高2,6-唾液?；龠M(jìn)CD4+ t細(xì)胞活化并誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生

2,6-唾液酰化，由2,6-唾液酰轉(zhuǎn)移酶(ST6GAL1)催化，在免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。然而，ST6GAL1在潰瘍性結(jié)腸炎(UC)發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。ST6GAL1 mRNA在UC組織中較相應(yīng)的鄰近正常組織高表達(dá)，并且在UC患者結(jié)腸組織中2,6-唾液?；@著升高。ST6GAL1和促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-6、IL-17和干擾素- γ的表達(dá)也增加。UC患者CD4+ T細(xì)胞數(shù)量增加。ST6GAL1基因敲除(ST6GAL1?/-)大鼠是通過CRISPR建立的。缺乏ST6GAL1可降低UC模型大鼠的促炎細(xì)胞因子水平，減輕結(jié)腸炎癥狀。2,6-唾液化的消融抑制TCR向脂質(zhì)筏的轉(zhuǎn)運(yùn)并抑制CD4+ t細(xì)胞的活化。TCR信號的衰減可下調(diào)ST6GAL1-/- CD4+ t細(xì)胞中NF-B的表達(dá)。此外，NF-B可以結(jié)合ST6GAL1啟動子來增加其轉(zhuǎn)錄。ST6GAL1的消融術(shù)可下調(diào)NF-B的表達(dá)，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，緩解UC的發(fā)病機(jī)制，是UC臨床治療的潛在新靶點(diǎn)。該文于2023年9月發(fā)布于《Advanced Science》, IF=15.1。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、2,6-唾液酰化在UC中高表達(dá)

不同種類的n -聚糖由幾種糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶催化。最重要的“封頂”反應(yīng)包括通過STs將唾液酸添加到分支上。為了探討唾液?；cUC發(fā)生的相關(guān)性，作者使用Gene expression Omnibus (GEO)數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析分析了UC患者與健康對照(HCs)中ST家族基因的表達(dá)(圖1B)。在GSE179285數(shù)據(jù)集中，與HCs相比，UC患者中有17044個基因發(fā)生改變，其中包括8396個上調(diào)基因和8348個下調(diào)基因(圖1C)。在UC患者中，ST6GAL1、ST3GAL1、ST3GAL2、ST3GAL3、ST3GAL4、ST3GAL5、ST6GALNAC4、ST6GALNAC5、ST6GALNAC6、ST8SIA1、ST8SIA4的表達(dá)水平顯著升高(圖1D)。使用GEO2R分析軟件對樣本間的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化方差分析(圖1E)。在UC或結(jié)腸癌患者中觀察到異常的唾液化。作者從UC和HCs患者的結(jié)腸組織中分離RNA，比較STs的mRNA水平。與HCs相比，UC患者中ST6GAL1 mRNA表達(dá)選擇性過表達(dá)(圖1F)。ST6GAL1催化唾液酸從CMP-Neu5Ac供體轉(zhuǎn)移到半乳糖末端殘基，形成2,6-連鎖(2,6-唾液?；?span style="-webkit-tap-highlight-color: rgba(0, 0, 0, 0)">)(圖1A)。作者用特異性識別2,6-唾液酸結(jié)構(gòu)的黑Sambucus nigra凝集素(SNA)凝集素印跡法檢測了2,6-唾液酸原位化水平。2,6-唾液酰化主要在UC患者的結(jié)腸組織中升高(圖1G)。

圖1、2,6-唾液?；?span style="-webkit-tap-highlight-color: rgba(0, 0, 0, 0)">UC結(jié)腸組織中顯著升高

2、ST6GAL1消融術(shù)緩解大鼠UC癥狀

鑒于2,6-唾液酰化在UC患者中顯著升高，作者研究了ST6GAL1介導(dǎo)的2,6-唾液酰化如何調(diào)節(jié)UC的發(fā)病機(jī)制。作者使用CRISPR-Cas9技術(shù)改造了ST6GAL1+/?大鼠(圖2A)。通過雜合ST6GAL1+/?大鼠雜交獲得純合野生型(ST6GAL1+/+)和敲除型(ST6GAL1?/?)大鼠(圖2B)。當(dāng)ST6GAL1+/?大鼠雜交時(shí)，ST6GAL1+/+、ST6GAL1+/-和ST6GAL1?/-大鼠的比例≈1:2:1，符合孟德爾遺傳(圖2C)。ST6GAL1產(chǎn)物是2,6-唾液化的n -聚糖，通過SNA印跡證實(shí)，它在ST6GAL1 +/+血清中普遍表達(dá)，但在ST6GAL1?/?血清中不存在(圖2D)。在凝集素印跡分析中，Aleuria aurantia lectin (AAL)、Maackia amurensis lectin (MAL)和concanavalin A lectin (ConA)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ST6GAL1基因的消融不影響大鼠的體重(圖2E)。為了評估ST6GAL1在UC發(fā)生中的作用，作者用5%葡聚糖硫酸鈉(DSS)給ST6GAL1 +/+和ST6GAL1?/?大鼠建立了UC模型(圖2F)。首先，作者用免疫熒光法檢測了大鼠體內(nèi)2,6-唾液?；健?span style="-webkit-tap-highlight-color: rgba(0, 0, 0, 0)">A2,6-唾液?；?span style="-webkit-tap-highlight-color: rgba(0, 0, 0, 0)">UC小鼠中升高(圖2G)。與ST6GAL1+/+大鼠相比，ST6GAL1?/?大鼠在UC模型中表現(xiàn)出明顯的體重減輕(圖2H)。此外，UC造模后ST6GAL1?/-大鼠出現(xiàn)輕度大便不規(guī)則和便血。疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)包括體重、大便形狀、便血等因素，常用于評估UC的嚴(yán)重程度。UC模型中，ST6GAL1-/-大鼠DAI評分低于ST6GAL1+/+大鼠(圖2I)。此外，UC模型中ST6GAL1+/+大鼠的結(jié)腸長度更短，而ST6GAL1?/?大鼠的結(jié)腸長度沒有變化(圖2J)，表明ST6GAL1消融減輕了UC的癥狀。

圖2、消融ST6GAL1可緩解UC大鼠UC癥狀

3、UC患者CD4+ t細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)

蘇木精-伊紅染色(HE)顯示UC患者結(jié)腸損傷嚴(yán)重(圖3A)，病理評分增高(圖3B)。此外，作者分離了ST6GAL1+/+和ST6GAL1?/?大鼠的腸上皮細(xì)胞，在體外用脂多糖(LPS)刺激腸上皮細(xì)胞，并表征了ST6GAL1的mRNA水平。2,LPS刺激后上皮細(xì)胞的6-唾液?；黾?。鑒于免疫失衡是UC發(fā)病的重要原因之一，作者利用單細(xì)胞測序技術(shù)和huARdb (https://huarc.net/數(shù)據(jù)庫)對UC患者的免疫細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行了分析。UC患者CD4+ T、Th1、Th17和Treg細(xì)胞數(shù)量增加，而Th2細(xì)胞數(shù)量減少(圖3C)。此外，結(jié)腸組織中CD4+ T細(xì)胞的數(shù)量急劇增加(圖3D)。基因本體(GO)富集分析也表明，UC患者的CD4+ T細(xì)胞和炎癥反應(yīng)富集。UC組織中促炎因子如白細(xì)胞介素(IL)?2、IL-6、IL-17a和IFN- 水平顯著升高，而抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13水平降低(圖3E)。接下來，作者測定了UC患者外周血中免疫細(xì)胞的數(shù)量。UC患者CD4+ T細(xì)胞數(shù)量顯著增高;然而，CD8+ T細(xì)胞數(shù)量未見變化(圖3F)。CD4+CD25+FoxP3+ (Treg)細(xì)胞數(shù)量減少(圖3G)。促炎因子il - 2、IL-6、IL-17水平顯著升高，抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13水平降低(圖3H)?？傮w而言，UC患者的促炎細(xì)胞因子水平升高，并伴有CD4+ T細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎細(xì)胞因子下調(diào)。

圖3、UC患者CD4+ t細(xì)胞數(shù)量和促炎細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)

4、ST6GAL1基因消融術(shù)減少UC大鼠CD4+ t細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子

ST6GAL1?/?UC大鼠UC癥狀得到緩解，UC患者CD4+ T細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子水平顯著升高。這表明ST6GAL1影響CD4+ T細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞因子水平。因此，作者檢測了ST6GAL1+/+和ST6GAL1?/?UC大鼠的CD4+ T細(xì)胞數(shù)量和促炎細(xì)胞因子水平。ST6GAL1?/?UC大鼠的病理評分低于ST6GAL1+/+ UC大鼠(圖4A,B)。與ST6GAL1?/?UC大鼠相比，ST6GAL1?/?UC大鼠脾臟(圖4C)和Peyer’s patches(圖4D)中CD4+ T細(xì)胞數(shù)量減少。此外，與ST6GAL1?/?CD4+ t細(xì)胞相比，來自ST6GAL1+/+ UC大鼠的CD4+ t細(xì)胞促進(jìn)了UC的發(fā)生。一些研究報(bào)道Treg和Th17細(xì)胞之間的平衡對維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)很重要。Treg細(xì)胞的減少或Th17細(xì)胞的增加會促進(jìn)腸道炎癥。ST6GAL1?/?UC大鼠脾臟Treg細(xì)胞和Peyer 's斑塊數(shù)量增加，而Th17細(xì)胞數(shù)量減少。ST6GAL1?/?CD4+ T細(xì)胞中Treg細(xì)胞數(shù)量增加，而Th17細(xì)胞數(shù)量減少。此外，ST6GAL1?/?UC大鼠表現(xiàn)出低水平的促炎細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-17a和IFN- 和高水平的抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10和IL-13(圖4E)。上述結(jié)果表明，ST6GAL1消融可誘導(dǎo)CD4+ T細(xì)胞向treg細(xì)胞極化，抑制其向Th17細(xì)胞極化。

圖4、ST6GAL1基因消融術(shù)可減少UC模型大鼠CD4+ t細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子

5、ST6GAL1基因的消融術(shù)抑制CD4+ t細(xì)胞的增殖和活化

CD4+ T細(xì)胞的過度活化與UC的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。為了研究ST6GAL1在CD4+ T細(xì)胞活化中的作用，作者采用磁珠分選方法從ST6GAL1 +/+和ST6GAL1?/?大鼠脾臟中分離CD4+ T細(xì)胞。在羧基熒光素二乙酸琥珀酰酯實(shí)驗(yàn)中，ST6GAL1的消融抑制了抗CD3和CD28抗體刺激后的CD4+ t細(xì)胞(圖5A)。T細(xì)胞在激活后經(jīng)常聚集成簇。與ST6GAL1+/+ CD4+ T細(xì)胞相比，激活后ST6GAL1?/- CD4+ T細(xì)胞聚集減少(圖5B)。流式細(xì)胞術(shù)還顯示，ST6GAL1?/-大鼠體內(nèi)CD4+CD69+細(xì)胞(活化CD4+ T細(xì)胞)數(shù)量較少(圖5C)。為了進(jìn)一步闡明ST6GAL1調(diào)控CD4+ T細(xì)胞活化的機(jī)制，作者建立了ST6GAL1基因敲低Jurkat細(xì)胞(Jurkat- shST6GAL1 cells)， ST6GAL1恢復(fù)Jurkat- shST6GAL1 - re細(xì)胞。ST6GAL1 mRNA在Jurkat-shST6GAL1細(xì)胞中的表達(dá)降低，通過將ST6GAL1基因重新導(dǎo)入JurkatshST6GAL1細(xì)胞，ST6GAL1 mRNA的表達(dá)得以恢復(fù)(圖5D)。SNA凝集素印跡分析證實(shí)ST6GAL1基因表達(dá)水平。2,6-唾液化在Jurkat-shST6GAL1細(xì)胞中幾乎檢測不到，但在Jurkat-shST6GAL1- re細(xì)胞中恢復(fù)。ST6GAL1的缺失導(dǎo)致Jurkat細(xì)胞的增殖受到抑制，通過重新引入ST6GAL1, Jurkat細(xì)胞的增殖得以恢復(fù)(圖5E)。Jurkat-shST6GAL1細(xì)胞的細(xì)胞聚集被抑制，但在Jurkat-shST6GAL1- re細(xì)胞中恢復(fù)(圖5F)。在Jurkat-shST6GAL1細(xì)胞中，CD69+細(xì)胞的數(shù)量被抑制，并通過重新引入ST6GAL1恢復(fù)(圖5G)。

圖5、ST6GAL1基因在體外抑制CD4+ t細(xì)胞的增殖和活化

6、ST6GAL1基因的消融抑制t細(xì)胞受體(TCR)向脂筏的易位并減弱CD4+ t細(xì)胞中TCR信號傳導(dǎo)

在對t細(xì)胞激活的反應(yīng)中，TCR與脂質(zhì)筏相關(guān)，脂質(zhì)筏作為信號傳導(dǎo)和運(yùn)輸?shù)钠脚_。作者首先使用質(zhì)譜法測定了CD4+ T細(xì)胞TCR的n -聚糖譜。在TCR中鑒定出含有單、二、三或四半乳糖的唾液化n -聚糖。在ST6GAL1?/- CD4+ t細(xì)胞中，TCR上n -聚糖的2,6-唾液?；幌Ｓ霉簿劢癸@微鏡觀察抗CD3/CD28刺激后CD4+ T細(xì)胞表面TCR的分布。Flotillin-1是脂筏的標(biāo)志物，對脂筏的結(jié)構(gòu)和功能有重要影響。ST6GAL1的消融抑制了脂筏的形成，Flotillin -1的低表達(dá)證明了這一點(diǎn)(圖6A,B)。與ST6GAL1+/+ CD4+ T細(xì)胞相比，ST6GAL1?/- CD4+ T細(xì)胞中脂筏中TCR的水平降低，重新引入ST6GAL1可以恢復(fù)這些影響(圖6A)。作者檢測了抗CD3 /CD28刺激后的TCR信號通路。ST6GAL1基因的消融抑制了TCR下游的Zap70、p38和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)的磷酸化(圖6C)。NF-B (p65)在ST6GAL1?/- CD4+ t細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)(圖6C)。此外，ST6GAL1的缺失抑制了p-p65在CD4+ T細(xì)胞中的核易位。NF-B的激活往往會誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而誘發(fā)UC，因此作者分析了NF-B與ST6GAL1之間的相互作用。染色質(zhì)免疫沉淀-實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(ChIP-qPCR)顯示NF-B可以結(jié)合ST6GAL1啟動子上游的- 129至- 109堿基對(bp)。與ST6GAL1+/+ CD4+ T細(xì)胞相比，在ST6GAL1?/- CD4+ T細(xì)胞中，NF-B與ST6GAL1的相互作用被抑制(圖6D)。為了進(jìn)一步研究ST6GAL1在T細(xì)胞活化過程中的作用，作者使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了ST6GAL1+/+和ST6GAL1?/- CD4+ T細(xì)胞中的基因表達(dá)。與ST6GAL1+/+ CD4+ T細(xì)胞相比，ST6GAL1?/?CD4+ T細(xì)胞顯示555個下調(diào)基因和551個上調(diào)基因。氧化石墨烯分析顯示，ST6GAL1的缺失抑制CD4+ T細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)(圖6E)。京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析顯示，ST6GAL1的缺失下調(diào)了多個信號分子的表達(dá)，如TCR、NFB、IL-17、TNF和PI3K-AKT(圖6F)。相反，組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，UC患者的TNF、IL-17、NF-B和PI3K-AKT通路增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，ST6GAL1通過調(diào)節(jié)TCR、NF-B等信號通路影響CD4+ T細(xì)胞的活化。ST6GAL1的缺失抑制了Jurkat-shST6GAL1細(xì)胞中TCR的表達(dá)和脂質(zhì)筏的形成，這種抑制可以通過將ST6GAL1重新引入Jurkat-shST6GAL1細(xì)胞來恢復(fù)。免疫印跡結(jié)果與免疫熒光結(jié)果一致。在Jurkat-shST6GAL1細(xì)胞中，ST6GAL1的缺失抑制了Zap70、p38和ERK的磷酸化，并下調(diào)了NF-B的表達(dá)，這些變化在Jurkat-shST6GAL1- re細(xì)胞中得以恢復(fù)。CHIP-qPCR分析顯示，NF-B在Jurkat細(xì)胞系和CD4+ T細(xì)胞中與ST6GAL1啟動子上游區(qū)域的- 129至- 109 bp位置結(jié)合。作者通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析分析ST6GAL1基因?qū)?span style="-webkit-tap-highlight-color: rgba(0, 0, 0, 0)">Jurkat細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。與Jurkatshctl細(xì)胞相比，850個基因表達(dá)上調(diào)，1590個基因表達(dá)下調(diào)。氧化石墨烯分析顯示，ST6GAL1基因敲低可降低T細(xì)胞活化、細(xì)胞表面受體信號傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)和其他生物學(xué)功能KEGG分析顯示，ST6GAL1基因沉默降低了TCR、TNF-、IL-17、細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix, ECM)和其他信號通路。

圖6、ST6GAL1基因的消融可抑制TCR向脂筏的易位，并減弱CD4+ t細(xì)胞中的TCR信號傳導(dǎo)

7、ST6GAL1與NF-B在UC發(fā)病中呈正相關(guān)

為了研究ST6GAL1與NF-B在UC發(fā)病機(jī)制中的相關(guān)性，作者檢索了GEO數(shù)據(jù)庫中GSE179285的數(shù)據(jù)。UC患者結(jié)腸中ST6GAL1和NF-B的表達(dá)水平較HCs升高(圖7A)。Spearman相關(guān)分析顯示，UC和HCs患者中ST6GAL1與NF-B呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證NF-B與ST6GAL1的相關(guān)性，作者采用RT-qPCR檢測了13名健康志愿者和14名UC患者結(jié)腸組織中NF-B和ST6GAL1的mRNA水平。UC組NF-B和ST6GAL1的表達(dá)明顯升高(圖7B)，二者表達(dá)呈正相關(guān)(圖7C、D)。作者使用雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了ST6GAL1和NF-B之間的相互作用。NF-B結(jié)合到ST6GAL1基因的啟動子區(qū)域并啟動轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致熒光素酶活性顯著增加(圖7E)，表明NF-B與ST6GAL1基因表達(dá)呈強(qiáng)正相關(guān)。此外，NF-B和ST6GAL1的表達(dá)與UC的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(圖7F,G)，這表明NF-B和ST6GAL1抑制劑的開發(fā)可能有助于治療UC。

圖7、ST6GAL1在UC發(fā)病過程中與NF-B呈正相關(guān)

結(jié)論

T細(xì)胞活化伴隨著糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶及其底物的差異表達(dá)，這些差異在調(diào)節(jié)t細(xì)胞應(yīng)答中起著直接而有力的作用。ST6GAL1缺乏可抑制TCR的2,6-唾液化，抑制TCR進(jìn)入CD4+ t細(xì)胞脂筏，減弱TCR信號強(qiáng)度，進(jìn)一步下調(diào)NF-B的表達(dá)，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕UC。ST6GAL1可調(diào)節(jié)多種糖蛋白的生物學(xué)功能;因此，2,6-唾液化蛋白的廣泛變化使得很難確定ST6GAL1在單個糖基化蛋白激活T細(xì)胞中的作用。然而，我們的觀察結(jié)果顯示UC的發(fā)病機(jī)制部分負(fù)責(zé)與CD4+ T細(xì)胞中ST6GAL1高表達(dá)相關(guān)的功能改變，這是UC臨床治療的潛在新靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法

CRISPR-CAS9、慢病毒轉(zhuǎn)染、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、雙熒光素酶報(bào)告基因測定

參考文獻(xiàn)

Fan Q, Li M, Zhao W, Zhang K, Li M, Li W. Hyper α2,6-Sialylation Promotes CD4+ T-Cell Activation and Induces the Occurrence of Ulcerative Colitis. Adv Sci (Weinh). 2023 Sep;10(26):e2302607. doi: 10.1002/advs.202302607. Epub 2023 Jul 9. PMID: 37424034; PMCID: PMC10502867.