乳腺癌的Notch轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記的鑒定

失調(diào)的Notch信號是乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的原因之一，但目前還缺乏有效的工具來測量乳腺癌亞型中的Notch信號水平以及對全身治療的反應(yīng)。有必要建立 Notch 信號的轉(zhuǎn)錄組特征，例如用于監(jiān)測未來 Notch 靶向療法的效果，以及了解 Notch 信號的改變是否是當(dāng)前乳腺癌療法的脫靶效應(yīng)。在本報(bào)告中，作者選出了一個(gè)最佳的 20 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄組特征。在兩個(gè)獨(dú)立的患者數(shù)據(jù)集（METABRIC 和 Oslo2）上對該特征進(jìn)行了驗(yàn)證，與之前發(fā)表的特征相比，它的一致性得分和腫瘤特異性都有所提高。此外，基底樣乳腺癌的特征得分特別高，表明這種亞型的 Notch 信號水平更高。在 PROMIX 和 BEAUTY 患者隊(duì)列中，經(jīng)過新輔助治療后，特征得分有所提高，較低的特征得分通常與較好的臨床預(yù)后相關(guān)?？傊?，本研究建立的20 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄特征將成為評估未來乳腺癌 Notch 靶向療法反應(yīng)、了解傳統(tǒng)乳腺癌療法對 Notch 信號的潛在影響以及更好地對患者進(jìn)行治療分層的重要工具。本文于2024年1月發(fā)表在《Breast Cancer Research》IF:7.4期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、一種鑒定Notch轉(zhuǎn)錄組特征候選基因的試驗(yàn)

為確定乳腺癌的Notch轉(zhuǎn)錄特征，首先確定了在乳腺癌背景下由Notch信號調(diào)節(jié)的基因。為此，對表達(dá)Notch信號的6個(gè)基底樣乳腺癌細(xì)胞系中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。這些細(xì)胞系進(jìn)行Notch信號激活（Jagged1誘導(dǎo)）和Notch信號阻斷（DAPT誘導(dǎo)）處理，DMSO處理細(xì)胞作為“ground state”對照（圖1B）。在激活/抑制后8和72小時(shí)，對6個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，以捕獲由Notch調(diào)節(jié)引起的即時(shí)以及更長期的基因表達(dá)差異（圖1B）。抑制或阻斷效率通過qPCR檢測經(jīng)典Notch靶基因HES1和NRARP的表達(dá)驗(yàn)證。結(jié)果顯示在分析的6個(gè)細(xì)胞系中，在8和/或72 h后，每個(gè)細(xì)胞系中至少有一個(gè)已建立的Notch靶基因HES1和NRARP出現(xiàn)預(yù)期的上調(diào)和下調(diào)（圖1C），表明實(shí)驗(yàn)有效。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的PCA中，細(xì)胞系彼此明顯聚集， Notch信號的激活或阻斷并沒有重置整個(gè)轉(zhuǎn)錄組景觀，而是誘導(dǎo)了更微妙的差異（圖1D）。因此，變異的主要來源是細(xì)胞系之間的轉(zhuǎn)錄組差異，其次是處理時(shí)間，而Notch調(diào)節(jié)的影響較小，與主成分6、7和10顯著相關(guān)，分別占數(shù)據(jù)集中總方差的3.5%、2.1%和0.5%（圖1E）?？傊髡咭呀?jīng)建立了一種檢測方法，能夠識別基底樣乳腺癌細(xì)胞系中Notch誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組差異，并建立Notch標(biāo)記的候選基因。

圖1 在基底樣乳腺癌細(xì)胞系中鑒定Notch調(diào)節(jié)基因的試驗(yàn)

2、鑒定一個(gè)強(qiáng)大和連貫的20個(gè)基因轉(zhuǎn)錄組的Notch信號

利用Notch信號在8h和72h時(shí)間點(diǎn)的激活或阻斷數(shù)據(jù)集，在6個(gè)細(xì)胞系的所有可能條件和時(shí)間點(diǎn)之間搜索差異表達(dá)基因（DEGs）。由于Notch信號會導(dǎo)致下游基因表達(dá)的增加和減少，作者考慮不同實(shí)驗(yàn)點(diǎn)由上調(diào)或下調(diào)基因組成的DEG和潛在特征。在74個(gè)可能的比較中，作者只考慮了左偏P值分布和至少100個(gè)的DEGs的差異表達(dá)結(jié)果（圖2A），從而選擇了14個(gè)比較結(jié)果（圖2B）。

為確定最佳特征長度，作者計(jì)算了TCGA-BRCA患者隊(duì)列中候選比較中每個(gè)數(shù)目的基因的平均基因-基因相關(guān)性（一致性評分），作為訓(xùn)練隊(duì)列。在10 ~ 30個(gè)基因的范圍內(nèi)，根據(jù)最大的一致性評分和最小的經(jīng)驗(yàn)P值來選擇每個(gè)特征中的最優(yōu)基因數(shù)。該分析揭示了一致性評分> 0.2的三個(gè)特征：特征#5（15個(gè)基因）；特征#9：（17個(gè)基因）和特征# 11（20個(gè)基因）（圖2C）。選取這三個(gè)特征進(jìn)行進(jìn)一步分析。為進(jìn)一步探索這三個(gè)特征的準(zhǔn)確性和穩(wěn)健性，作者使用如上所述的相同的實(shí)驗(yàn)生成了一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，用于激活(Jagged1)和阻斷(DAPT) Notch信號，但這次來自19個(gè)乳腺癌細(xì)胞系，包括10個(gè)基底樣細(xì)胞系，三個(gè)來自Luminal A的細(xì)胞系，和6個(gè)HER2富集的乳腺癌細(xì)胞系（圖2D）。來自19個(gè)處于基態(tài)（即沒有Notch信號干擾）的細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組顯示，在PCA分析中，基底樣、Luminal A和her2富集細(xì)胞系根據(jù)腫瘤亞型明顯聚集（圖2E）。 對于6種基底樣細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組分析(圖1D)，與細(xì)胞系特異性差異相比，Notch信號升高或降低誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組差異較小（圖2E）。接下來，使用GSEA和ROC曲線分析來測試這三個(gè)特征在19個(gè)細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄組上的表現(xiàn)。特征#11來自Notch打開和Notch關(guān)閉的8h和72h時(shí)間點(diǎn)的上調(diào)DEG的交集，在三種不同條件下的GSEA分析中，它們的表現(xiàn)始終優(yōu)于特征#5和#9（圖2F）?？偟膩碚f，基于TCGA-BRCA患者數(shù)據(jù)集和獨(dú)立Notch信號調(diào)制細(xì)胞系數(shù)據(jù)集的訓(xùn)練數(shù)據(jù)的特征#11表現(xiàn)出最好的性能，因此被用于隨后的分析。

圖2 20個(gè)基因Notch轉(zhuǎn)錄組特征的鑒定

3、20個(gè)基因轉(zhuǎn)錄組Notch信號的性質(zhì)

選擇的轉(zhuǎn)錄組特征#11按順序包括以下20個(gè)基因：SEMA5B、NRARP、PLAT、PRELP、HEYL、FAT2、HEY1、KRT5、NPR3、KRT14、FLT1、RHOV、TNFRSF19、JAG1、MT1X、HEY2、PDGFRB、ZNF469、VSNL1和KIT（圖3A）。所有20個(gè)基因都含有至少一個(gè)CSL結(jié)合位點(diǎn)，位于啟動子區(qū)域，定義為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)上游的3000 bp和下游的500 bp（圖3B），其中17個(gè)基因（SEMA5B, NRARP, PRELP, HEYL, FAT2, HEY1, KRT5, NPR3, KRT14, FLT1, RHOV, TNFRSF19, JAG1, MT1X, HEY2, PDGFRB和ZNF469）先前已在ChIP-seq中使用來自不同模型的細(xì)胞系確定為CSL靶點(diǎn)。當(dāng)這些基因被繪制在一個(gè)KEGG圖網(wǎng)絡(luò)中時(shí)，標(biāo)記中的一些基因(JAG1, HEY1, HEY2和HEYL)與“乳腺癌”一詞相關(guān)，而同樣的四個(gè)基因加上PDGFRB和KIT與“癌癥途徑”一詞相關(guān)（圖3C）?？傊?，數(shù)據(jù)表明Notch信號中的20個(gè)基因可能代表Notch的直接下游基因，其中一些基因與不同的疾病相關(guān)，如乳腺癌或通路富集分析中的Notch。

圖3 20個(gè)基因的Notch轉(zhuǎn)錄組特征

4、將20個(gè)基因的Notch轉(zhuǎn)錄組特征與先前建立的特征進(jìn)行比較

通過計(jì)算一致性得分以及經(jīng)驗(yàn)P值來估計(jì)已發(fā)表特征的質(zhì)量。在 TCGA-BRCA、METABRIC 和 Oslo2 數(shù)據(jù)集中，57 個(gè)已分析的已發(fā)表特征中，分別有 9 個(gè)、4 個(gè)和 7 個(gè)特征的一致性得分大于 0.12。在 TCGA、METABRIC 和 Oslo2 數(shù)據(jù)集中，分別有 10 個(gè)、9 個(gè)和 6 個(gè)特征的調(diào)整后經(jīng)驗(yàn)p值小于 0.0001。Vilimas等人的 "NOTCH1靶向下 "特征顯示出比20個(gè)基因特征更高的一致性得分（TCGA-BRCA = 0.28，METABRIC = 0.19和Oslo2 = 0.22）（圖4A）。一個(gè)重要的問題是，腫瘤純度、基質(zhì)和免疫浸潤是否會對各種基因特征的性質(zhì)產(chǎn)生影響。為解決這個(gè)問題，使用ESTIMATE方法推斷了免疫和基質(zhì)含量。包括本文報(bào)告的 20 個(gè)基因特征在內(nèi)的大多數(shù)特征與 Immunescore 或 Stromalscore 沒有明顯的相關(guān)性，但 Vilimas 等人和 Klinakis 等人的特征與免疫浸潤高度相關(guān)，而其他兩個(gè)特征則與所有測試患者隊(duì)列中的基質(zhì)含量相關(guān)（圖4B）?？傊疚牡?span>20個(gè)基因特征在所有測試和驗(yàn)證步驟中得分都很好，并且在大多數(shù)情況下優(yōu)于先前描述的特征。

圖4 將20基因特征與先前建立的Notch簽名進(jìn)行比較

5、20個(gè)基因特征在基底樣乳腺癌細(xì)胞系和患者數(shù)據(jù)集中顯示出更高的評分

在患者和細(xì)胞系數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證了 20 個(gè)基因特征的一致性得分后，接下來利用該特征來了解不同的乳腺癌亞型是否具有不同水平的 Notch 信號。首先重新研究了代表基底樣、Luminal A 和 HER2 富集亞型的 19 個(gè)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組分析。在基底樣細(xì)胞系中，基底狀態(tài)下的絕對特征得分明顯更高（圖5A），在基底樣細(xì)胞系中，比較 "Notch開啟"和 "Notch關(guān)閉"條件下與ground state狀態(tài)下的相對特征得分差異顯著（圖5B）。此外，與ground state特征得分相比，相對特征得分在 "Notch開啟"條件下增加，而在 "Notch關(guān)閉"條件下減少（圖5C）。接下來，研究了三個(gè)患者數(shù)據(jù)集中 20 個(gè)基因特征的特征得分與 PAM50 分子亞型分類的關(guān)系。在 TCGA、METABRIC 和 Oslo2 數(shù)據(jù)集中，基底樣/TNBC 和正常型乳腺癌的平均特征得分最高，其次是 Luminal A 亞型，HER2 和 Luminal B 亞型的特征得分較低（圖5D）。總之，結(jié)果顯示基底樣亞型的特征得分較高。

圖5 不同亞型乳腺癌中20個(gè)基因特征的特征評分

6、利用PROMIX和BEAUTY隊(duì)列分析20個(gè)基因特征的乳腺癌治療反應(yīng)

為深入了解 Notch 信號水平是如何隨著乳腺癌治療反應(yīng)和治療結(jié)果而改變的，作者首先分析了 PROMIX 試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。在接受兩個(gè)周期的表柔比星和多西他賽治療后，有放射學(xué)證據(jù)顯示有殘留疾病的患者子集中，有配對活檢供轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，TNBC 患者組的特征得分（ssGSEA）在治療后增加（圖6A），Luminal B組有一定程度的升高，而Luminal A患者組無升高。此外，TNBC 患者的 Notch 特征基線（即治療開始前）最高（圖6A），這與圖5中的結(jié)果一致?；€Notch特征得分較低的患者比Notch特征得分較高的患者顯示出更好的無病生存期（DFS）趨勢（圖6B），Notch核心特征也是如此。與沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者在治療前原發(fā)腫瘤的特征得分較低（圖6C）。

圖6 PROMIX乳腺癌隊(duì)列中20個(gè)基因標(biāo)記評分分析

接下來，研究了前瞻性乳腺癌基因組指導(dǎo)治療研究（BEAUTY）中Notch信號對治療的響應(yīng)水平。通過GSVA評估，基線 TNBC 亞型的 20 個(gè)基因特征得分最高，其次是 Luminal A、HER2 + 和 Luminal B 亞型（圖7A）。比較基線和手術(shù)時(shí)的 GSVA，HER2+、Luminal A 和 Luminal B 患者的 GSVA 值增加，而 TNBC 組的 GSVA 值減少（圖7B）。在分析 TNBC 組治療應(yīng)答者與非應(yīng)答者治療前的 GSVA 特征評分時(shí)，非應(yīng)答者組在治療開始前的 GSVA 值更高（圖7C）。

綜合來看，PROMIX 和 BEAUTY 隊(duì)列的數(shù)據(jù)表明，TNBC 腫瘤在治療前的 Notch 信號水平較高，在某些情況下，化療可能會誘導(dǎo) Notch 信號的增加，盡管 TNBC 和 Luminal A 患者在這方面的結(jié)果在兩個(gè)隊(duì)列中有所不同。數(shù)據(jù)普遍表明，基線Notch信號的升高可能與預(yù)后有關(guān)，因?yàn)樵?span>PROMIX隊(duì)列中，Notch信號的升高與較差的無病生存期有關(guān)。此外，在BEAUTY隊(duì)列中，TNBC患者和NAC后殘留疾病患者在治療前腫瘤中的Notch信號得分較高。

圖7 BEAUTY乳腺癌隊(duì)列中20個(gè)基因特征評分分析

實(shí)驗(yàn)方法：

細(xì)胞培養(yǎng)，Notch信號的激活和阻斷，qRT-PCR，RNA測序，生物信息學(xué)分析，TCGA BRCA隊(duì)列中Notch突變狀態(tài)的特征評分分析，PROMIX和BEAUTY患者的研究

參考文獻(xiàn)：

Braune EB, Geist F, Tang X, Kalari K, Boughey J, Wang L, Leon-Ferre RA, D'Assoro AB, Ingle JN, Goetz MP, Kreis J, Wang K, Foukakis T, Seshire A, Wienke D, Lendahl U. Identification of a Notch transcriptomic signature for breast cancer. Breast Cancer Res. 2024 Jan 3;26(1):4. doi: 10.1186/s13058-023-01757-7.