尼拉帕利耐藥性（圖1A）。CCK-8實(shí)驗(yàn)揭示了尼拉帕利的IC50值（圖1B–E）。將A2780/Nira和HO8910/Nira細(xì)胞的RIC-seq數(shù)據(jù)與公共增強(qiáng)子數(shù)據(jù)相結(jié)合，獲得了與尼拉帕利耐藥性相關(guān)的SEs及其靶基因之間的相互作用圖譜（圖1F）。RIC-seq測(cè)序檢測(cè)到SE區(qū)域在chr19:13004808–13,072,187（命名為Nira-SE）與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域頻繁相互作用，包括RAD23A、RNU2-2P、WDR74和RP11-424C20.2。其中，Nira-SE與RAD23A啟動(dòng)子區(qū)域的相互作用最為顯著（圖1G）。

2）靶向RAD23A逆轉(zhuǎn)了卵巢癌對(duì)尼拉帕利的耐藥性

         為了闡明RAD23A在卵巢癌尼拉帕利耐藥性中的作用，分析了卵巢癌細(xì)胞系A2780、A2780/Nira、HO8910和HO8910/Nira中RAD23A的表達(dá)。值得注意的是，尼拉帕利耐藥細(xì)胞中的RAD23A mRNA和蛋白質(zhì)水平高于非耐藥細(xì)胞（圖1HJ）。對(duì)GSE40595、GSE66957數(shù)據(jù)集和GEPIA2網(wǎng)站的分析顯示，RAD23A在卵巢癌組織中的表達(dá)增加（圖1K），并且KMplot生存分析和GEPIA2數(shù)據(jù)集將RAD23A的高表達(dá)與卵巢癌的不良預(yù)后相關(guān)聯(lián)（圖1L）。為了評(píng)估RAD23A在尼拉帕利耐藥卵巢癌細(xì)胞中的功能，我們轉(zhuǎn)染了siRAD23A來敲減RAD23A的表達(dá)（圖2A和B）。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，敲減RAD23A增加了卵巢癌細(xì)胞對(duì)尼拉帕利的敏感性（圖2C和D）。此外，集落形成和EdU實(shí)驗(yàn)揭示，尼拉帕利耐藥細(xì)胞的增殖能力在RAD23A敲減后顯著降低（圖2E和F）。另外，RAD23A的過表達(dá)在預(yù)先用鉑類藥物處理的A2780和HO8910細(xì)胞中增加了尼拉帕利耐藥性和細(xì)胞增殖能力（圖2G-J）。構(gòu)建了尼拉帕利耐藥細(xì)胞的異種移植腫瘤模型和來自卵巢癌患者的類器官模型，以驗(yàn)證RAD23A的體內(nèi)治療效果。值得注意的是，與siNC組相比，siRAD23A組在皮下腫瘤形成方面表現(xiàn)出顯著的抑制作用；siRAD23A與尼拉帕利聯(lián)合治療組在皮下腫瘤形成方面的抑制作用顯著高于siNC+尼拉帕利組（圖2K）。同樣，對(duì)類器官的分析顯示，與siNC組相比，siRAD23A組在類器官生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出顯著的抑制作用；siRAD23A與尼拉帕利聯(lián)合治療組在類器官生長(zhǎng)方面的抑制作用也顯著高于siNC+尼拉帕利組（圖2L和M）。

3）RAD23A通過調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)參與卵巢癌的尼拉帕利耐藥

         RAD23A是NER途徑的重要組分，能夠修復(fù)由紫外線輻射和化學(xué)藥物等多種因素引起的DNA損傷。因此，在尼拉帕利耐藥卵巢癌細(xì)胞中評(píng)估了其修復(fù)DNA損傷的能力。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，RAD23A的過表達(dá)可以減少預(yù)先用鉑類藥物處理的A2780和HO8910細(xì)胞中γ-H2AX的表達(dá)，γ-H2AX是雙鏈DNA損傷的標(biāo)志物（圖3A-B）。此外，彗星實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了RAD23A過表達(dá)后DNA損傷程度的降低，這表明RAD23A高水平可以增加DNA損傷修復(fù)（圖3C-D）。此外，下調(diào)RAD23A顯著增加了DNA損傷（圖3E-H）。類似地，小鼠異種移植腫瘤組織的免疫組化結(jié)果顯示，siRAD23A+尼拉帕利組在γ-H2AX表達(dá)上出現(xiàn)了顯著增加（圖3I）。這些結(jié)果提示，RAD23A通過調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)參與卵巢癌對(duì)尼拉帕利的耐藥性。

4）阻斷超增強(qiáng)子逆轉(zhuǎn)了卵巢癌對(duì)尼拉帕利的耐藥性

         為了闡明RAD23A在卵巢癌化療耐藥性中的表觀遺傳重塑機(jī)制，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。值得注意的是，在FANTOM5門戶網(wǎng)站上，Nira-SE區(qū)域鑒定出了兩個(gè)增強(qiáng)子，分別命名為E1（chr19:13023589–13,024,232）和E2（chr19:13048278–13,048,689）（圖4A）。接下來，利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除了E1和E2（圖4B和C），以評(píng)估它們對(duì)RAD23A轉(zhuǎn)錄活性的影響。qPCR和western blotting的結(jié)果顯示，敲除E1或E2中的任何一個(gè)都顯著降低了RAD23A的表達(dá)，而在E1和E2聯(lián)合敲除后，RAD23A的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)（圖4D和E）。為了評(píng)估阻斷Nira-SE對(duì)卵巢癌尼拉帕利耐藥性的影響，特別在A2780/Nira和HO8910/Nira細(xì)胞中敲除了E1和E2。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，敲除E1或E2增加了耐藥細(xì)胞對(duì)尼拉帕利的敏感性（圖4F和G）。此外，集落形成和EdU實(shí)驗(yàn)表明，敲除E1或E2后，尼拉帕利耐藥細(xì)胞的增殖能力顯著降低（圖4H和I）。此外，敲除E1或E2后，γ-H2AX的表達(dá)顯著增加（圖4J），DNA損傷程度加?。▓D4K）。

5）Nira-SE促進(jìn)致癌TF MYC向啟動(dòng)子的募集

         TFs介導(dǎo)SE調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并以基因特異性的方式啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。因此，通過交叉比對(duì)JASPAR、PROMO、Cistrome和ENCODE數(shù)據(jù)庫的預(yù)測(cè)結(jié)果，識(shí)別了與RAD23A相關(guān)的TFs。總共鑒定出了七個(gè)TFs，分別是YY1、USF2、MYC、E2F1、RELA、GATA1和USF1（圖5A），并驗(yàn)證了它們?cè)诼殉舶┲械淖饔?。值得注意的是，敲減MYC顯著降低了RAD23A的mRNA水平（圖5B和C）和蛋白質(zhì)水平（圖5D–F）。ChIP-qPCR分析顯示，MYC富集于A2780和HO8910細(xì)胞的RAD23A啟動(dòng)子（圖5G和H）、增強(qiáng)子E1和E2區(qū)（圖5I和J），且在其相對(duì)耐尼帕尼細(xì)胞（圖5K-M）中富集更為顯著，表明MYC是參與耐尼帕尼卵巢癌中RAD23A轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵TF。接下來，評(píng)估了SEs對(duì)MYC介導(dǎo)的RAD23A基因轉(zhuǎn)錄激活的影響。ChIP-qPCR分析顯示，在E1和E2敲除后，MYC在RAD23A啟動(dòng)子區(qū)域的富集顯著減少（圖5N），表明E1和E2敲除有效地抑制了MYC在RAD23A啟動(dòng)子區(qū)域的富集，從而影響了其轉(zhuǎn)錄活性。

6）在尼拉帕利耐藥的卵巢癌細(xì)胞中糖酵解過程顯著激活

         糖酵解可以驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展和藥物耐藥性。因此，本研究評(píng)估了糖酵解和組蛋白乳酸化在卵巢癌獲得尼拉帕利耐藥性過程中RAD23A超增強(qiáng)子的形成和激活中的作用。因此，檢測(cè)了尼拉帕利耐藥細(xì)胞的糖酵解指標(biāo)，包括耗氧率（OCR）、細(xì)胞外酸化率（ECAR）和乳酸生成。值得注意的是，與非耐藥細(xì)胞相比，A2780/Nira和HO8910/Nira細(xì)胞的OCR顯著降低（圖6A），而ECAR增加（圖6B）；耐藥細(xì)胞的乳酸產(chǎn)生顯著增加（圖6C）。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)顯示，敲減糖酵解相關(guān)關(guān)鍵酶丙酮酸激酶M（PKM）或乳酸脫氫酶A（LDHA）顯著提高了它們對(duì)尼拉帕利的敏感性（圖6D），抑制了尼拉帕利耐藥細(xì)胞的增殖（圖6E），并增加了DNA損傷水平（圖6F）。相反，添加外源性乳酸增強(qiáng)了卵巢癌細(xì)胞的增殖和尼拉帕利耐藥性，并降低了DNA損傷水平。

7）組蛋白乳酸化促進(jìn)RAD23A的表達(dá)

         盡管耐藥細(xì)胞中糖酵解的激活導(dǎo)致乳酸積累，但其對(duì)RAD23A基因表達(dá)的影響尚不清楚。因此，在GEPIA2和ICGC數(shù)據(jù)集中分析了己糖激酶2、PKM、LDHA與RAD23A的表達(dá)相關(guān)性。值得注意的是，PKM、LDHA和RAD23A的表達(dá)呈正相關(guān)（圖7A和B），并且在卵巢癌組織中PKM和LDHA的表達(dá)顯著增加（圖7C）。為了闡明糖酵解途徑通過組蛋白乳酸化對(duì)RAD23A轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的調(diào)控作用，使用了一種泛乳酸化抗體來檢測(cè)乳酸化的整體水平。值得注意的是，尼拉帕利耐藥細(xì)胞中組蛋白位置的乳酸化水平顯著增加（圖7D），在添加外源性乳酸（乳酸鈉，Nala）后，乳酸化水平進(jìn)一步增加，同時(shí)RAD23A的表達(dá)也增加（圖7E-F）。相反，當(dāng)卵巢癌細(xì)胞用糖酵解抑制劑2-DG處理時(shí)，組蛋白乳酸化和RAD23A的表達(dá)顯著降低（圖7G）。在耐藥細(xì)胞中敲減PKM或LDHA顯著降低了RAD23A的mRNA和蛋白質(zhì)水平，而添加外源性乳酸恢復(fù)了RAD23A的表達(dá)（圖7H和I）。

8）組蛋白H4K12la通過激活Nira-SE促進(jìn)RAD23A的轉(zhuǎn)錄

         為了驗(yàn)證組蛋白修飾位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，檢測(cè)了尼拉帕利耐藥細(xì)胞中四種核心組蛋白（即H2A、H2B、H3和H4）的乳酸化情況。CO-IP結(jié)果顯示，尼拉帕利耐藥細(xì)胞中H4的乳酸化顯著增加（圖8A-B）。此外，在H4中識(shí)別出了多種常見的乳酸化賴氨酸殘基位點(diǎn)，包括H4K5la、H4K8la、H4K12la和H4K16la。值得注意的是，H4K12la在耐藥細(xì)胞中的增加最為顯著（圖8C-D）。同樣，外源性乳酸和2-DG分別顯著增加了和降低了H4K12la的水平（圖8E-F）。此外，在耐藥細(xì)胞中敲減PKM或LDHA導(dǎo)致H4K12la水平下降，而外源性乳酸逆轉(zhuǎn)了這一效果（圖8G-H）。這些結(jié)果表明，H4K12la乳酸化是調(diào)控尼拉帕利耐藥卵巢癌細(xì)胞的關(guān)鍵組蛋白修飾位點(diǎn)。

結(jié)論：

         本研究闡明了糖酵解和組蛋白乳酸化在調(diào)節(jié)卵巢癌尼拉帕利耐藥中基因表達(dá)的機(jī)制，提示NER途徑相關(guān)的RAD23A作為解決卵巢癌尼拉帕利耐藥的新治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法：

         異種移植腫瘤實(shí)驗(yàn)，CRISPR-cas9技術(shù)，CCK-8，EdU，集落形成試驗(yàn)，免疫熒光，彗星試驗(yàn)，qPCR，Western blotting，CO-IP，ChIP，RIC-seq

參考文獻(xiàn)：

         Lu B, Chen S, Guan X, Chen X, Du Y, Yuan J, Wang J, Wu Q, Zhou L, Huang X, Zhao Y. Lactate accumulation induces H4K12la to activate super-enhancer-driven RAD23A expression and promote niraparib resistance in ovarian cancer. Mol Cancer. 2025 Mar 19;24(1):83. doi: 10.1186/s12943-025-02295-w