小膠質(zhì)細(xì)胞中YY1乳酸化通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活介導(dǎo)的FGF2上調(diào)促進(jìn)血管生成

         眼部新生血管形成是導(dǎo)致失明的主要原因。視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞與缺氧誘導(dǎo)的血管生成和血管病變有關(guān)，但其潛在機(jī)制尚不完全清楚。乳酸化是一種新型的乳酸衍生翻譯后修飾，在多個(gè)細(xì)胞過(guò)程中起關(guān)鍵作用。由于缺血性視網(wǎng)膜病變中的缺氧是視網(wǎng)膜新生血管形成的誘發(fā)因素，因此乳酸化很可能參與這一過(guò)程。該研究旨在探討乳酸化在視網(wǎng)膜新生血管形成中的作用，并確定視網(wǎng)膜新生血管疾病的新治療靶點(diǎn)。集落刺激因子1受體（CSF1R）抑制劑對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭PLX3397抑制氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變中的視網(wǎng)膜新生血管形成。缺氧可增加小膠質(zhì)細(xì)胞中的乳酸化并加速FGF2的表達(dá)，從而促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管形成。作者確定了67個(gè)蛋白質(zhì)的77個(gè)位點(diǎn)，在缺氧下乳酸增加的背景下乳酸化增加。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子非組蛋白陰陽(yáng)-1（YY1）在賴氨酸183（K183）位點(diǎn)乳酸化，賴氨酸183受p300調(diào)控。高乳酸化的YY1直接增強(qiáng)FGF2轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)血管生成。K183位點(diǎn)的YY1突變消除了這些影響。p300的過(guò)表達(dá)增加YY1乳酸化并增強(qiáng)體外血管生成，并且p300抑制劑A485的給藥大大抑制了體內(nèi)和體外的血管形成。該研究結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞中YY1的乳酸化通過(guò)上調(diào)FGF2的表達(dá)在視網(wǎng)膜新生血管形成中發(fā)揮重要作用。靶向乳酸/p300/YY1乳酸化/FGF2軸可能為增殖性視網(wǎng)膜病變提供新的治療靶點(diǎn)。該研究于2023年4月發(fā)表于《Genome Biology》上，題為“YY1 lactylation in microglia promotes angiogenesis through transcription activation-mediated upregulation of FGF2”，影響因子12.3。

技術(shù)路線

研究思路

1. 視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜新生血管形成至關(guān)重要

         為了評(píng)估小膠質(zhì)細(xì)胞在視網(wǎng)膜病變血管發(fā)病機(jī)制中的作用，開(kāi)發(fā)了一種廣泛使用的OIR小鼠模型，該模型概括了人類(lèi)增殖性視網(wǎng)膜病變，如ROP，如流程圖所示（圖1a）。建模后，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞大量增殖并聚集在OIR視網(wǎng)膜新生血管形成部位周?chē)▓D1b）。為了評(píng)估小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭是否會(huì)影響OIR的進(jìn)展，作者使用了CSF1R抑制劑（PLX3397），該抑制劑被證明可誘導(dǎo)明顯的小膠質(zhì)細(xì)胞消融。加藥流程圖如圖1c所示（從P10到P17注射）。給藥后，作者觀察到病理性血管生成隨著小膠質(zhì)細(xì)胞的耗竭而受到極大的抑制（圖1d）。這些結(jié)果證明了小膠質(zhì)細(xì)胞在視網(wǎng)膜新生血管形成中的重要作用。

圖1 視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜新生血管形成至關(guān)重要

2. 乳酸和乳酸化水平升高與視網(wǎng)膜新生血管形成有關(guān)

         乳酸化來(lái)源于乳酸，參與多種細(xì)胞過(guò)程。為了確認(rèn)乳酸和乳酸化是否參與缺氧誘導(dǎo)的增殖性視網(wǎng)膜病變，作者檢查了OIR小鼠的乳酸含量和泛賴氨酸乳酸化（Pan-Kla）水平。與年齡匹配的對(duì)照組相比，OIR小鼠P17（OIR新生血管形成的峰值）視網(wǎng)膜中的乳酸水平上調(diào)（圖2a），與臨床數(shù)據(jù)一致，與非ROP嬰兒相比，ROP嬰兒血液中的乳酸含量顯著增加（圖2b）。同時(shí)，與對(duì)照組相比，OIR組的Pan-Kla水平上調(diào)（圖2c）。然后，作者想知道小膠質(zhì)細(xì)胞的乳酸化是否在視網(wǎng)膜血管疾病中起重要作用。OIR小鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞中的乳酸化上調(diào)（圖2d）。值得注意的是，隨著小膠質(zhì)細(xì)胞的耗竭，視網(wǎng)膜中Pan-Kla的水平相對(duì)下調(diào)（圖2e）。

         為了研究乳酸化是否有助于視網(wǎng)膜病變的血管發(fā)病機(jī)制，作者應(yīng)用了兩種化合物進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即二氯乙酸鈉（DCA）和魚(yú)藤酮，它們已被證明可以通過(guò)調(diào)節(jié)乳酸的產(chǎn)生來(lái)調(diào)節(jié)乳酸化。DCA可以通過(guò)抑制丙酮酸脫氫酶激酶的活性來(lái)減少乳酸的產(chǎn)生，魚(yú)藤酮是線粒體呼吸鏈復(fù)合物的抑制劑，使細(xì)胞傾向于進(jìn)行糖酵解并增加乳酸的含量。復(fù)方處理后，作者觀察到DCA組的乳酸和乳酸化水平降低，魚(yú)藤酮組的乳酸和乳酸化水平升高（圖2f，g），伴有DCA組視網(wǎng)膜新生血管的緩解和魚(yú)藤酮組新生血管的加重（圖2h）。這些結(jié)果表明乳酸化在視網(wǎng)膜新生血管形成中的重要作用。

圖2 乳酸和乳酸化水平升高與視網(wǎng)膜新生血管形成有關(guān)

3. 小膠質(zhì)細(xì)胞的高乳酸化促進(jìn)體外血管生成

         由于缺氧在血管生成過(guò)程中很重要，作者將人小膠質(zhì)細(xì)胞克隆3（HMC3）細(xì)胞暴露于缺氧下，以探索乳酸化在小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用。隨著缺氧程度的增加，HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞的乳酸含量增加，乳酸化水平也升高，特別是對(duì)于55-70 kD范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)（圖3a，b）。內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移對(duì)于血管網(wǎng)絡(luò)的形成至關(guān)重要。為了探究乳酸化增加的小膠質(zhì)細(xì)胞是否會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力。作者將常氧或缺氧組的HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞與人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRMECs）共培養(yǎng)。隨著HMC3細(xì)胞缺氧時(shí)間的增加，HRMECs的管形成、球狀體萌芽、遷移和增殖的能力增強(qiáng)（圖3c-f）。為進(jìn)一步證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞乳酸/乳酸化水平在血管生成發(fā)病機(jī)制中的重要作用，采用DCA和魚(yú)藤酮處理HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)乳酸/乳酸化水平。DCA組HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞的乳酸/乳酸化水平降低，魚(yú)藤酮組升高（圖3g，h）。然后，作者將DCA/DMSO/魚(yú)藤酮組的HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞與HRMECs共培養(yǎng)，以探索對(duì)HRMECs的影響。DCA組與HMC3細(xì)胞共培養(yǎng)的HRMECs的管形成、球狀芽、遷移和增殖能力減弱，魚(yú)藤酮組增強(qiáng)（圖3i-l）。這些結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞中乳酸化升高是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力的原因。

圖3 小膠質(zhì)細(xì)胞的高乳酸化在體外促進(jìn)血管生成

4. YY1在小膠質(zhì)細(xì)胞中的乳酸化在調(diào)節(jié)血管生成中起著重要作用

         為了表征缺氧下小膠質(zhì)細(xì)胞中乳酸化的情況，作者用常氧或缺氧處理HMC3細(xì)胞24 h，然后通過(guò)4D無(wú)標(biāo)記平臺(tái)方法進(jìn)行乳酸組分析以鑒定差異乳酸化蛋白。對(duì)于乳酸組數(shù)據(jù)的詳細(xì)信息，共鑒定出6021個(gè)肽和3071個(gè)乳酸化肽。在HMC3細(xì)胞中總共鑒定了751個(gè)蛋白質(zhì)中的3093個(gè)乳糖化位點(diǎn)，定位概率>0.75，FDR為1%。質(zhì)量控制表明肽的分布在合理范圍。作者在缺氧條件下鑒定了乳酸化增加的67種蛋白質(zhì)的77個(gè)位點(diǎn)和乳酸化降低的162種蛋白質(zhì)的190個(gè)位點(diǎn)作為差異表達(dá)的乳酸化蛋白（DELPs）。乳酸化增加或減少的前20種蛋白質(zhì)的相對(duì)定量如圖4a所示。對(duì)鑒定的DELPs行聚類(lèi)分析以表征這些乳酸化蛋白的功能。分類(lèi)分析表明，大多數(shù)DELPs在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，并在調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄中具有潛在作用（圖4b）。使用相互作用基因/蛋白質(zhì)檢索檢索工具（STRING）數(shù)據(jù)庫(kù)，DELPs的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)表明DELPs主要在結(jié)合過(guò)程中起作用，這與富集途徑相對(duì)應(yīng)（圖4c）。

         在這些DELPs中，YY1的乳酸化水平很大程度上上調(diào)（倍數(shù)變化3.56），而YY1是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)血管生成有一定的調(diào)節(jié)作用。此外，觀察到的YY1條帶大小為68 kD，這與55-70 kD的范圍一致，根據(jù)作者之前的結(jié)果，該范圍主要由缺氧或用DCA和魚(yú)藤酮治療調(diào)節(jié)。作者在缺氧的HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到YY1和Pan-Kla與雙標(biāo)記免疫熒光的共定位。蛋白質(zhì)組學(xué)分析在YY1（K183）中僅鑒定出一個(gè)乳酸化賴氨酸殘基，顯示出特征性的串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）譜圖，包括C端y離子和氨基末端b離子（圖4d）。為了驗(yàn)證YY1乳酸化在缺氧條件下是否受到調(diào)控，作者使用專(zhuān)門(mén)的YY1-K183la抗體來(lái)檢測(cè)YY1乳酸化水平。與測(cè)序結(jié)果一致，YY1乳酸化在缺氧條件下顯著增加，YY1表達(dá)水平無(wú)差異（圖4e）。

         接下來(lái)，作者將YY1的賴氨酸（K）183突變?yōu)榫彼幔?span>R），其模擬蛋白質(zhì)的脫乳?；癄顟B(tài)，方法是用含有Flag標(biāo)記的YY1WT或YY1K183R突變體的cDNA的慢病毒轉(zhuǎn)染HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞。Flag-YY1在WT和K183R突變體組中均過(guò)表達(dá)。在K183R突變體缺氧處理的HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞中，YY1乳酸化水平降低。與WT組相比，與K183R突變體HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的HRMECs顯示出減弱的管形成、球狀體萌芽、遷移和增殖能力（圖4f-i）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明小膠質(zhì)細(xì)胞中YY1的乳酸化起著血管生成的調(diào)節(jié)劑的作用。

圖4 YY1在小膠質(zhì)細(xì)胞中的乳酸化在調(diào)節(jié)血管生成中起著重要作用

5. YY1乳酸化通過(guò)調(diào)節(jié)FGF2表達(dá)促進(jìn)血管生成

         為了確定參與小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成的潛在血管生成因子，作者在體外逆轉(zhuǎn)錄了從體內(nèi)常氧、缺氧和小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭的視網(wǎng)膜和HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞中分離的mRNA，并比較了一些經(jīng)典血管生成相關(guān)基因（VEGFA/FGF2/MMP9/MMP2/ANGPTL6）的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，OIR小鼠的FGF2和VEGFA mRNA表達(dá)水平顯著升高，而小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭后mRNA和蛋白水平僅FGF2水平顯著降低（圖5a，c）。同樣，缺氧在缺氧暴露后 12 小時(shí)內(nèi)增加FGF2 mRNA 表達(dá)，并且在HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞中水平保持升高直到24 小時(shí)（圖5b，d）。FGF2在OIR視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)（圖5e）。與先前的研究一致，這些結(jié)果表明FGF2在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的新生血管形成中很重要。DCA和魚(yú)藤酮在體內(nèi)和體外用于探討乳酸/乳酸化是否通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成因子的表達(dá)來(lái)影響血管生成。在用DCA和魚(yú)藤酮處理的OIR模型中，DCA組FGF2的表達(dá)降低，但魚(yú)藤酮組在P17時(shí)增加。在暴露于DCA或魚(yú)藤酮缺氧的HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果。

         YY1包含四個(gè)C2H2鋅指，用于結(jié)合位于許多啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中的特定DNA序列，促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄。在YY1 K183R突變組中，FGF2在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均較低，而其他血管生成因子無(wú)差異（圖5f）。為了探究YY1乳酸化與FGF2表達(dá)的機(jī)制，作者檢索了Cistrome Data Browser數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)YY1可能直接促進(jìn)FGF2的轉(zhuǎn)錄。作者在JASPAR網(wǎng)站上的FGF2啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)預(yù)測(cè)的YY1結(jié)合位點(diǎn)，ChIP-qPCR顯示YY1可以結(jié)合FGF2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的?1336至?1172bp區(qū)域。為了進(jìn)一步探索缺氧條件下YY1的靶點(diǎn)，作者用YY1對(duì)這些血管生成因子的啟動(dòng)子進(jìn)行了ChIP-qPCR。值得注意的是，ChIP-qPCR分析顯示，缺氧促進(jìn)了YY1與FGF2啟動(dòng)子的結(jié)合，而不是其他血管生成因子（圖5g），主要是因?yàn)橐暰W(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞不是分泌這種血管生成因子的主要細(xì)胞。K183R突變導(dǎo)致YY1與FGF2啟動(dòng)子的結(jié)合受損，表明它受YY1乳酸化水平的調(diào)節(jié)（圖5h）。用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證了YY1在缺氧條件下直接促進(jìn)FGF2轉(zhuǎn)錄，YY1乳酸化位點(diǎn)突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄能力降低的結(jié)果（圖5i）。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)玻璃體內(nèi)注射重組FGF2可逆轉(zhuǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭抑制的視網(wǎng)膜新生血管形。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明，缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的FGF2受YY1乳酸化的調(diào)控，并在缺氧誘導(dǎo)的血管生成中起重要作用。

圖5 YY1乳酸化通過(guò)調(diào)節(jié)FGF2表達(dá)促進(jìn)血管生成

6. p300影響YY1的乳酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)體外血管生成

         賴氨酸酰化是一系列普遍且進(jìn)化上保守的PTM。乳酸化是一種新形式，可能與其他賴氨酸?；?lèi)型共享相似的寫(xiě)入器和橡皮擦。為了確定負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)乳酸化水平的調(diào)節(jié)因子，作者在常氧和缺氧條件下檢測(cè)了已知酰化修飾寫(xiě)入物（Tip60、p300和PCAF）和擦除劑（HDAC6和SIRT1）的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，缺氧條件下HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞中p300、HDAC6和SIRT1水平顯著上調(diào)，Tip60水平略有上調(diào)（圖6a）。值得注意的是，根據(jù)Co-IP數(shù)據(jù)，只有p300與靶蛋白YY1結(jié)合，并且p300-YY1之間的相互作用隨著缺氧而增加（圖6b）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)p300通過(guò)雙標(biāo)記免疫熒光與YY1共定位（圖6c）。

         為了進(jìn)一步探討p300在調(diào)節(jié)乳酸化水平中的作用，作者在HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)p300，發(fā)現(xiàn)乳酸化水平顯著升高（圖6d）。有趣的是，p300的過(guò)表達(dá)增加了YY1的乳酸化水平，并伴有FGF2的上調(diào)（圖6e，f）。為了充分證實(shí)p300的作用，在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用了p300抑制劑A-485。A-485被證明是p300的CoA競(jìng)爭(zhēng)性催化抑制劑，L-乳酰輔酶A是乳酸化所必需的。A-485處理后，YY1的乳酸化顯著降低，YY1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的假設(shè)靶點(diǎn)FGF2的表達(dá)水平也下調(diào)（圖6g，h）。與p300過(guò)表達(dá)的HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的HRMECs的管形成、球狀芽、遷移和增殖能力增強(qiáng)，但與相應(yīng)的對(duì)照組相比，A-485組減弱。

圖6 p300影響YY1的乳酸化，然后在體外調(diào)節(jié)血管生成

7. 抑制p300可減少視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的YY1乳酸化并抑制OIR中的血管生成

         了解了p300/YY1乳酸化/FGF2軸在小膠質(zhì)細(xì)胞中的重要促血管生成作用，作者通過(guò)體內(nèi)靶向p300和A485進(jìn)一步評(píng)估了抗血管生成治療的療效。作者發(fā)現(xiàn)YY1乳酸化和p300的表達(dá)在OIR視網(wǎng)膜中上調(diào)（圖7a）。Iba1和YY1-K183la的雙重免疫熒光染色顯示OIR小鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞中YY1乳酸化上調(diào)（圖7b）。在P14處進(jìn)行玻璃體內(nèi)給藥A485處理，服用A485后，Pan-Kla水平降低。有趣的是，A485處理降低了視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞中YY1的乳酸化（圖7c，d），伴有FGF2表達(dá)降低和視網(wǎng)膜新生血管緩解（圖7e，f）。小膠質(zhì)細(xì)胞中乳酸化的減少可能與小膠質(zhì)細(xì)胞活化減少有關(guān)（圖7g）?？傮w而言，這些結(jié)果表明，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞中YY1乳酸化的上調(diào)與視網(wǎng)膜新生血管形成有關(guān)，表明阻斷p300-YY1乳酸化-FGF2信號(hào)傳導(dǎo)可能為治療視網(wǎng)膜新生血管疾病提供治療范式。

         由于小鼠出生時(shí)沒(méi)有完整的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)絡(luò)，并且視網(wǎng)膜處于相對(duì)缺氧狀態(tài)，作者想知道YY1乳酸化是否也在視網(wǎng)膜發(fā)育血管生成中發(fā)揮作用。作者發(fā)現(xiàn)YY1在視網(wǎng)膜發(fā)育的早期階段（出生后第5天）出現(xiàn)高乳酸化。YY1乳酸化水平在后期下降，表明YY1也可能在生理性血管生成中發(fā)揮作用。需要進(jìn)一步的研究來(lái)深入探索它。

圖7 抑制p300可降低YY1的乳酸化并抑制OIR中的血管生成

實(shí)驗(yàn)方法

         小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭；動(dòng)物建模與給藥；細(xì)胞培養(yǎng)；乳酸水平定量；免疫熒光染色；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；WB；體外慢病毒感染和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；基于泛抗體的翻譯后修飾富集；LC/MS分析和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索；免疫共沉淀（Co-IP）；ChIP檢測(cè)；雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)；HRMECs管形成實(shí)驗(yàn)；基于球狀體的萌芽血管生成實(shí)驗(yàn)；細(xì)胞遷移檢測(cè)；細(xì)胞增殖檢測(cè)；

參考文獻(xiàn)

         Wang X, Fan W, Li N, Ma Y, Yao M, Wang G, He S, Li W, Tan J, Lu Q, Hou S. YY1 lactylation in microglia promotes angiogenesis through transcription activation-mediated upregulation of FGF2. Genome Biol. 2023 Apr 21;24(1):87.