CircPCNXL2-肝內(nèi)膽管癌治療的靶點(diǎn)

         據(jù)報(bào)道，circRNAs在許多癌癥的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。然而，circRNA在肝內(nèi)膽管癌(ICC)中的功能尚不清楚。circPCNXL2在ICC組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)ICC體外和體內(nèi)的增殖和轉(zhuǎn)移。從機(jī)制上看，circPCNXL2可以直接結(jié)合到STRAP上，誘導(dǎo)STRAP與MEK1/2相互作用，通過(guò)激活ERK/MAPK通路，促進(jìn)ICC的腫瘤發(fā)展。此外，circPCNXL2可以通過(guò)海綿化miR-766-3p調(diào)控SRSF1的表達(dá)，從而促進(jìn)ICC的生長(zhǎng)。最后，circPCNXL2在體內(nèi)可以部分抑制曲美替尼的抗腫瘤活性?？傊?，circPCNXL2通過(guò)與STRAP相互作用激活ERK信號(hào)通路，以及調(diào)節(jié)miR-766-3p/SRSF1軸，在ICC的進(jìn)展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。這些發(fā)現(xiàn)表明circPCNXL2可能是一種有希望的ICC生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本文于2024年2月發(fā)表于“Molecular Cancer”（IF=37.3）上。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）circPCNXL2在ICC中上調(diào)

         為了評(píng)估circRNAs在ICC中的作用，我們分析了來(lái)自7個(gè)ICC及其鄰近組織的RNA-seq數(shù)據(jù)。我們發(fā)現(xiàn)ICC中89個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)，67個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)。has_circ_0016956 (circPCNXL2)是上調(diào)最多的circRNA之一，通過(guò)qRT-PCR在我們的76對(duì)ICC組織中證實(shí)了其過(guò)表達(dá)(圖1a-c)。高circPCNXL2組的患者表現(xiàn)出較差的總生存期(OS)(圖1d)。circPCNXL2在4種ICC細(xì)胞系中的表達(dá)也較高，我們選擇了HuCCT1和RBE細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究(圖1e)。為了確認(rèn)circPCNXL2的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，我們對(duì)qRT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，確認(rèn)其首尾反向剪接(圖1f)。我們只發(fā)現(xiàn)circPCNXL2通過(guò)發(fā)散引物從cDNA中擴(kuò)增出來(lái)(圖1g)。經(jīng)RNase R和放線菌素D處理后，我們觀察到circPCNXL2比線性PCNXL2表現(xiàn)出更大的穩(wěn)定性(圖1h-i)。這些結(jié)果證明了circPCNXL2的環(huán)狀特性。通過(guò)熒光原位雜交(FISH)和細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核RNA純化分析，circPCNXL2轉(zhuǎn)錄物主要存在于HuCCT1和RBE的細(xì)胞質(zhì)中(圖1j-l)。上述發(fā)現(xiàn)提示circPCNXL2在ICC組織中過(guò)表達(dá)，且主要位于ICC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。

2）CircPCNXL2在體外促進(jìn)ICC的增殖和遷移

         為了闡明circPCNXL2在ICC中的生物學(xué)功能，我們利用靶向剪接連接的siRNA敲低circPCNXL2的表達(dá)，并合成circPCNXL2質(zhì)粒過(guò)表達(dá)circPCXNL2。通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證siRNA和質(zhì)粒的效率(圖2a-b)。首先，通過(guò)CCK-8、EdU和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circPCNXL2對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，敲低circPCNXL2抑制了HuCCT1和RBE細(xì)胞的增殖。相反，在circPCNXL2過(guò)表達(dá)組中發(fā)現(xiàn)了相反的效果(圖2c-f)。與此一致的是，通過(guò)transwell實(shí)驗(yàn)和傷口愈合實(shí)驗(yàn)，circPCNXL2敲低會(huì)阻礙遷移能力，而過(guò)表達(dá)circPCNXL2則會(huì)促進(jìn)遷移能力(圖2g-j)。這些發(fā)現(xiàn)表明circPCNXL2在ICC細(xì)胞中的致癌作用。

3）CircPCNXL2在體內(nèi)促進(jìn)ICC的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

         為了闡明circPCNXL2對(duì)體內(nèi)ICC的影響，我們構(gòu)建異種移植瘤模型。circPCNXL2敲低的腫瘤體積較小，而circPCNXL2過(guò)表達(dá)的RBE細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)速度比對(duì)照組快(圖3a-f)。免疫組化染色觀察到circPCNXL2敲低組的Ki-67水平較弱。相反，circPCNXL2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致Ki-67染色更強(qiáng)，提示Ki-67與circPCNXL2表達(dá)水平之間存在相關(guān)性(圖3g-h)。然后，我們構(gòu)建肝轉(zhuǎn)移模型，研究circPCNXL2在ICC體內(nèi)的轉(zhuǎn)移特征。結(jié)果表明，注射敲低circPCNXL2的HuCCT1細(xì)胞后，小鼠肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著減少。并且，circPCNXL2過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了肝臟播散能力(圖3i-k)。這些發(fā)現(xiàn)表明circPCNXL2促進(jìn)了體內(nèi)ICC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

4）CircPCNXL2調(diào)節(jié)ICC中ERK/MAPK信號(hào)通路的激活

         為了剖析circPCNXL2促進(jìn)ICC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，我們通過(guò)RNA-seq在過(guò)表達(dá)circPCNXL2的RBE細(xì)胞中鑒定了278個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs) (圖4a)。KEGG通路分析顯示，MAPK信號(hào)通路是最富集的通路(圖4b)。據(jù)報(bào)道，MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移等關(guān)鍵細(xì)胞功能?；诖?，我們假設(shè)circPCNXL2可能通過(guò)MAPK途徑促進(jìn)ICC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。免疫印跡結(jié)果顯示，在HuCCT1和RBE細(xì)胞中，circPCNXL2過(guò)表達(dá)時(shí)，MAPK通路中三個(gè)亞組的磷酸化水平均增強(qiáng)，而在circPCNXL2敲低組中，磷酸化水平均降低(圖4c)。ERK磷酸化的變化在三個(gè)亞組中最為顯著。因此，我們假設(shè)circPCNXL2主要通過(guò)ERK/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)ICC的腫瘤發(fā)生。

         為了了解ERK/MAPK通路在circPCNXL2介導(dǎo)的ICC進(jìn)展中的意義，我們?cè)隗w外添加了一種高選擇性ERK抑制劑SCH772984來(lái)阻斷ERK的磷酸化。我們通過(guò)Western Blot驗(yàn)證了SCH772984能夠有效抑制ERK通路的活性(圖4d-e)。功能上，EdU實(shí)驗(yàn)、CCK8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)和傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明，circPCNXL2過(guò)表達(dá)促進(jìn)了增殖和遷移，而SCH772984可以消除這一作用(圖4f-j)。這些結(jié)果共同表明circPCNXL2通過(guò)激活ERK/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)ICC的生長(zhǎng)和遷移。

5）CircPCNXL2與STRAP相互作用介導(dǎo)ERK/MAPK信號(hào)通路激活

         為了研究circPCNXL2如何調(diào)節(jié)ICC中ERK的磷酸化，使用circPCNXL2的生物素化探針在RBE裂解物中進(jìn)行RNA下拉，然后進(jìn)行銀染色和質(zhì)譜分析。然后，我們?cè)诖蠹s40 KD處觀察到一個(gè)特定的條帶，質(zhì)譜結(jié)果表明STRAP可能能夠與circPCNXL2結(jié)合(圖5a-b)。接下來(lái)，我們通過(guò)RNA下拉和RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HuCCT1和RBE細(xì)胞中circPCNXL2和STRAP之間的相互作用(圖5c-e)。我們通過(guò)FISH檢測(cè)和免疫熒光證實(shí)了circPCNXL2和STRAP的共定位(圖5f)。有趣的是，circPCNXL2敲低或過(guò)表達(dá)對(duì)STRAP的表達(dá)沒(méi)有影響(圖5g-h)。我們推測(cè)circPCNXL2可能在促進(jìn)ERK激活中起支架作用。據(jù)報(bào)道，STRAP可以與MEK1/2相互作用，并參與MEK1/2與ERK1/2的相互作用。為了測(cè)試在ICC中STRAP是否與MEK1/2相互作用，我們對(duì)HuCCT1和RBE進(jìn)行免疫沉淀和Western Blot檢測(cè)。結(jié)果表明，MEK1/2被抗STRAP抗體共免疫沉淀，而STRAP也被抗MEK1/2抗體共免疫沉淀。結(jié)果表明，在ICC細(xì)胞中，STRAP可以與MEK1/2結(jié)合(圖5i-j)。然后，為了研究circPCNXL2是否對(duì)ICC中STRAP和MEK1/2之間的相互作用有任何影響，我們進(jìn)行了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。我們觀察到，circPCNXL2過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)STRAP和MEK1/2之間的關(guān)聯(lián)，而兩者的蛋白水平?jīng)]有變化，相反，circPCNXL2敲低會(huì)減弱ICC細(xì)胞中STRAP-MEK1/2的相互作用(圖5k-l)。此外，MEK1/2抗體免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步結(jié)果證實(shí)，circPCNXL2也參與ERK1/2-MEK1/2相互作用，并在HuCCT1和RBE細(xì)胞中促進(jìn)ERK1/2的磷酸化(圖5m-n)。此外，為了解剖circPCNXL2和STRAP之間相互作用的精確結(jié)合域，設(shè)計(jì)了一系列flag標(biāo)記的STRAP缺失突變體，用于RIP和RNA下拉實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，第4和第5個(gè)WD-40結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)STRAP與circPCNXL2的結(jié)合(圖50-q)。

6）CircPCNXL2通過(guò)海綿miR-766-3p上調(diào)SRSF1的表達(dá)

         據(jù)報(bào)道，CircRNAs可能以許多其他方式發(fā)揮功能，例如編碼功能肽和充當(dāng)miRNA海綿。然而，在circRNADb中沒(méi)有任何假定的開(kāi)放閱讀框被注釋?zhuān)@表明circPCNXL2可能無(wú)法編碼蛋白質(zhì)。RIP顯示，在HuCCT1和RBE細(xì)胞中， AGO2抗體顯著富集circPCNXL2，這表明circPCNXL2可能在ICC中起miRNA抑制劑的作用。然后，我們通過(guò)重疊Targetscan、miRanda和RNAhybrid的miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)，鑒定了4個(gè)候選miRNA (miR605-5p、miR-766-3p、miR-4647和miR-6744-5p)(圖6a)。接下來(lái)，使用生物素標(biāo)記的circPCNXL2探針進(jìn)行RNA下拉實(shí)驗(yàn)，結(jié)合潛在的miRNA, miR766-3p是HuCCT1和RBE細(xì)胞中富集程度最高的miRNA(圖6b)。RIP檢測(cè)結(jié)果表明，AGO2抗體富集miR-766-3p(圖6c)。然后我們證實(shí)，與正常組織相比，miR-766-3p在ICC組織中下調(diào)，并且ICC患者中miR-766-3p的低水平與較差的生存率相關(guān)(圖6d-e)。此外，我們觀察到ICC組織中miR-766-3p的表達(dá)與circPCNXL2水平呈負(fù)相關(guān)(圖6f)。我們根據(jù)circPCNXL2與miR-766-3p之間的結(jié)合區(qū)域設(shè)計(jì)了circPCNXL2的突變質(zhì)粒，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染野生型circPNCXL2和miR-766-3p模擬物的熒光素酶活性顯著降低，而突變型circPCNXL2組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差異(圖6g)。miR-766-3p模擬物顯著抑制HuCCT1細(xì)胞的增殖和遷移，miR-766-3p抑制劑促進(jìn)RBE細(xì)胞的ICC進(jìn)展(圖6h-i)。綜上所述，miR-766-3p可以抑制ICC細(xì)胞的腫瘤發(fā)生。

         在之前的研究中，miR-766-3p可以通過(guò)直接靶向SRSF1抑制腎細(xì)胞癌的進(jìn)展。因此，我們假設(shè)SRSF1也可能是ICC中miR-766-3p的下游基因。轉(zhuǎn)染miR-766-3p模擬物的HuCCT1細(xì)胞中SRSF1 mRNA和蛋白水平降低，轉(zhuǎn)染miR766-3p抑制劑的RBE細(xì)胞中SRSF1 mRNA和蛋白水平升高(圖6j-k)。然而，SRSF1在ICC進(jìn)展中的作用尚不清楚。然后，我們使用qRT-PCR檢測(cè)了SRSF1在組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，SRSF1在ICC組織中表達(dá)上調(diào)，而在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中也觀察到類(lèi)似的結(jié)果(圖6l)。SRSF1的高表達(dá)是ICC患者的一個(gè)致癌因素(圖6m)。此外，qRT-PCR結(jié)果顯示SRSF1表達(dá)與circPCNXL2表達(dá)呈正相關(guān)，而與miR-766-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖6n-0)。然后，我們根據(jù)SRSF1與miR-766-3p的結(jié)合區(qū)域設(shè)計(jì)了SRSF1的突變質(zhì)粒，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了SRSF1與miR-766-3p的相互作用(圖6p)。此外，克隆形成和transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SRSF1過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了HuCCT1細(xì)胞的增殖和遷移。在轉(zhuǎn)染SRSF1下調(diào)的RBE細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)果(圖6q-r)。我們還證實(shí)SRSF1可以促進(jìn)HuCCT1和RBE細(xì)胞中ERK的磷酸化，這可以通過(guò)circPCNXL2過(guò)表達(dá)或敲低來(lái)拯救(圖6s-t)。綜上所述，circPCNXL2可以通過(guò)miR766-3p/SRSF1/ERK通路調(diào)控ICC的增殖和遷移。

7）CircPCNXL2在體內(nèi)可減輕曲美替尼的抗腫瘤作用

         曲美替尼是一種口服MEK抑制劑，已被批準(zhǔn)單獨(dú)或聯(lián)合用于治療黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等癌癥。為了研究circPCNXL2對(duì)曲美替尼的影響，我們?cè)隗w內(nèi)應(yīng)用曲美替尼抑制MEK/ERK通路，并利用circPCNXL2過(guò)表達(dá)的HuCCT1細(xì)胞建立皮下異種移植模型和肝轉(zhuǎn)移模型。在異種移植物模型中，曲美替尼抑制腫瘤生長(zhǎng)，這種抑制作用通過(guò)circPCNXL2過(guò)表達(dá)而恢復(fù)(圖7a-c)。免疫組化染色顯示，曲美替尼組Ki-67和p-ERK的染色最弱(圖7d)。circPCNXL2的上調(diào)顯著減弱了曲美替尼在ICC中的抗腫瘤作用。在肝轉(zhuǎn)移模型中也觀察到類(lèi)似的結(jié)果。曲美替尼治療減少了肝轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量，可以通過(guò)過(guò)表達(dá)circPCNXL2來(lái)恢復(fù)(圖7e-f)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證明circPCNXL2通過(guò)激活體內(nèi)ERK的磷酸化來(lái)抑制曲美替尼在ICC中的抗腫瘤作用，這可能是一種很有前景的ICC治療策略。

結(jié)論：

         我們的研究表明circPCNXL2在ICC中上調(diào)，并通過(guò)與STRAP相互作用促進(jìn)ERK的磷酸化，在ICC的發(fā)展中發(fā)揮腫瘤啟動(dòng)子的作用。此外，circPCNXL2作為miR-766-3p的海綿，導(dǎo)致SRSF1的上調(diào)，進(jìn)而激活ICC中的MEK/ERK通路(圖7g)。總的來(lái)說(shuō)，我們的研究結(jié)果表明circPCNXL2可以作為ICC患者的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。此外，circPCNXL2STRAP-MEK-ERK軸是一個(gè)有希望在ICC中進(jìn)一步研究的翻譯治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法：

         RNA-seq，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，FISH，RNA pull?down，RIP，免疫共沉淀，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，qRT-PCR，WB，IHC，CCK-8，Edu，克隆形成實(shí)驗(yàn)，創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)：

         Liu S, Wang Y, Wang T, Shi K, Fan S, Li C, Chen R, Wang J, Jiang W, Zhang Y, Chen Y, Xu X, Yu Y, Li C, Li X. CircPCNXL2 promotes tumor growth and metastasis by interacting with STRAP to regulate ERK signaling in intrahepatic cholangiocarcinoma. Mol Cancer. 2024 Feb 17;23(1):35. doi: 10.1186/s12943-024-01950-y.