急性缺血誘導(dǎo)空間和轉(zhuǎn)錄上不同的小膠質(zhì)細(xì)胞亞群

         缺血性卒中后，缺血核心和梗死灶周圍區(qū)的損傷影響患者預(yù)后。微膠質(zhì)細(xì)胞立即對(duì)缺血性打擊做出反應(yīng)，引發(fā)免疫炎癥，在卒中后的細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要作用。然而，微膠質(zhì)細(xì)胞的多樣性和涉及的機(jī)制仍然不清楚。我們首先對(duì)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠大腦進(jìn)行了scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST），以確定與卒中相關(guān)的微膠質(zhì)細(xì)胞亞簇及其空間分布。此外，通過(guò)RNAscope和免疫熒光技術(shù)在大鼠中驗(yàn)證了微膠質(zhì)細(xì)胞亞群特異性標(biāo)記基因的表達(dá)和不同微膠質(zhì)細(xì)胞亞群的定位。進(jìn)行基因集變異分析（GSVA）以揭示微膠質(zhì)細(xì)胞亞群的功能特征。此外，使用調(diào)查通路分析（IPA）來(lái)探索微膠質(zhì)細(xì)胞亞群的上游調(diào)控因子，通過(guò)免疫熒光、RT-qPCR、shRNA介導(dǎo)的基因敲除和定向代謝組學(xué)進(jìn)行確認(rèn)。最后，在特定微膠質(zhì)細(xì)胞亞群操縱后，評(píng)估大鼠MCAO模型中的梗死灶大小、神經(jīng)功能缺陷和神經(jīng)元凋亡。我們?cè)?span>MCAO大鼠大腦中發(fā)現(xiàn)了與卒中相關(guān)的微膠質(zhì)細(xì)胞亞群。我們還確定了這些微膠質(zhì)細(xì)胞亞群的新標(biāo)記基因，并根據(jù)它們的空間分布將這些細(xì)胞定義為缺血性核心相關(guān)（ICAM）和梗死灶相關(guān)（IPAM）的微膠質(zhì)細(xì)胞。ICAM由損傷相關(guān)分子模式誘導(dǎo)，可能由糖酵解提供動(dòng)力，并表現(xiàn)出增加的促炎細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生。BACH1是驅(qū)動(dòng)ICAM生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。相反，梗死灶中富含的糖皮質(zhì)激素可能觸發(fā)IPAM的形成，這些細(xì)胞可能由檸檬酸循環(huán)和氧化磷酸化提供動(dòng)力，并以中等的促炎反應(yīng)、抗炎代謝特征和髓鞘營(yíng)養(yǎng)特性為特征。ICAM可能引起過(guò)度神經(jīng)炎癥，加劇腦損傷，而IPAM可能表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)特性，對(duì)于梗死灶中細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和存活可能至關(guān)重要。我們的研究結(jié)果為以特定微膠質(zhì)細(xì)胞亞群為靶點(diǎn)的治療策略提供了生物學(xué)基礎(chǔ)，成為缺血性卒中的潛在治療策略。該研究于2023年12月發(fā)表在《Genome medicine》，IF：12.3。

技術(shù)路線：

結(jié)果:

1、細(xì)胞類型的鑒定

         為了全面表征缺血性卒中后缺血半球主要細(xì)胞類型的變化，我們?cè)诮?jīng)歷短暫性大鼠中腦動(dòng)脈阻塞（MCAO）的大鼠的腦樣本中，采用scRNA-seq技術(shù)，在再灌注后的不同時(shí)間點(diǎn)（3小時(shí)、12小時(shí)和72小時(shí)）以及模擬大鼠上進(jìn)行了細(xì)胞分離（圖1A）。3小時(shí)和12小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)代表了缺血性卒中的亞急性階段，而72小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)被選為進(jìn)行急性階段變化的轉(zhuǎn)錄分析?？偣苍u(píng)估了39,333個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞平均含有1672-8800個(gè)獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符（UMIs），經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的CellRanger質(zhì)量控制。在四個(gè)組中，每個(gè)細(xì)胞的平均基因數(shù)為901-2636。

         接下來(lái)，我們進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督聚類，并根據(jù)經(jīng)典基因標(biāo)記表達(dá)進(jìn)行了細(xì)胞類型的注釋。如t-分布隨機(jī)鄰居嵌入（t-SNE）圖中所示，鑒定了15種不同的細(xì)胞類型，包括B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、壁細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、單核/樹(shù)突細(xì)胞（DC細(xì)胞）、成熟型寡能神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（OPC）、T細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、微膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、中性粒細(xì)胞、寡能神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和原始T細(xì)胞（圖1B）。值得注意的是，微膠質(zhì)細(xì)胞、寡能神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的大多數(shù)。我們確定了每種細(xì)胞類型的所有標(biāo)記基因，并在熱圖中顯示了前10個(gè)標(biāo)記基因（圖1C）。

         與先前的發(fā)現(xiàn)一致，缺血性打擊后浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，表明血腦屏障功能失調(diào)。此外，OPC的數(shù)量在手術(shù)后72小時(shí)顯著增加，表明中風(fēng)后OPC的增殖，這與先前的研究結(jié)果一致。我們還觀察到在缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，而在72小時(shí)時(shí)微膠質(zhì)細(xì)胞顯著減少，這可能歸因于急性缺血性損傷（圖1D）?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)提供了對(duì)缺血半球細(xì)胞組成的基本描述。

2、缺血誘導(dǎo)兩種類型的小膠質(zhì)細(xì)胞亞簇

         考慮到微膠質(zhì)細(xì)胞在大腦中的重要性和微膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的高質(zhì)量，我們將焦點(diǎn)放在了單細(xì)胞水平的微膠質(zhì)細(xì)胞上。我們?cè)诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)確定了微膠質(zhì)細(xì)胞的差異表達(dá)基因（DEGs）。與先前的研究結(jié)果一致，微膠質(zhì)細(xì)胞DEGs的KEGG分析表明，在缺血性卒中的急性階段，微膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬和炎癥能力增強(qiáng)，代謝發(fā)生改變。此外，微膠質(zhì)細(xì)胞被分為四個(gè)亞群進(jìn)行進(jìn)一步的分析（圖2A）。根據(jù)亞群比例圖，模擬組中94%的微膠質(zhì)細(xì)胞屬于亞群2。此外，微膠質(zhì)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)基因（Tmem119、P2ry12、P2ry13、Csf1r、Cx3cr1、Hexb）在亞群2中高度表達(dá)，表明亞群2可能由穩(wěn)態(tài)微膠質(zhì)細(xì)胞組成。亞群4（465個(gè)細(xì)胞）包括相對(duì)較少數(shù)量的微膠質(zhì)細(xì)胞，在模擬和MCAO大鼠之間變化不大；因此，亞群4的表型和功能特征未進(jìn)一步研究。亞群1和亞群3占據(jù)了MCAO組中微膠質(zhì)細(xì)胞的大多數(shù)。這些發(fā)現(xiàn)將亞群1和亞群3定位為缺血性卒中急性階段的關(guān)鍵角色，并提出了它們?nèi)绾螀f(xié)調(diào)缺血性攻擊適應(yīng)的問(wèn)題。

         進(jìn)行差異基因表達(dá)分析以識(shí)別亞群特異性標(biāo)記基因。大多數(shù)高表達(dá)的基因也是亞群特異性的，表明微膠質(zhì)細(xì)胞亞群具有獨(dú)特的基因表達(dá)模式（圖2B）。亞群1表達(dá)了先前未報(bào)道的標(biāo)記基因（例如，Pik3ip1、Cd300lf、Gpr65、Ms4a6c、Cep152、Ddit4、Zbtb16、Abhd15、Bmf和Arhgap24）。在亞群3中，Lgals3、Plau、Srxn1、Ankrd33b、Gas2l3、Nes、Edn1、Fam129b、Vat1和Fmn1的表達(dá)上調(diào)。前10個(gè)亞群特異性標(biāo)記基因可可靠地識(shí)別微膠質(zhì)細(xì)胞亞群1和亞群3。此外，疾病相關(guān)微膠質(zhì)細(xì)胞（DAM）曾被確定為與阿爾茨海默?。?span>AD）相關(guān)的一種獨(dú)特的微膠質(zhì)細(xì)胞亞型。我們檢查了我們數(shù)據(jù)集中已確定的DAM標(biāo)記基因的表達(dá)水平。在四個(gè)亞群中，一些基因（例如Tyrobp、Trem2、Apoe、Timp2和B2m）的表達(dá)保持不變。在亞群3中，一些基因的表達(dá)上調(diào)，例如Lgal3、Fth1、Cstb、Csf1、Cd63、Cd9、Ccl3和Lilrb4a，而與穩(wěn)態(tài)微膠質(zhì)細(xì)胞（亞群2）相比，亞群1中這些基因的表達(dá)保持不變，表明亞群3可能表現(xiàn)出DAM樣的特征。

         為了確定亞群1和亞群3是否具有時(shí)間特性，我們使用RNAscope（ACD，Newark，CA，USA）進(jìn)行了RNA-蛋白共染色，使用亞群1特異性標(biāo)記基因Gpr65和亞群3特異性標(biāo)記基因Srxn1標(biāo)記不同的微膠質(zhì)細(xì)胞群體（圖2C）。在再灌注后，亞群1和亞群3均作為對(duì)缺血性打擊的迅速反應(yīng)者（圖2D）。為了確認(rèn)亞群1和亞群3是否也存在于其他關(guān)于缺血性卒中的單細(xì)胞RNA測(cè)序研究數(shù)據(jù)中，我們重新分析了幾個(gè)現(xiàn)有的缺血性卒中后微膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)據(jù)集（GSE174574，GSE197731，GSE227651）。與我們的結(jié)果一致，亞群1和亞群3在它們的t-SNE微膠質(zhì)細(xì)胞圖中可以清晰地區(qū)分出來(lái)。

         為了確定亞群1和亞群3是否與梗死核心存在任何空間關(guān)系，我們使用了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）來(lái)研究模擬和MCAO大鼠的腦切片。盡管ST幾乎無(wú)法達(dá)到單細(xì)胞分辨率，但仍然可以通過(guò)計(jì)算與scRNA-seq數(shù)據(jù)相關(guān)的亞群特異性標(biāo)記基因的平均表達(dá)來(lái)獲得腦切片中不同細(xì)胞亞群的大致位置。為了定義缺血性核心，我們還查詢了在腦切片上每個(gè)點(diǎn)的下調(diào)表明神經(jīng)元喪失的神經(jīng)元基因。引人注目的是，亞群3標(biāo)記基因占據(jù)了缺血性核心，而亞群1標(biāo)記基因則環(huán)繞著缺血病灶在缺血后12小時(shí)（圖2E）。因此，我們將亞群1定義為缺血性梗死后的微膠質(zhì)細(xì)胞（IPAM），將亞群3定義為缺血性梗死核心相關(guān)的微膠質(zhì)細(xì)胞（ICAM）。

         為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，我們?cè)诿庖邿晒鈱?shí)驗(yàn)中使用ICAM特異性的LGALS3作為ICAM標(biāo)記，而選擇PIK3IP1作為IPAM標(biāo)記。在12小時(shí)和72小時(shí)時(shí)，ICAM標(biāo)記在缺血性核心中顯著富集。IPAM標(biāo)記在12小時(shí)時(shí)在缺血性梗死灶周圍的位置也得到了確認(rèn)。此外，ICAM特異性標(biāo)記（Lgals3）和IPAM特異性標(biāo)記（Pik3ip1、Gpr65和Ms4a6c）也在ST中可視化顯示。我們還根據(jù)圖2E將腦切片分為兩個(gè)區(qū)域（缺血性核心和梗死周圍區(qū)）。在缺血性核心中上調(diào)的基因被定義為缺血性核心基因（ICGs），而在梗死周圍上調(diào)的基因被稱為缺血性梗死周圍基因（IPGs）。與ICGs重疊的ICAM標(biāo)記更多，與IPGs重疊的IPAM標(biāo)記也更多，進(jìn)一步驗(yàn)證了ICAM和IPAM的空間分布。因此，我們的數(shù)據(jù)揭示了兩個(gè)在缺血性卒中應(yīng)答中涉及的在空間上和轉(zhuǎn)錄上具有不同特性的微膠質(zhì)細(xì)胞亞群。

3、ICAM 和 IPAM 表現(xiàn)出截然不同的特征

         對(duì)于功能實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)IPAM和ICAM進(jìn)行了基因集變異分析（GSVA）（圖3A）。我們發(fā)現(xiàn)ICAM可能在代謝上更依賴于糖酵解，而IPAM可能依賴于三羧酸循環(huán)（TCA）和氧化磷酸化（OXPHOS），通過(guò)使用Seurat中的AddModuleScore 計(jì)算與感興趣的代謝途徑相關(guān)的基因的表達(dá)來(lái)證實(shí)（圖3A、B）。一致地，“氧化磷酸化”和“檸檬酸循環(huán)”在IPG中也富集，如KEGG分析所示。ICAM中“斷裂”的TCA循環(huán)也可能導(dǎo)致中間產(chǎn)物水平的增加，如ICAM中增強(qiáng)的泛酮酸和輔酶A生物合成所示。此外，在IPAM中觀察到AMPK和cAMP信號(hào)通路的上調(diào)，表明IPAM使用了完全不同的能源來(lái)源（圖3A）。此外，微膠質(zhì)細(xì)胞的代謝重編程依賴于HIF-1α通路，ICAM中HIF-1α通路也高度表達(dá)（圖3A）。

         我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)相對(duì)于其他亞群，ICAM中存在一些促炎和炎癥響應(yīng)基因（Il1a、Il1b、Il6、Il18、Tnf、Hmox1、Ptgs2）的表達(dá)上調(diào)（圖3C）。此外，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在MCAO后12小時(shí)開(kāi)始浸潤(rùn)大腦，并在72小時(shí)時(shí)聚集在梗死核心，這表明這些外周免疫細(xì)胞在空間上與ICAM存在重疊。由于微膠質(zhì)細(xì)胞是缺血性卒中中各種趨化因子的主要來(lái)源，我們檢查了ICAM和IPAM中驅(qū)動(dòng)不同外周免疫細(xì)胞招募的一系列趨化因子的表達(dá)。因此，ICAM中富集了不同外周免疫細(xì)胞中相關(guān)趨化因子基因集的表達(dá)（圖3D）。具體而言，與IPAM相比，ICAM中Ccl2、Ccl3、Ccl4、Ccl5、Cxcl2和Cxcl16的表達(dá)水平更高。此外，KEGG分析一致表明，促炎信號(hào)通路（“TNF信號(hào)通路”、“IL-17信號(hào)通路”、“MAPK信號(hào)通路”）在ICG中顯著富集。這些發(fā)現(xiàn)表明由ICAM介導(dǎo)的過(guò)度促炎和趨化反應(yīng)，提示ICAM可能在缺血性卒中急性階段加速組織損傷，具有不利影響。

         此外，與ICAM相比，GSVA分析顯示，IPAM中與氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物相關(guān)的幾個(gè)代謝途徑顯著富集（圖3A）。支鏈氨基酸（BCAAs）如纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的水平在ICAM中升高，而在IPAM中BCAAs降解被增強(qiáng)（圖3E）。此外，IPAM中其他氨基酸的代謝，如?；撬?，也富集（圖3A）。根據(jù)GSVA數(shù)據(jù)，脂質(zhì)代謝在IPAM中也很活躍，包括鞘脂代謝、主要膽酸生物合成、不飽和脂肪酸生物合成、脂肪酸降解和延長(zhǎng)，通過(guò)AddModuleScore確認(rèn)（圖3A，3E）。此外，IPAM中富集的代謝途徑（“BCAAs降解”、“不飽和脂肪酸生物合成”、“脂肪酸降解”、“脂肪酸延長(zhǎng)”、“鞘脂代謝”）在ST中也顯示了一個(gè)梗死周圍的分布。

         由于脂質(zhì)代謝產(chǎn)物是髓鞘的重要組成部分，IPAM可能通過(guò)供應(yīng)脂質(zhì)組分來(lái)補(bǔ)償寡突細(xì)胞。此外，我們使用CellPhoneDB 分析了IPAM-寡突細(xì)胞相互作用中的配體-受體相互作用。已經(jīng)確定了幾對(duì)配體-受體對(duì)，其中GRN-SORT1是其中最顯著的一對(duì)。為了測(cè)試GRN是否具有寡突細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)的潛力，我們用重組小鼠GRN（rmGRN）處理寡突細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)rmGRN顯著促進(jìn)了MAG的表達(dá)。

         總的來(lái)說(shuō)，這些獨(dú)特的特征至少在一定程度上塑造了微膠質(zhì)細(xì)胞的應(yīng)答，并為理解微膠質(zhì)細(xì)胞亞群在對(duì)缺血刺激的響應(yīng)中不同的激活狀態(tài)提供了新的視角。

4、M1/M2 二分法無(wú)法對(duì)缺血后的小膠質(zhì)細(xì)胞亞簇進(jìn)行分類

         在歷史上，基于體外刺激，微膠質(zhì)細(xì)胞曾經(jīng)簡(jiǎn)單地被分類為促炎性的“M1”和抗炎性的“M2”。然而，根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，M1極化評(píng)分的增加總是伴隨著不同時(shí)間點(diǎn)上升的M2極化評(píng)分（圖4A）。我們想知道我們的無(wú)監(jiān)督聚類是否與這種表型分類相對(duì)應(yīng)。為了測(cè)試這個(gè)假設(shè)，我們分別在IPAM和ICAM上執(zhí)行了M1/M2極化評(píng)分。然而，ICAM的M1和M2極化評(píng)分都高于IPAM（圖4B-D）。此外，IPAM和ICAM在缺血損傷后的不同時(shí)間點(diǎn)上展現(xiàn)出相同的M1/M2極化改變趨勢(shì)（圖4E-F）。

         接下來(lái)，我們還進(jìn)行了偽時(shí)軌跡分析，并觀察到在缺血后出現(xiàn)了明顯的分歧軌跡。為了闡明這兩個(gè)分支是否與M1-和M2-表型微膠質(zhì)細(xì)胞一致，我們檢查了不同軌跡中M1/M2標(biāo)記基因的表達(dá)。在這兩個(gè)分支之間，M1/M2標(biāo)記基因的表達(dá)仍然沒(méi)有顯著差異（圖4G）。基于許多關(guān)于M1/2微膠質(zhì)細(xì)胞的已發(fā)表的體內(nèi)研究，我們注意到研究人員使用Iba-1，這不僅在微膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而且在巨噬細(xì)胞中也表達(dá)，作為微膠質(zhì)標(biāo)記。他們還使用CD86和CD16（由Fcgr4編碼）標(biāo)記“M1”微膠質(zhì)細(xì)胞，使用Arg1和CD206（由Mrc1編碼）標(biāo)記“M2”微膠質(zhì)細(xì)胞。然而，根據(jù)我們的scRNA-seq數(shù)據(jù)，“M1”微膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（Cd86和Fcgr4）在微膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均有表達(dá)，而“M2”微膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（Arg1和Mrc1）主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，表明滲透的巨噬細(xì)胞可能被錯(cuò)誤地認(rèn)定為經(jīng)典定義的“M2”微膠質(zhì)細(xì)胞（圖4H）。因此，M1/M2的二分法可能無(wú)法識(shí)別不同的微膠質(zhì)細(xì)胞亞群，并描繪它們?cè)谌毖蟮墓δ堋?/span>

5、關(guān)鍵 DAMP 和調(diào)節(jié)子驅(qū)動(dòng) ICAM 生成

         我們假設(shè)區(qū)域微環(huán)境信號(hào)可能驅(qū)動(dòng)微膠質(zhì)細(xì)胞代謝和功能的轉(zhuǎn)變，使其朝著ICAM和IPAM方向發(fā)展。通過(guò)使用Ingenuity System Pathway Analysis（IPA）軟件（QIAGEN），我們發(fā)現(xiàn)脂多糖（LPS）是推動(dòng)ICAM生成的最重要的潛在因素之一（圖5A）。由于LPS是TLR4激活的經(jīng)典配體，我們調(diào)查了在腦缺血后釋放的TLR4內(nèi)源性配體HMGB1的空間分布。在MCAO后的12小時(shí)內(nèi)，在梗死核內(nèi)受損神經(jīng)元內(nèi)明顯出現(xiàn)HMGB1的胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，這表明HMGB1，作為一種被廣泛認(rèn)識(shí)的損傷相關(guān)分子模式（DAMP），在梗死核釋放并可能驅(qū)動(dòng)ICAM的形成（圖5B）。我們發(fā)現(xiàn)在LPS刺激后，大多數(shù)ICAM特異性標(biāo)記基因在初級(jí)微膠質(zhì)細(xì)胞中顯著上調(diào)，而IPAM標(biāo)志基因的表達(dá)變化較?。▓D5C，D）。為了調(diào)查垂死神經(jīng)元釋放的DAMP是否誘導(dǎo)ICAM的生成，我們還通過(guò)多次凍融小鼠神經(jīng)細(xì)胞系HT-22制備了神經(jīng)源性的DAMP，如先前描述的 。結(jié)果表明，處理HT-22源DAMP的初級(jí)微膠質(zhì)細(xì)胞顯著上調(diào)了ICAM標(biāo)記基因，而IPAM標(biāo)記沒(méi)有顯著差異。

         除了細(xì)胞外的微環(huán)境信號(hào)外，我們還研究了哪些細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子驅(qū)動(dòng)ICAM的生成。使用單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷和聚類（SCENIC）分析 來(lái)闡明缺血性卒中后微膠質(zhì)細(xì)胞亞群形成的關(guān)鍵分子機(jī)制。通過(guò)全面考慮調(diào)控子活性評(píng)分（RAS）和調(diào)控子特異性評(píng)分（RSS），我們確定FOSL1和BACH1是最強(qiáng)大的ICAM特異性轉(zhuǎn)錄因子（TFs）之一（圖5E，F）。研究表明，在ST中，Fosl1在急性缺血后在缺血區(qū)域上調(diào)和富集。此外，BACH1下游靶基因的富集分析（使用Metascape）發(fā)現(xiàn)它們與炎癥顯著相關(guān)（例如，“細(xì)胞遷移的正調(diào)控”，“MAPK級(jí)聯(lián)的正調(diào)控”，“TNF-α NF-κB信號(hào)通路”，“細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控”，“MyD88無(wú)依賴TLR4級(jí)聯(lián)”，“IL-17信號(hào)通路”，“對(duì)氧化應(yīng)激的應(yīng)答”和“模式識(shí)別受體信號(hào)通路”），這與ICAM的促炎作用一致。為了驗(yàn)證BACH1對(duì)ICAM的調(diào)控能力，我們轉(zhuǎn)染了攜帶靶向Bach1的短發(fā)夾RNA（shRNA）的慢病毒的BV2細(xì)胞。Bach1-knockdown在LPS刺激后下調(diào)了ICAM特異性標(biāo)記基因（Edn1，Plau）的表達(dá)水平，表明BACH1有潛力將穩(wěn)態(tài)微膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為ICAM。此外，LPS刺激后，經(jīng)典的促炎因子，包括Tnf，Il1a，Il6和Il1b，在Bach1-knockdown細(xì)胞中也下調(diào)了（圖5G-J）。

6、糖皮質(zhì)激素觸發(fā) IPAM 形成

         為了識(shí)別IPAM的關(guān)鍵上游調(diào)控因子，使用了前200個(gè)IPAM標(biāo)記基因進(jìn)行IPA。令人驚訝的是，地塞米松（DEX）是誘導(dǎo)IPAM最強(qiáng)大的刺激因素（圖6A）。為了探索中風(fēng)后糖皮質(zhì)激素濃度的變化，我們進(jìn)一步利用高通量靶向代謝組學(xué)來(lái)篩選在缺血后顯示變化的類固醇。根據(jù)定量數(shù)據(jù)，皮質(zhì)酮和11-去氧皮質(zhì)酮的水平在MCAO后在缺血核心和梗死周圍區(qū)域均顯著增加（圖6B）。為了驗(yàn)證，我們使用DEX刺激初級(jí)微膠質(zhì)細(xì)胞，強(qiáng)烈誘導(dǎo)了IPAM的生成，并顯著增強(qiáng)了IPAM特異性標(biāo)記基因的表達(dá)（圖6C）。此外，小鼠主要的腎上腺皮質(zhì)類固醇皮質(zhì)酮也顯著上調(diào)了初級(jí)微膠質(zhì)細(xì)胞中IPAM特異性標(biāo)記基因的表達(dá)，表明糖皮質(zhì)激素具有推動(dòng)IPAM生成的強(qiáng)大能力（圖6D）。

         為了在小鼠中驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，對(duì)MCAO小鼠進(jìn)行了皮質(zhì)酮或糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑（RU486）的處理。令人驚訝的是，接受皮質(zhì)酮處理的MCAO小鼠顯示出相對(duì)較輕的神經(jīng)功能缺陷（圖6E-I）和減少的神經(jīng)元凋亡（圖6J，K）。然而，在小鼠中RU486的投與導(dǎo)致更嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺陷（圖6E-I）和加劇的神經(jīng)元死亡（圖6J，K）。

         為了在不同實(shí)驗(yàn)組中研究IPAM的變化，我們采用了免疫染色并測(cè)量了微膠質(zhì)細(xì)胞中PIK3IP1的表達(dá)。與對(duì)照組相比，PIK3IP1的平均熒光強(qiáng)度在皮質(zhì)酮處理組中顯著更高，而在RU486處理組中相對(duì)較低（圖6L，M）。因此，這些體外和體內(nèi)的發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證了糖皮質(zhì)激素在推動(dòng)IPAM生成以及在缺血性卒中的急性階段中IPAM的神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)中的決定性作用。

實(shí)驗(yàn)方法：

         慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、梗塞體積測(cè)量、神經(jīng)行為測(cè)試、t-SNE 降維、scRNA-seq、GSVA、偽時(shí)間分析、軌跡推斷、SCENIC、TUNEL染色、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、實(shí)時(shí)定量 PCR、Western blot、RNAscope、靶向代謝組學(xué)。

參考文獻(xiàn)：

         Li, H., Liu, P., Zhang, B. et al. Acute ischemia induces spatially and transcriptionally distinct microglial subclusters. Genome Med 15, 109 (2023).