ZNF460介導(dǎo)的circRPPH1促進(jìn)TNBC進(jìn)展

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2024-12-03
ZNF460可以促進(jìn)circRPPH1的表達(dá),circRPPH1/miR326/ITGA5軸可以激活FAK/PI3K/AKT通路,促進(jìn)三陰性乳腺癌的進(jìn)展......

 

         環(huán)狀RNA是高度穩(wěn)定的調(diào)控RNA,與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)系日益密切。然而,許多環(huán)狀RNA在三陰性乳腺癌(TNBC)中的作用及其相關(guān)機(jī)制尚未闡明。TNBCcircRPPH1的上調(diào)與不良預(yù)后呈正相關(guān)。此外,在體內(nèi)和體外,circRPPH1都促進(jìn)了TNBC細(xì)胞的生物學(xué)惡性行為。此外,circRPPH1可能作為miR-326的分子海綿,控制ITGA5的表達(dá),激活FAK/PI3K/AKT通路。我們的研究表明,ZNF460可以促進(jìn)circRPPH1的表達(dá),circRPPH1/miR326/ITGA5軸可以激活FAK/PI3K/AKT通路,促進(jìn)TNBC的進(jìn)展。因此,circRPPH1可作為TNBC的治療或診斷靶點(diǎn)。本文于20242月發(fā)表于“Molecular Cancer”IF=37.3)上。

技術(shù)路線

結(jié)果:

1circRPPH1的鑒定及臨床特征

         我們通過檢查來自GSE101123數(shù)據(jù)集的TNBC組織和正常乳腺組織的RNA測(cè)序陣列,篩選出了20個(gè)表達(dá)變化最顯著的circRNAs。在鑒定的circRNAs中,hsa_circRNA_000166TNBC之間的關(guān)系尚不清楚。本文將重點(diǎn)研究其在TNBC中的生物學(xué)活性及其相關(guān)機(jī)制。Hsa_circRNA_000166(本研究中簡(jiǎn)稱circRPPH1)是由RPPH1基因編碼的mRNA通過反向剪接產(chǎn)生的,Sanger測(cè)序證實(shí)了其反向剪接位點(diǎn)的存在(1A)。然后,我們通過qRT-PCR驗(yàn)證,與MCF10A細(xì)胞相比,SUM1315MDA-MB-231細(xì)胞中的circRPPH1表達(dá)明顯上調(diào)(1B)。為了驗(yàn)證circRPPH1是一個(gè)環(huán)狀的頭尾連接,我們從TNBC細(xì)胞中提取cDNAgDNA,然后使用收斂引物和發(fā)散引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,circRPPH1可以利用發(fā)散引物從cDNA擴(kuò)增。這表明circRPPH1是一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu),是由頭尾連接的轉(zhuǎn)錄后剪切產(chǎn)生的(1C)。RNase R分析表明,circRPPH1比親本基因和GAPDH表現(xiàn)出更高的降解抗性。這表明circRPPH1是一種比線性RNA更穩(wěn)定的環(huán)狀RNA(1DE)。核細(xì)胞質(zhì)分離和FISH檢測(cè)顯示circRPPH1主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,平均熒光強(qiáng)度顯示TNBC組織比正常乳腺組織表達(dá)更多的circRPPH1(1F-H)。為了探索circRPPH1的應(yīng)用價(jià)值,我們檢測(cè)到TNBC組織中circRPPH1的表達(dá)增加(1I)。ROC曲線顯示,特異性為0.8,敏感性為0.567,曲線下面積為0.705(1J)。我們隨后根據(jù)TNBC患者隨訪數(shù)據(jù)繪制了Kaplan-Meier生存曲線,結(jié)果顯示circRPPH1高表達(dá)患者的總生存期比circRPPH1低表達(dá)患者短(1K)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn),circRPPH1可以用于診斷和預(yù)后。

2ZNF460增加了RPPH1circRPPH1的表達(dá)

         為了探究是否存在影響RPPH1circRPPH1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,我們通過NCBI查找了RPPH1啟動(dòng)子可能的序列,發(fā)現(xiàn)了3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子ZNF460RPPH1啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)。我們假設(shè)ZNF460可能影響RPPH1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。為了進(jìn)一步研究ZNF460的作用,我們?cè)O(shè)計(jì)了ZNF460過表達(dá)載體(pcDNA3.1-ZNF460)、敲低載體(sh1-ZNF460、sh2-ZNF460、sh3-ZNF460)和相應(yīng)的陰性對(duì)照載體,并通過qRT-PCR驗(yàn)證了它們的有效表達(dá)(2AB)。轉(zhuǎn)染sh1-ZNF460后,RPPH1TNBC細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低。但轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體pcDNA3.1-ZNF460后,RPPH1TNBC細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高(2CD)。根據(jù)ZNF460RPPH1啟動(dòng)子的結(jié)合序列,我們構(gòu)建了帶有野生型或突變型RPPH1啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(2EF)。研究結(jié)果顯示,ZNF460增強(qiáng)了野生型RPPH1啟動(dòng)子質(zhì)粒的熒光素酶活性,而突變型質(zhì)粒則保持不變(2GH)。ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示,與陰性對(duì)照IgG相比,ZNF460RPPH1啟動(dòng)子結(jié)合(2I)。最后,我們通過RT-qPCR驗(yàn)證,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ZNF460后,TNBC細(xì)胞內(nèi)circRPPH1表達(dá)升高,而轉(zhuǎn)染sh1-ZNF460后,circRPPH1表達(dá)降低(2J)。根據(jù)上述發(fā)現(xiàn),ZNF460可能附著在RPPH1啟動(dòng)子區(qū)域,從而調(diào)控其和circRPPH1的表達(dá)。

3CircRPPH1促進(jìn)TNBC細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲

         我們通過集落形成實(shí)驗(yàn)、EdUCCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了circRPPH1的敲低抑制了TNBC細(xì)胞的增殖,而circRPPH1的過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞增殖(3A-D)。此外,Transwell和傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明,干擾circRPPH1可降低TNBC細(xì)胞的遷移和侵襲能力,而過表達(dá)circRPPH1則相反(3EF)。根據(jù)上述發(fā)現(xiàn),circRPPH1TNBC細(xì)胞中發(fā)揮了促癌作用。

4CircRPPH1促進(jìn)TNBC細(xì)胞EMT,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞凋亡

         考慮到EMT機(jī)制也有助于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移,我們利用免疫熒光法來確定相關(guān)蛋白的水平。我們的研究結(jié)果顯示,沉默circRPPH1后,TNBC細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)增加,而N-cadherinvimentin表達(dá)減少(4A)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果與IF實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(4B)。接下來,我們使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期,我們的數(shù)據(jù)顯示,沉默circRPPH1后,TNBC細(xì)胞處于G1期的比例增加,處于S期的比例減少(4C)。我們還通過Western blot檢測(cè)到沉默circRPPH1后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)減少(4D)。這表明沉默circRPPH1后細(xì)胞周期被阻斷。之后,我們進(jìn)行Annexin V/PI染色流式細(xì)胞術(shù)研究,發(fā)現(xiàn)敲低circRPPH1顯著提高了細(xì)胞的早期凋亡率(4E)。同樣,我們使用Western blot發(fā)現(xiàn),敲低circRPPH1后,Bcl-2表達(dá)降低,而cleaved caspase-3Bax表達(dá)升高(4F)。此外,免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,敲低circRPPH1caspase-3表達(dá)增加(4G)。綜上所述,circRPPH1TNBC細(xì)胞中具有促進(jìn)EMT、加速細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能。

5CircRPPH1通過直接結(jié)合miR-326起到分子海綿的作用

         為了進(jìn)一步了解circRPPH1TNBC中的功能,我們使用ENCORI數(shù)據(jù)庫和CircInteractome數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)hsa-miR-330-5phsa-miR-326可能與circRPPH1相互作用(5A)。我們檢測(cè)到TNBC細(xì)胞中miR-326miR-330-5p表達(dá)下調(diào)和上調(diào)(5B)。同樣,miR-326TNBC組織中的表達(dá)明顯降低(5C)。根據(jù)Kaplan-Meier生存分析(5D),miR-326表達(dá)較高的患者總生存時(shí)間也更長(zhǎng)。通過Pearson相關(guān)分析,我們發(fā)現(xiàn)TNBC組織中circRPPH1的表達(dá)水平與hsa-miR-326呈負(fù)相關(guān)(5E)。因此,我們預(yù)測(cè)circRPPH1可以在TNBC中與miR-326結(jié)合,從而發(fā)揮分子海綿的作用。我們驗(yàn)證了circRPPH1敲低或過表達(dá)對(duì)miR-326表達(dá)的影響。結(jié)果表明,circRPPH1過表達(dá)會(huì)降低miR-326的表達(dá),而circRPPH1敲低則會(huì)產(chǎn)生相反的效果(5FG)。根據(jù)ENCORI數(shù)據(jù)庫的circMIR軟件,我們根據(jù)circRPPH1miR-326結(jié)合得分最高的區(qū)域,創(chuàng)建了具有野生型和突變型circRPPH1序列的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。miR-326模擬物降低野生型質(zhì)粒的熒光素酶活性(5H和圖I)。根據(jù)FISH檢測(cè)(5JK),CircRPPH1miR-326主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。此外,我們使用生物素標(biāo)記的circRPPH1探針在TNBC細(xì)胞中進(jìn)行了RNA pull-down實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示生物素標(biāo)記的circRPPH1探針組中circRPPH1miR-326的富集量大幅增加(5LM)。綜上所述,circRPPH1可能起到分子海綿的作用,直接與miR-326結(jié)合。

6MiR-326部分逆轉(zhuǎn)了circRPPH1的促腫瘤作用

         為了進(jìn)一步了解miR-326circRPPH1如何相互作用,我們使用miR-326模擬物或抑制物與si-circ或過表達(dá)載體circRPPH1進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)。集落形成、EdUCCK-8檢測(cè)表明,miR-326模擬物阻斷了circRPPH1過表達(dá)對(duì)TNBC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,而miR-326抑制劑恢復(fù)了circRPPH1敲低對(duì)TNBC細(xì)胞增殖的影響(6A-E)。此外,關(guān)于miR-326對(duì)TNBC細(xì)胞侵襲和遷移的影響,我們發(fā)現(xiàn)miR-326模擬物可以抑制過表達(dá)circRPPH1對(duì)其的促進(jìn)作用,而miR326抑制劑可以部分逆轉(zhuǎn)敲低circRPPH1對(duì)其的抑制作用(6F-I)。上述實(shí)驗(yàn)表明,miR-326作為一種致癌因子,可以抵消circRPPH1的促癌活性。

7CircRPPH1通過miR-326/ITGA5軸刺激FAK/PI3K/AKT通路

         為了完善circRPPH1/miR-326軸并探索其下游調(diào)控機(jī)制,我們利用miRTarBase數(shù)據(jù)庫、miRBD數(shù)據(jù)庫和TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)ITGA5可能是miR-326的下游基因。通過Western blotqRT-PCR,我們能夠證明miR-326模擬轉(zhuǎn)染SUM1315細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞可降低ITGA5的表達(dá)而當(dāng)使用miR-326抑制劑時(shí),ITGA5的表達(dá)增加(7AB)。為了證實(shí)ITGA5miR-326之間的相互作用,我們創(chuàng)建了具有野生型和突變型ITGA5 3 ' UTR的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。根據(jù)研究結(jié)果,轉(zhuǎn)染miR326模擬物顯著降低了野生型質(zhì)粒的熒光素酶活性,但對(duì)突變型質(zhì)粒沒有顯著影響(7CD)。我們隨后證實(shí)ITGA5TNBC組織中上調(diào)(7E)。Pearson相關(guān)研究顯示circRPPH1ITGA5呈正相關(guān),但miR-326ITGA5表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(7F)。然后,我們?cè)谇玫突蜻^表達(dá)circRPPH1后檢測(cè)ITGA5的表達(dá)。研究結(jié)果表明,circRPPH1過表達(dá)可改善ITGA5的表達(dá),而敲低后結(jié)果則相反(7G)。隨后,我們通過拯救實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-326模擬物或抑制劑可以撤銷circRPPH1過表達(dá)或敲低導(dǎo)致的ITGA5表達(dá)的改變(7H)。根據(jù)KEGG通路分析,ITGA5PI3K/AKT通路的相關(guān)基因。因此,我們分析了TNBC細(xì)胞中circRPPH1上調(diào)或下調(diào)后ITGA5及其下游基因的表達(dá)情況。在TNBC細(xì)胞系中,我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circRPPH1可顯著增加ITGA5、p-FAK、p-PI3Kp-AKT的表達(dá),而轉(zhuǎn)染si-circRPPH1則具有相反的效果。此外,miR-326模擬物或抑制劑可能會(huì)抵消這些作用(7I-K)。這些發(fā)現(xiàn)表明,miR-326/ITGA5軸介導(dǎo)的circRPPH1激活FAK/ PI3K/AKT通路可促進(jìn)TNBC細(xì)胞的侵襲性。

8CircRPPH1促進(jìn)TNBC細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

         我們構(gòu)建了穩(wěn)定敲低或過表達(dá)circRPPH1TNBC細(xì)胞系,以驗(yàn)證circRPPH1在體內(nèi)的生物學(xué)功能。然后,我們將上述細(xì)胞系皮下注射到裸鼠體內(nèi),觀察腫瘤的生長(zhǎng)和大小。與對(duì)照組相比,circRPPH1敲低組的腫瘤大小和重量顯著減小,而過表達(dá)circRPPH1后結(jié)果相反(8A-C)。我們將感染熒光素酶質(zhì)粒的TNBC細(xì)胞注射到裸鼠尾靜脈,研究circRPPH1對(duì)轉(zhuǎn)移的影響。生物發(fā)光成像和H&E染色分析顯示,circRPPH1敲低后,肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小顯著減少,而circRPPH1過表達(dá)的影響則相反(8D-G)。以上結(jié)果提示,在體內(nèi),circRPPH1誘導(dǎo)ITGA5促進(jìn)TNBC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

結(jié)論:

         我們發(fā)現(xiàn)了一種名為circRPPH1的新circRNA,它在TNBC中過表達(dá),預(yù)示著預(yù)后不良。機(jī)制上,circRPPH1可以結(jié)合miR-326控制ITGA5的表達(dá),激活FAK/PI3K/AKT通路,導(dǎo)致TNBC的發(fā)展。因此,circRPPH1可能為TNBC提供有用的診斷工具和潛在的治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法:

         qRT-PCRWestern blot,FISH,雙熒光素酶報(bào)告分析,EdU,CCK-8

參考文獻(xiàn):

         Zhang C, Yu Z, Yang S, Liu Y, Song J, Mao J, Li M, Zhao Y. ZNF460-mediated circRPPH1 promotes TNBC progression through ITGA5-induced FAK/PI3K/AKT activation in a ceRNA manner. Mol Cancer. 2024 Feb 14;23(1):33. doi: 10.1186/s12943-024-01944-w.