眼黑色素瘤中組蛋白乳酸化和RNA的m1A甲基化修飾之間的調(diào)控機(jī)制

雖然N1-甲基腺苷（m1A）RNA修飾是RNA代謝的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，但m1A修飾在腫瘤發(fā)生中的作用仍是一個(gè)謎。本研究發(fā)現(xiàn)組蛋白乳酸化通過(guò)去除SP100A的m1A甲基化，增強(qiáng)了ALKBH3的表達(dá)，同時(shí)減弱了腫瘤抑制性早幼粒細(xì)胞白血病蛋白（PML）凝集物的形成，促進(jìn)了癌癥的惡性轉(zhuǎn)化。首先，ALKBH3在高危眼黑色素瘤中由于組蛋白的過(guò)度乳酸化水平而特異性上調(diào)，即m1A低甲基化狀態(tài)。此外，多組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PML體的核心成分SP100A是ALKBH3的下游候選靶點(diǎn)。在治療上，沉默ALKBH3在黑色素瘤的體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出高效的療效，而這種療效可通過(guò)消耗SP100A而逆轉(zhuǎn)。從機(jī)理上講，YTHDF1負(fù)責(zé)識(shí)別m1A甲基化的SP100A轉(zhuǎn)錄本，從而提高其RNA穩(wěn)定性和翻譯效力。最后，本文初步證明了m1A修飾是腫瘤抑制基因表達(dá)所必需的，從而拓展了目前對(duì)腫瘤進(jìn)展過(guò)程中m1A動(dòng)態(tài)功能的理解。此外，研究結(jié)果表明，乳酸化驅(qū)動(dòng)的ALKBH3對(duì)PML核凝聚體的形成至關(guān)重要，揭示了m1A修飾、代謝重編程和相分離事件之間的相互關(guān)系，從而為靶向m1A重編程高效治療腫瘤提供了一種新的治療方法。本文于2023年12月發(fā)表在《Nucleic Acids Research》，IF：14.9。

技術(shù)路線(xiàn)

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.ALKBH3在眼部黑色素瘤中特異性增高且與不良預(yù)后相關(guān)

為了確定m1A修飾在眼部黑色素瘤發(fā)病機(jī)制中的作用，首先比較了眼部黑色素瘤樣本（3個(gè)CoM樣本和3個(gè)UM樣本）和4個(gè)對(duì)照痣樣本的總體m1A修飾水平。值得注意的是，眼黑色素瘤樣本的m1A水平明顯降低，這一點(diǎn)已通過(guò)Diot blot檢測(cè)得到證實(shí)（圖1A-B）。此外，去甲基化酶ALKBH3在腫瘤中的蛋白表達(dá)也增加了（圖1C-E），這與眼黑色素瘤中m1A水平降低的發(fā)現(xiàn)一致。此外，ALKBH3的升高與不良預(yù)后有關(guān)（圖1F），這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了ALKBH3在眼部黑色素瘤癌變過(guò)程中的重要性。

一致的是，與正常色素細(xì)胞（PIG1）相比，大多數(shù)黑色素瘤細(xì)胞系（MUM2B、OCM1、OMM2.3、OMM1、MEL290、92.1、CRMM1、CRMM2、CM2005.1）的m1A水平顯著下降（圖1G和H），ALKBH3水平顯著升高（圖1I-K）。此外，高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)了ALKBH3在眼黑色素瘤細(xì)胞系中的上調(diào)（圖1L）。并且在這些細(xì)胞中，ALKBH3與m1A水平呈顯著負(fù)相關(guān)，表明ALKBH3上調(diào)是m1A水平降低的原因（圖1M）。

圖一：眼部黑色素瘤的ALKBH3表達(dá)增加和m1A水平降低與存活率低有關(guān)

2.ALKBH3在體外和體內(nèi)加速眼黑色素瘤的形成

為了探索ALKBH3的致癌功能，使用兩種shRNA沉默了ALKBH3的表達(dá)（圖2A-B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALKBH3缺失的細(xì)胞中m1A水平明顯升高（圖2C）。此外，在所有測(cè)試的眼黑色素瘤細(xì)胞中，ALKBH3沉默導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)（圖2D）和聚集能力（圖2E-F）顯著減弱。此外，如Transwell試驗(yàn)所示，敲除ALKBH3會(huì)導(dǎo)致遷移能力下降（圖2G-H）。這些數(shù)據(jù)證明了ALKBH3是眼黑色素瘤體外惡性增殖和轉(zhuǎn)移的必要致癌因子。為了評(píng)估它們?cè)隗w內(nèi)形成腫瘤的能力，將對(duì)照組和ALKBH3沉默的92.1黑色素瘤細(xì)胞（熒光素酶標(biāo)記）注射到裸鼠體內(nèi)，并在原位異種移植模型中監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。生物發(fā)光成像顯示，ALKBH3缺陷眼黑色素瘤細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度比對(duì)照細(xì)胞弱（圖2I）。此外，ALKBH3沉默組的異種移植物平均重量減少了80%（圖2J）。綜上所述，這些實(shí)驗(yàn)表明ALKBH3在體外和體內(nèi)眼黑色素瘤的腫瘤發(fā)生過(guò)程中起著致癌作用。

圖二：敲除ALKBH3可提高m1A水平并抑制眼黑色素瘤的發(fā)生

3. 組蛋白乳酸化增強(qiáng)了ALKBH3的過(guò)度表達(dá)

為了確定ALKBH3表達(dá)增加的分子基礎(chǔ)，研究人員查詢(xún)了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選與ALKBH3表達(dá)模式相似的基因。根據(jù)GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)ALKBH3相關(guān)基因富集在多個(gè)代謝過(guò)程中，包括氧化磷酸化、細(xì)胞代謝過(guò)程和碳水化合物衍生物代謝過(guò)程。這表明ALKBH3 RNA表達(dá)的升高可能來(lái)自代謝重編程。此外，乳酸生成酶LDHA和LDHB與ALKBH3呈顯著正相關(guān)，表明ALKBH3與乳酸之間存在關(guān)聯(lián)（圖3A-B）。由于之前的研究表明組蛋白乳酸化有助于激活癌基因，且眼部黑色素瘤的乳酸化水平升高，研究人員推測(cè)ALKBH3水平的升高可能與組蛋白乳酸化有關(guān)。

然后，研究人員驗(yàn)證了眼部黑色素瘤隊(duì)列中泛乳酸化和組蛋白乳酸化標(biāo)記（H3K18la）之間的表達(dá)模式，結(jié)果顯示它們與ALKBH3蛋白的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)（圖3B-C）。更重要的是，H3K18la的CUT&Tag和ChIP-seq分析都表明，在ALKBH3的啟動(dòng)子區(qū)域捕獲到了強(qiáng)大的組蛋白乳酸化信號(hào)（圖3D-E）。此外，組蛋白乳酸化抑制劑（草酸酯和2-DG）和LDHA/B抑制劑都會(huì)導(dǎo)致ALKBH3啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白乳酸化水平急劇下降（圖3F），進(jìn)而在所有測(cè)試的黑色素瘤細(xì)胞中消減ALKBH3的RNA（圖3G）和蛋白水平（圖3H-J）。

圖三：組蛋白乳化可促進(jìn)ALKBH3 的表達(dá)

4. 多組學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)SP100A是ALKBH3的下游候選基因

隨后探討了沉默ALKBH3對(duì)眼部黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用的機(jī)制。由于ALKBH3負(fù)責(zé)去除RNA中的m1A修飾，首先對(duì)眼部黑色素瘤細(xì)胞和正常黑色素細(xì)胞進(jìn)行了m1A-MeRIP-seq分析。結(jié)果表明，從正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的m1A-MeRIP-seq文庫(kù)中分別鑒定出了平均16 864個(gè)和10 212個(gè)m1A峰（圖4A和B）。與之前的m1A-meRIP-seq結(jié)果一致，m1A峰富集在5′UTR，尤其是起始密碼子附近。值得注意的是，差異表達(dá)的m1A修飾基因與多個(gè)黑色素瘤相關(guān)通路有關(guān)，包括DNA復(fù)制、mTOR/AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和黑色素合成，這表明m1A修飾在眼部黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制中起著調(diào)控作用。

此外，在沉默ALKBH3后，研究人員對(duì)92.1黑色素瘤細(xì)胞系進(jìn)行了一系列全面的高通量篩選，包括m1A-MeRIP-seq（圖4C）、RNA-seq（圖4D-E）和黑色素瘤細(xì)胞系進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析（iTRAQ圖4F）。同樣，研究人員注意到，m1A修飾位點(diǎn)的變化明顯富集于腫瘤相關(guān)通路，包括PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、病灶粘附和蛋白多糖合成（圖4C）。此外，沉默ALKBH3導(dǎo)致基因表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，上調(diào)基因達(dá)199個(gè)，下調(diào)基因達(dá)74個(gè)（圖4D和E）。同樣，蛋白質(zhì)組水平也發(fā)生了巨大的變化（149個(gè)蛋白上調(diào)，67個(gè)蛋白下調(diào)，圖4F），進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了ALKBH3在眼部黑色素瘤發(fā)病機(jī)制中的重要性。

結(jié)合這些多組學(xué)數(shù)據(jù)，研究人員注意到沉默ALKBH3后，眼黑色素瘤細(xì)胞中的核自身抗原斑點(diǎn)蛋白100（SP100）在mRNA和蛋白質(zhì)水平上都上調(diào)了，隨后m1A修飾水平也發(fā)生了巨大變化（圖4G-M）。值得注意的是，SP100負(fù)責(zé)PML核體的形成，主要作為各種癌癥類(lèi)型的腫瘤發(fā)生抑制因子，包括黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤、乳腺癌和喉癌。這一觀(guān)察結(jié)果與在ALKBH3基因缺陷細(xì)胞中觀(guān)察到的抑制效果相吻合。重要的是，與正常黑色素細(xì)胞相比，SP100在眼部黑色素瘤細(xì)胞中的m1A甲基化減少了。m1A-MeRIP-seq（圖4I）和m1A-MeRIP-qPCR（圖4J）都表明，眼黑色素瘤細(xì)胞中的m1A修飾水平在ALKBH3抑制后得到恢復(fù)。由于最近的研究觀(guān)察到mRNA的m1A修飾會(huì)增強(qiáng)基因表達(dá)和翻譯效力，因此ALKBH3介導(dǎo)的m1A修飾可能對(duì)腫瘤抑制因子SP100的表達(dá)至關(guān)重要。然后通過(guò)RNA-seq（圖4K）和qPCR（圖4L）驗(yàn)證了抑制ALKBH3后SP100在mRNA水平上顯著上調(diào)。iTRAQ和Western blot檢測(cè)（圖4M）顯示，SP100在ALKBH3抑制細(xì)胞中的蛋白水平也有所增加。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明ALKBH3可能會(huì)通過(guò)去除其m1A修飾來(lái)抑制SP100的表達(dá)水平。

圖四：lALKBH3通過(guò)去除SP100的m1A修飾抑制其表達(dá)

5.SP100A是眼部黑色素瘤的腫瘤抑制因子

在病毒感染反應(yīng)中，SP100有四種主要亞型（即SP100A、SP100B、SP100C和SP100HMG），這促使研究人員對(duì)這些轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平進(jìn)行比較分析。值得一提的是，SP100A與SP100B、SP100C和SP100HMG在最初的15個(gè)外顯子（1-1562bp）上表現(xiàn)出了共性，而在最后一個(gè)外顯子上觀(guān)察到了395bp的長(zhǎng)度差異。從眼部黑色素瘤細(xì)胞（92.1）和正常黑色素細(xì)胞（PIG1）獲得的RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，SP100A中的信號(hào)很突出，而SP100A未包含的外顯子中的信號(hào)則可以忽略不計(jì)（圖5A）。此外，還使用各種引物進(jìn)行了qPCR。這些引物包括一組專(zhuān)為SP100A設(shè)計(jì)的引物（稱(chēng)為SP100-P1）和另一組檢測(cè)SP100B、SP100C和SP100HMG的引物（稱(chēng)為SP100-P2）。在眼部黑色素瘤細(xì)胞和正常色素細(xì)胞中觀(guān)察到了SP100A的RNA表達(dá)（圖5B）。由于有報(bào)道稱(chēng)人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞株ZR-75-1表達(dá)SP100HMG，因此采用ZR-75-1細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。重要的是，只有在ZR-75-1中檢測(cè)到SP100B/SP100C/SP100HMG，而在其他細(xì)胞株中未檢測(cè)到。此外，這四種異構(gòu)體的分子量也有差異。Western blot顯示SP100A（～72kDa）在所有檢測(cè)的細(xì)胞系中都有特異性蛋白表達(dá)，這與之前研究中SP100A的分子量一致。這些結(jié)果表明，SP100A在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中大量表達(dá)，而其他同工酶（SP100B、SP100C和SP100HMG）的表達(dá)則微乎其微。

通過(guò)RNA-seq（圖5A）、qPCR（圖5B）和Western blot檢測(cè)（圖5C）發(fā)現(xiàn)，與正常色素細(xì)胞相比，眼部黑色素瘤細(xì)胞中SP100A的RNA表達(dá)水平也明顯下降。為了全面揭示SP100A在眼部黑色素瘤中的功能，研究人員測(cè)定了SP100A在眼部黑色素瘤臨床樣本中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SP100A在眼部黑色素瘤樣本中的表達(dá)量明顯下降（圖5D和E）。更重要的是，在研究人員的隊(duì)列（圖5F）和TCGA隊(duì)列（圖5G）中，SP100A的缺失都與不利的預(yù)后有關(guān)。

此外，根據(jù)眼部黑色素瘤樣本的單細(xì)胞分析，SP100的表達(dá)與癌癥激活標(biāo)志得分的降低有關(guān)，包括侵襲、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期激活、增殖和上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，SP100A在眼部黑色素瘤中被下調(diào)并可能抑制多種致癌事件。

由于SP100A在眼部黑色素瘤中下調(diào)，研究人員在三種眼部黑色素瘤細(xì)胞系中外源過(guò)表達(dá)了SP100A，過(guò)表達(dá)SP100A后，所有受測(cè)的眼黑色素瘤細(xì)胞的增殖能力都減弱了（圖5H）。此外，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)SP100A的黑色素瘤細(xì)胞形成的菌落更小更少（圖5I-J）。此外，在眼部黑色素瘤細(xì)胞中引入SP100A后，還觀(guān)察到癌癥轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制（圖5K-L）。

最重要的是，由于SP100A是PML體內(nèi)的分子支架，研究人員隨后評(píng)估了SP100A過(guò)表達(dá)細(xì)胞中PML的表達(dá)情況。結(jié)果，外源過(guò)表達(dá)SP100A導(dǎo)致PML蛋白水平顯著升高（圖5M）。同時(shí)，免疫熒光分析表明，SP100A過(guò)表達(dá)細(xì)胞中PML體的存在明顯增加?？傊@些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了SP100A對(duì)于PML的表達(dá)至關(guān)重要，這與之前的研究一致。此外，ALKBH3缺失的細(xì)胞表現(xiàn)出在PML小體中大幅升高，這與ALKBH3在調(diào)控SP100A表達(dá)中的關(guān)鍵作用一致。綜上所述，這些功能增益數(shù)據(jù)揭示了SP100A負(fù)責(zé)PML核凝聚體的形成，是眼部黑色素瘤的腫瘤抑制因子。

圖五：SP100A在眼部黑色素瘤中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用

6.沉默SP100A會(huì)部分影響ALKBH3缺陷細(xì)胞的抑瘤效果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證ALKBH3和SP100A表達(dá)之間的關(guān)系，通過(guò)轉(zhuǎn)染一種針對(duì)SP100A的shRNA，進(jìn)一步改變了眼部黑色素瘤細(xì)胞中ALKBH3抑制后SP100A的表達(dá)。不出所料，轉(zhuǎn)染SP100A-shRNA到三個(gè)眼黑色素瘤細(xì)胞后，SP100A的表達(dá)在RNA和蛋白水平上都顯著下降。在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，SP100A的缺失部分（50%～60%）挽救了ALKBH3抑制作用（圖6A），而且SP100A缺失的細(xì)胞對(duì)ALKBH3的抵抗力更強(qiáng)（圖6A）。同樣，SP100A沉默的細(xì)胞比對(duì)照組出現(xiàn)更多的菌落（圖6B）。此外，抑制SP100A能顯著增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力，并影響對(duì)ALKBH3缺陷黑色素瘤細(xì)胞的抑制效果（圖6C）。最重要的是，SP100A的敲除進(jìn)一步挽救了ALKBH3缺失黑色素瘤細(xì)胞的原位腫瘤形成（圖6D和E）。同樣，在野生型和ALKBH3 缺失型眼黑色素瘤細(xì)胞（圖6F）中，穩(wěn)定敲除SP100A會(huì)導(dǎo)致PML表達(dá)受損。這些結(jié)果表明，ALKBH3通過(guò)減少SP100A介導(dǎo)的體內(nèi)和體外PML小體來(lái)促進(jìn)眼黑色素瘤。

圖六：SP100A沉默可部分阻斷ALKBH3敲除的抗癌作用。

7.SP100A的m1A修飾增強(qiáng)了其RNA穩(wěn)定性和翻譯功效

隨后探索了SP100A的m1A修飾的表觀(guān)遺傳機(jī)制。由于之前的研究表明YTHDF蛋白負(fù)責(zé)識(shí)別m1A甲基化，首先檢測(cè)了SP100A mRNA與YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的結(jié)合情況。RNA免疫沉淀分析表明，YTHDF1能特異性地識(shí)別SP100A mRNA；然而，YTHDF2和YTHDF3僅表現(xiàn)出有限的相互作用強(qiáng)度（圖7A）。此外，在TCGA隊(duì)列中，YTHDF1與SP100A的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（圖7B），這與YTHDF1是識(shí)別SP100A的必要條件這一假設(shè)完全吻合。此外，YTHDF1沉默可顯著抑制SP100A的表達(dá)，并完全恢復(fù)了ALKBH3沉默介導(dǎo)的SP100A水平升高（圖7C-D）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明YTHDF1是SP100A的閱讀蛋白。

然后確定了SP100A mRNA的特定m1A修飾位點(diǎn)。在SP100A的5′UTR中，根據(jù)確定的峰值找到了五個(gè)潛在的m1A位點(diǎn)[c.44A（TGTGG）、c.54A（AGACG）和c.67A（TGAGG），以及c.92A/c.93A（GGAAG）]（圖4I），并將每個(gè)A突變?yōu)?span>T。然后將相應(yīng)的野生型和突變的5′UTR 克隆到pmirGLO載體中（圖7E）。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)表明，c.A92T的信號(hào)減弱，而其他突變組的信號(hào)保持不變（圖7E）。此外還進(jìn)行了RIP-qPCR分析，以確定YTHDF1與報(bào)告轉(zhuǎn)錄本（F-luc）之間的相互作用頻率。觀(guān)察到pmirGLO-MUT4(c.A92T)轉(zhuǎn)錄本與YTHDF1和F-Luc的結(jié)合親和力下降，而其他轉(zhuǎn)錄本保持不變。這一結(jié)果與之前的觀(guān)察結(jié)果一致，即YTHDF1直接與m1A甲基化序列相互作用，而m1A甲基化序列被認(rèn)為是RNA中 m1A的"Reader"。此外還發(fā)現(xiàn)ALKBH3缺失的細(xì)胞中SP100A的RNA穩(wěn)定性增強(qiáng)，這與ALKBH3缺失后SP100A RNA表達(dá)的增加相吻合（圖7F）。重要的是，92.1細(xì)胞中的多聚體分析表明，穩(wěn)定敲除ALKBH3會(huì)導(dǎo)致多聚體部分的SP100A mRNA豐度明顯提高（圖7G），而多聚體部分通常具有有效的翻譯能力。這一觀(guān)察結(jié)果與之前的結(jié)論一致，即早期外顯子中的m1A修飾會(huì)增強(qiáng)翻譯能力。值得注意的是，在敲除ALKBH3后，新生SP100A RNA的表達(dá)仍然沒(méi)有改變。綜上所述， SP100A mRNA的m1A RNA甲基化有助于提高轉(zhuǎn)錄后的RNA穩(wěn)定性和翻譯能力。

圖七：SP100A的m1A修飾可增加其RNA的穩(wěn)定性和翻譯功效

實(shí)驗(yàn)方法：

ChIP-seq、CUT&Tag、Diot blot、免疫熒光技術(shù)、蛋白免疫印跡、蛋白質(zhì)組學(xué)分析（LC-MS）、Transwell實(shí)驗(yàn)、MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-qPCR、熒光素酶實(shí)驗(yàn)、多聚核糖體分析

參考文獻(xiàn)：

Gu X, Zhuang A, Yu J, Yang L, Ge S, Ruan J, Jia R, Fan X, Chai P. Histone lactylation-boosted ALKBH3 potentiates tumor progression and diminished promyelocytic leukemia protein nuclear condensates by m1A demethylation of SP100A. Nucleic Acids Res. 2023 Dec 20:gkad1193. doi: 10.1093/nar/gkad1193. Epub ahead of print. PMID: 38118002.