T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)癌細(xì)胞分泌半乳凝素-9，與其他免疫檢查點(diǎn)蛋白合作，促進(jìn)免疫抑制

         半乳糖凝集素-9是凝集素蛋白家族的一員，對(duì)人體免疫反應(yīng)起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，特別是因?yàn)樗哂幸种?span>T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞抗癌活性的能力。最近的證據(jù)表明，半乳糖凝集素-9在廣泛的人類惡性腫瘤中高表達(dá)，包括最具侵襲性的腫瘤，如高級(jí)別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和胰腺導(dǎo)管腺癌，以及常見(jiàn)的惡性腫瘤，如乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌。然而，實(shí)體腫瘤細(xì)胞要么分泌極少量的半凝集素-9，要么在大多數(shù)情況下根本不分泌它。作者的目的是闡明T細(xì)胞是否可以誘導(dǎo)來(lái)自實(shí)體惡性腫瘤的人類癌細(xì)胞分泌半乳糖凝集素-9，以及與細(xì)胞表面蛋白相比，這種可溶性形式是否表現(xiàn)出更高的全身免疫抑制活性。作者的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了半乳糖凝集素-9在抗癌免疫逃避中的關(guān)鍵作用。因此，半乳糖凝集素-9和控制其產(chǎn)生的調(diào)控途徑應(yīng)被視為大量癌癥免疫治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。該文發(fā)布于2023年1月《Journal of ImmunoTherapy of Cancer》,IF=10.9。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、T淋巴細(xì)胞激活源自實(shí)體惡性腫瘤的人癌細(xì)胞的半乳糖凝集素-9分泌

         作者研究了T細(xì)胞是否能誘導(dǎo)來(lái)自實(shí)體惡性腫瘤的人癌細(xì)胞分泌半乳糖凝集素-9。作者研究了那些自身不分泌半乳糖凝集素-9的細(xì)胞和那些分泌少量這種蛋白質(zhì)的細(xì)胞。此外，作者還測(cè)試了非惡性快速增殖的人類細(xì)胞，包括HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞和原代人類胚胎細(xì)胞。所有被測(cè)試的細(xì)胞都清晰地表達(dá)了可檢測(cè)到的且通常含量很高的半凝集素-9。腫瘤細(xì)胞模型選用MCF-7乳腺癌細(xì)胞、WT3ab Wilms腫瘤細(xì)胞、G401腎橫紋肌樣腫瘤細(xì)胞和LN-18高級(jí)別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。所有細(xì)胞與Jurkat T細(xì)胞按1:1的比例共培養(yǎng)16小時(shí)。然后分離Jurkat T細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基洗滌2-3次，然后用各自的細(xì)胞特異性培養(yǎng)基孵育共培養(yǎng)的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)，分別于2、3、4小時(shí)檢測(cè)半凝集素-9的分泌。分離后，Jurkat T細(xì)胞分泌的半凝集素-9幾乎無(wú)法檢測(cè)到。人類癌細(xì)胞分泌高水平的半乳糖凝集素-9,HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞分泌較少，人類胎兒細(xì)胞產(chǎn)生幾乎無(wú)法檢測(cè)到的蛋白質(zhì)(圖1A)。作者早期的研究證實(shí)了半乳糖凝集素-9在MCF-7、WT3ab、HaCaT和原代人胚胎細(xì)胞中的表達(dá)。然后作者研究了不同類型的T細(xì)胞是否能誘導(dǎo)半乳糖凝集素-9的分泌。為了進(jìn)行比較，作者將MCF-7人乳腺癌細(xì)胞與Jurkat T細(xì)胞(cd4陽(yáng)性)、TALL-104細(xì)胞毒性(cd8陽(yáng)性)淋巴細(xì)胞以及原代人cd3陽(yáng)性T細(xì)胞共培養(yǎng)。所有共培養(yǎng)按1:1的比例進(jìn)行16小時(shí)，然后按上述方法處理。分離后，所研究的T細(xì)胞均未分泌半乳糖凝集素-9 (Jurkat T細(xì)胞除外，其分泌量幾乎無(wú)法檢測(cè)到(<100 pg/mL))。然而，在所有三種情況下，MCF-7細(xì)胞都分泌大量的半凝集素-9(圖1B)。如上所述，在所研究的貼壁細(xì)胞中，在沒(méi)有T淋巴細(xì)胞的情況下，只有LN-18能夠在靜止?fàn)顟B(tài)下分泌可檢測(cè)到(但含量很低)的半凝集素-9(圖1C)。然后作者研究了CD4或CD8蛋白是否參與T細(xì)胞誘導(dǎo)的半凝集素-9分泌。作者將原代人T細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞在CD4或CD8中和抗體存在或不存在的情況下共培養(yǎng)16小時(shí)。然后，如上所述，分離T細(xì)胞，然后在條件培養(yǎng)基中測(cè)量培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞在2、3和4小時(shí)后釋放的半凝集素-9水平。在MCF-7和原代人T細(xì)胞共培養(yǎng)16小時(shí)的培養(yǎng)基中也測(cè)量了半乳糖凝集素-9。細(xì)胞上Western分析證實(shí)了抗CD4和抗CD8與原代T細(xì)胞的結(jié)合。作者發(fā)現(xiàn)這兩種抗體都不能顯著減少t細(xì)胞誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞中半乳糖凝集素-9的分泌，這表明CD4和CD8不太可能參與這一過(guò)程。然而，由于作者看到抗CD8抗體引起的效果略有降低，作者將高活性的LN-18膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞與Jurkat T(僅表達(dá)CD4而不表達(dá)CD8蛋白)細(xì)胞共培養(yǎng)16小時(shí)，如上所述。然后分離Jurkat T細(xì)胞，LN-18細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)，2小時(shí)、3小時(shí)和4小時(shí)后在條件培養(yǎng)基中測(cè)量半凝集素-9水平。在LN-18和Jurkat T細(xì)胞共培養(yǎng)16小時(shí)的培養(yǎng)基中也測(cè)量了半乳糖凝集素-9。作者證實(shí)抗cd4在Jurkat T細(xì)胞上高表達(dá)，而使用細(xì)胞上的Western分析幾乎檢測(cè)不到抗cd8。此外，作者用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量了共培養(yǎng)后Jurkat T細(xì)胞中的CD4和CD8，發(fā)現(xiàn)它們CD4陽(yáng)性，而CD8水平幾乎無(wú)法檢測(cè)到。CD4和CD8中和抗體對(duì)T細(xì)胞誘導(dǎo)的LN-18細(xì)胞半凝集素-9分泌無(wú)影響。在抗cd8抗體存在的情況下，觀察到半乳糖凝集素-9分泌非常輕微(不顯著)的減少，與MCF-7細(xì)胞相似。然而，由于Jurkat T細(xì)胞中缺乏CD8表達(dá)，這不太可能是特異性的。重要的是，FACS分析證實(shí)共培養(yǎng)后LN18細(xì)胞中沒(méi)有任何CD4的痕跡。MCF-7細(xì)胞只表達(dá)一種半乳糖凝集素-9結(jié)合受體- Tim-3,16 16 WT3ab細(xì)胞只表達(dá)T細(xì)胞活化抑制因子(VISTA)蛋白和微量的Tim-3,16而LN-18細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Tim-3和VISTA。作者評(píng)估了半乳糖凝集素-9是否在復(fù)合物中與其受體片段一起釋放，這些片段可以作為該蛋白的載體/轉(zhuǎn)運(yùn)者。作者免疫沉淀半乳糖凝集素-9，在不煮沸樣品的情況下使用Western blot分析檢測(cè)。當(dāng)MCF-7細(xì)胞與Jurkat T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，這導(dǎo)致半乳糖凝集素-9以Tim-3片段復(fù)合物的形式分泌(圖2A)。然而，在WT3ab細(xì)胞中，它以與VISTA片段復(fù)合物的形式分泌(圖2B)。與Tim-3不同，VISTA在SDS-PAGE電泳中與半乳糖凝集素-9分離，證實(shí)了作者之前報(bào)道的Tim-3與VISTA相比對(duì)半乳糖凝集素-9具有更高親和力的發(fā)現(xiàn)。這兩種受體都存在于LN-18中，其中Tim-3是半乳糖凝集素-9的載體(圖2C)，這與作者之前對(duì)同樣表達(dá)Tim-3和VISTA受體的原代人胚胎細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)一致，作者希望評(píng)估MCF-7和細(xì)胞毒性TALL-104細(xì)胞之間的相互作用，以發(fā)現(xiàn)MCF-7衍生的半凝集素-9是否能夠調(diào)理細(xì)胞毒性T細(xì)胞。MCF-7和TALL-104細(xì)胞按1:1的比例共培養(yǎng)，然后按上述方法分離。裂解TALL-104細(xì)胞，從靜止的TALL-104裂解物中裝載約50-60μg/孔的細(xì)胞總蛋白，用于Western blot檢測(cè)半乳糖凝集素-9(這些細(xì)胞表達(dá)低量的半乳糖凝集素-9和Tim-3)。然后，作者在與T細(xì)胞共培養(yǎng)后裂解的TALL-104細(xì)胞中加載較少的蛋白(約15μg/孔)。結(jié)果，在與MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)的TALL104細(xì)胞的裂解物中，作者觀察到抗tim -3和抗半乳糖凝集素-9抗體均可檢測(cè)到約52 kDa的條帶(圖3A)。這與MCF-7細(xì)胞分泌的半乳糖凝集素-9相對(duì)應(yīng)(圖3B)，在半乳糖凝集素-9免疫沉淀后的培養(yǎng)基中檢測(cè)到。重要的是，該復(fù)合物對(duì)TALL-104細(xì)胞表面受體的親和力低于對(duì)運(yùn)輸它的Tim-3的親和力。作者可以排除這不是TALL104細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)部復(fù)合物，因?yàn)橐阎搩?nèi)部復(fù)合物在Tim-3脫落前的分子量約為70 kDa。另外，作者發(fā)現(xiàn)TALL-104與MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)后，半凝集素-9 mRNA水平顯著下調(diào)。VISTA mRNA水平也有相同的觀察結(jié)果，而Tim-3 mRNA水平顯著上調(diào)(詳見(jiàn)圖3C)。在MCF-7細(xì)胞中，Tim-3和半乳糖凝集素-9 mRNA水平均顯著上調(diào)(圖3D)。同時(shí)，TALL-104細(xì)胞相對(duì)不能將顆粒酶B傳遞到MCF-7細(xì)胞中(圖3E, F)，這與作者之前的觀察結(jié)果一致。

圖1、T細(xì)胞誘導(dǎo)來(lái)自實(shí)體惡性腫瘤和角質(zhì)形成細(xì)胞的人癌細(xì)胞分泌半凝集素-9

圖2、Tim-3或VISTA在分泌過(guò)程中干擾半乳糖凝集素-9

圖3、實(shí)體腫瘤細(xì)胞來(lái)源的半乳糖凝集素-9與細(xì)胞毒性T細(xì)胞相互作用。MCF-7人乳腺癌細(xì)胞與TALL-104按1:1的比例共培養(yǎng)16小時(shí)

2、來(lái)源于實(shí)體惡性腫瘤的人癌細(xì)胞在T細(xì)胞誘導(dǎo)下有兩種半乳糖凝集素-9分泌機(jī)制

         作者考慮了來(lái)自實(shí)體惡性腫瘤的人類癌細(xì)胞T細(xì)胞誘導(dǎo)半乳糖凝集素-9分泌的兩種不同機(jī)制的可能性。作者將MCF-7和Jurkat T細(xì)胞按1:1的比例共培養(yǎng)16小時(shí)，然后如上所述分離它們，隨后將MCF-7細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時(shí)，在2、3和4小時(shí)時(shí)測(cè)量半凝集素-9的分泌。細(xì)胞在不同抑制劑存在或不存在的情況下共培養(yǎng)。其中包括U73122 (PLC抑制劑)、G?6983 (PKC抑制劑)、液泡素-1(溶酶體胞吐抑制劑)、AZD2014 (mTOR抑制劑)、EDTA(基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑)和含有溶酶體蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶阻滯劑的蛋白酶抑制劑混合物(PIC)(圖4A)。作者發(fā)現(xiàn)G?6983、液泡素-1、EDTA和PIC下調(diào)分泌(圖4B)。AZD2014上調(diào)了這種分泌，這表明它是自噬依賴性溶酶體分泌(液泡素-1的抑制作用證實(shí)了這一點(diǎn))，而不像AML細(xì)胞中半乳糖凝集素-9的分泌是自噬依賴性的。這些結(jié)果表明半乳糖凝集素-9的分泌有兩種機(jī)制。第一個(gè)是該蛋白易位到細(xì)胞表面，然后通過(guò)基質(zhì)金屬蛋白酶(如AML細(xì)胞)從細(xì)胞表面脫落。另一種是自噬體的形成，隨后是溶酶體胞吐作用，其中半乳糖凝集素-9也脫落。這一結(jié)論是基于PIC阻斷溶酶體蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶后半乳糖凝集素-9的分泌減少。參與該過(guò)程的PKC最有可能是鈣依賴性和二?；视?span>(DAG)非依賴性的(PLC對(duì)分泌過(guò)程沒(méi)有影響)。作者通過(guò)將MCF-7與Jurkat T細(xì)胞以1:1的比例共培養(yǎng)2小時(shí)，然后使用Fluo4活性染料檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣水平，檢查MCF-7細(xì)胞內(nèi)鈣水平是否上調(diào)，方法見(jiàn)材料和方法部分。作者發(fā)現(xiàn)，與靜止的MCF-7細(xì)胞相比，與Jurkat T細(xì)胞共培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣水平顯著上調(diào)。這表明環(huán)境支持激活Ca2+依賴性PKC異構(gòu)體，該異構(gòu)體與該酶的DAG/Ca2+依賴性異構(gòu)體G?6983一起被抑制。

圖4、T細(xì)胞誘導(dǎo)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞分泌半乳糖凝集素-9可通過(guò)兩種機(jī)制發(fā)生。

3、半凝集素-9可以協(xié)同VISTA抑制T淋巴細(xì)胞的抗癌活性

         然后作者研究了半乳糖凝集素-9的免疫抑制活性，以及它如何與其他免疫檢查點(diǎn)合作以實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞失活。首先，作者將MCF-7人乳腺癌細(xì)胞與Jurkat T細(xì)胞(具有T輔助活性的CD4陽(yáng)性細(xì)胞)以1:1的比例共培養(yǎng)16小時(shí)，無(wú)論是否存在9S2-1半乳糖凝集素-9中和(阻斷)抗體或同型對(duì)照抗體。在孵育完成后，作者在細(xì)胞培養(yǎng)基和Jurkat T細(xì)胞裂解物中測(cè)量了IL-2。作者還分析了Jurkat T細(xì)胞裂解物中磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3K)的活性(PI-3K活性及其途徑有助于輔助性T細(xì)胞中IL-2的表達(dá)，并表明TCR信號(hào)的激活)。重要的是，靜止的Jurkat T細(xì)胞分泌的IL-2幾乎無(wú)法檢測(cè)到，而MCF-7則不分泌任何IL-2。作者發(fā)現(xiàn)，Jurkat T細(xì)胞在與MCF-7細(xì)胞相互作用過(guò)程中產(chǎn)生的分泌(但不是細(xì)胞相關(guān)IL-2的水平)以及IL-2的總量(分泌+在裂解物中檢測(cè)到的細(xì)胞相關(guān)水平)在半乳糖凝集素-9中和抗體而不是同型對(duì)照抗體的存在下顯著降低(圖5A)。對(duì)PI-3K也觀察到同樣的效果。這意味著半乳糖凝集素-9支持PI3K在Jurkat T細(xì)胞中的激活，并通過(guò)它們?cè)鰪?qiáng)IL-2的產(chǎn)生。然后，作者將Jurkat T細(xì)胞與LN-18(與MCF-7細(xì)胞不同，LN-18也表達(dá)VISTA)以1:1的比例共培養(yǎng)16小時(shí)。作者發(fā)現(xiàn)，在LN-18的存在下，Jurkat T細(xì)胞并不比靜止的Jurkat T細(xì)胞分泌更多的IL-2。然而，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 1型(TGF-β)和半乳糖凝集素-9的分泌水平高度上調(diào)(圖5B)。與作者之前的研究結(jié)果一致，作者發(fā)現(xiàn)TGF-β在mRNA和蛋白水平上上調(diào)了LN-18細(xì)胞中半乳糖凝集素-9和VISTA的表達(dá)。然后，作者將LN-18細(xì)胞與原代人cd -3陽(yáng)性T細(xì)胞共培養(yǎng)，并評(píng)估IL-2、顆粒酶B、TGF-β和半乳糖凝集素-9在培養(yǎng)基中的釋放。作者發(fā)現(xiàn)顆粒酶B和IL-2的釋放水平?jīng)]有增加，但TGF-β的產(chǎn)生和半乳糖凝集素-9的分泌均顯著上調(diào)(圖5C)。重要的是，當(dāng)LN-18細(xì)胞與Jurkat T細(xì)胞或原代人T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞表面的VISTA水平顯著上調(diào)。ELISA未檢測(cè)到LN-18分泌的VISTA。為了評(píng)估VISTA對(duì)半乳糖凝集素-9在T細(xì)胞中觸發(fā)的事件的貢獻(xiàn)，作者在缺乏或存在半乳糖凝集素-9或vistan中和抗體的情況下共培養(yǎng)LN-18和Jurkat T細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)半乳糖凝集素-9被中和時(shí)，IL-2的分泌(與MCF-7細(xì)胞存在時(shí)不同)沒(méi)有改變，但當(dāng)VISTA被中和時(shí)，IL-2的分泌會(huì)上調(diào)(圖6A)。在Jurkat T細(xì)胞裂解液中也觀察到同樣的效果。這意味著VISTA有助于抑制T輔助活性。為了確認(rèn)PI-3K在IL-2產(chǎn)生中的作用，作者在共培養(yǎng)中加入了30μM LY294002 (PI-3K抑制劑)，發(fā)現(xiàn)PI-3K的活性和IL-2的釋放都減弱了(圖6A)。重要的是，經(jīng)FACS分析證實(shí)，Tim-3存在于與Jurkat T細(xì)胞共培養(yǎng)的LN-18細(xì)胞表面，并且與半乳糖凝集素-9的表達(dá)水平幾乎相同。為了排除Tim-3參與觀察到的效應(yīng)，作者按照上述方法在存在或不存在Tim-3中和抗體(4BS)的情況下共培養(yǎng)細(xì)胞。Tim-3中和對(duì)PI-3K活性和IL-2釋放均無(wú)影響(圖6A)。下一步是用異種移植模型在體內(nèi)證實(shí)觀察到的效果。首先，為了驗(yàn)證LN-18細(xì)胞是否能夠抑制小鼠T細(xì)胞活性，作者在不存在半乳糖凝集素-9或VISTA中和抗體的情況下，以1:1的比例與小鼠T細(xì)胞共培養(yǎng)16小時(shí)。作者發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基中釋放的顆粒酶B具有大量活性(圖6B)。當(dāng)半乳糖凝集素-9中和時(shí)，這種活性進(jìn)一步高度上調(diào)，當(dāng)VISTA中和時(shí)，這種活性也顯著上調(diào)(圖6B)。當(dāng)半乳糖凝集素-9或VISTA被中和時(shí)，LN-18細(xì)胞的活力分別降低(圖6B)。小鼠IL-2分泌只有在VISTA被中和時(shí)才會(huì)上調(diào)，這與LN-18與Jurkat T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的觀察結(jié)果一致(圖6A)。小鼠T細(xì)胞裂解物中的人半乳糖凝集素-9(總細(xì)胞相關(guān)半乳糖凝集素-9)通過(guò)ELISA(與小鼠半乳糖凝集素-9無(wú)交叉反應(yīng))進(jìn)行測(cè)量，如材料和方法部分所述。作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)半乳糖凝集素-9被中和時(shí)，它在T細(xì)胞中幾乎不存在，而當(dāng)VISTA被中和時(shí)，它在小鼠T細(xì)胞中的水平顯著下調(diào)(圖6B)。VISTA中和的這種效果也可能是半乳糖凝集素-9無(wú)法在小鼠T細(xì)胞上結(jié)合VISTA的結(jié)果。

圖5、來(lái)源于實(shí)體惡性腫瘤的人癌細(xì)胞產(chǎn)生的半乳糖凝集素-9觸發(fā)輔助性T細(xì)胞的PI-3K激活和il - 2產(chǎn)生。表達(dá)半乳糖凝集素-9和VISTA的人類癌細(xì)胞抑制輔助性和細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性

圖6、VISTA與半凝集素-9協(xié)同抑制輔助性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性

4、來(lái)源于實(shí)體惡性腫瘤的人癌細(xì)胞能夠分泌半乳糖凝集素-9，在體內(nèi)抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性

         為了在體內(nèi)證實(shí)作者的發(fā)現(xiàn)，作者使用了C57 BL16小鼠。以5只小鼠作為對(duì)照組，其余5只小鼠分別皮下注射2×106 LN-18細(xì)胞(具有高度致瘤性)，5小時(shí)后分析其血液(由于這些小鼠具有免疫活性，并且植入人LN-18具有高度活性，因此在LN-18細(xì)胞被小鼠免疫抑制之前，用5小時(shí)的時(shí)間觀察其最大的免疫逃避反應(yīng))。首先，作者分離了LN-18細(xì)胞注射區(qū)域，并將其置于細(xì)胞裂解緩沖液(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA和0.5% NP-40)中進(jìn)行軟均質(zhì)，以溶解分泌到微環(huán)境中的蛋白質(zhì)，并獲得其中存在的裂解的造血細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)獲得的勻漿含有高水平的人半乳糖凝集素-9(圖7A)，但不含任何人VISTA。在對(duì)照組中檢測(cè)不到這兩種蛋白。對(duì)照組和ln -18注射組。注射微環(huán)境(皮下區(qū)域，LN-18細(xì)胞被注射)含有T細(xì)胞，因?yàn)樵趧驖{中可以清楚地檢測(cè)到CD3蛋白(圖7A)。注射ln -18的小鼠血漿中含有明顯可檢測(cè)到的人半乳糖凝集素-9(對(duì)照組未檢測(cè)到)。這些小鼠的T細(xì)胞裂解物也顯示出高水平的人半乳糖凝集素-9，這在對(duì)照動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞中檢測(cè)不到(圖7B)。此外，血漿TGF-β水平高度上調(diào)(圖7B)。作者還評(píng)估了人半乳糖凝集素-9是否影響小鼠T淋巴細(xì)胞的抗癌細(xì)胞毒活性。為此，將小鼠T細(xì)胞與100 nM PMA預(yù)處理的等量K562細(xì)胞以1:1的比例與從對(duì)照和注射ln -18的小鼠中分離的小鼠原代T細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞共孵育24小時(shí)，測(cè)定K562細(xì)胞活力。作者發(fā)現(xiàn)，與未與小鼠T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞和與注射了LN-18細(xì)胞的小鼠的T細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞相比，K562細(xì)胞與對(duì)照組小鼠T細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞的活力顯著降低(圖7C)。因此，可以得出結(jié)論，人半乳糖凝集素-9下調(diào)小鼠T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。

圖7、來(lái)源于實(shí)體惡性腫瘤的人癌細(xì)胞在體內(nèi)分泌半乳糖凝集素-9。C57 BL16小鼠皮下注射致瘤性LN-18細(xì)胞(每只小鼠2 × 106個(gè)細(xì)胞)。然后在注射的微環(huán)境中測(cè)量CD3蛋白、人半乳糖凝集素-9和VISTA

結(jié)論

         綜上所述，作者的研究結(jié)果首次表明，來(lái)自實(shí)體惡性腫瘤的人類癌細(xì)胞在與T細(xì)胞相互作用時(shí)能夠高度分泌半乳糖凝集素-9。半乳糖凝集素-9是通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面后的蛋白水解脫落以及與自噬和蛋白水解脫落相關(guān)的溶酶體分泌而分泌的。當(dāng)非惡性細(xì)胞(如角質(zhì)形成細(xì)胞)暴露于T細(xì)胞時(shí)，這一策略也適用，從而解釋了在銀屑病發(fā)展過(guò)程中，角質(zhì)形成細(xì)胞如何抑制T細(xì)胞，從而抑制攻擊角質(zhì)形成細(xì)胞的T細(xì)胞，隨后是角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。當(dāng)暴露于T細(xì)胞時(shí)，胎兒細(xì)胞不會(huì)分泌半乳糖凝集素-9，這表明胚胎細(xì)胞的目的只是抑制攻擊胚胎的T細(xì)胞，而不是抑制T細(xì)胞免疫本身。VISTA還通過(guò)抑制輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2來(lái)增強(qiáng)半乳糖凝集素-9的免疫抑制作用，并可能進(jìn)一步阻止細(xì)胞毒性T細(xì)胞的功能。這包括對(duì)PI-3K等信號(hào)通路的負(fù)面影響，影響BCL-XL抗凋亡蛋白的活性，以及如先前報(bào)道的通過(guò)改變其膜電位。因此，半乳糖凝集素-9本身及其產(chǎn)生相關(guān)的表達(dá)系統(tǒng)(如TGF-β/Smad3信號(hào)通路)可以被認(rèn)為是多種癌癥免疫治療的特異性和高效靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法

         WB、ELISA、qPCR、細(xì)胞內(nèi)鈣含量測(cè)定、On-cell Western、細(xì)胞活力測(cè)定

參考文獻(xiàn)

         Schlichtner S, Yasinska IM, Lall GS, Berger SM, Ruggiero S, Cholewa D, Aliu N, Gibbs BF, Fasler-Kan E, Sumbayev VV. T lymphocytes induce human cancer cells derived from solid malignant tumors to secrete galectin-9 which facilitates immunosuppression in cooperation with other immune checkpoint proteins. J Immunother Cancer. 2023 Jan;11(1):e005714. doi: 10.1136/jitc-2022-005714. PMID: 36599470; PMCID: PMC9815087.