神經節(jié)苷脂GM3通過抑制血管平滑肌細胞鐵死亡預防腹主動脈瘤

         腹主動脈瘤（AAA）是一種潛在的危及生命的血管疾病，但目前缺乏經批準的藥物治療來防止AAA的進展和破裂。鞘脂代謝紊亂與AAA的發(fā)生發(fā)展相關，研究發(fā)現，神經節(jié)苷脂GM3（一種含唾液酸型鞘脂糖）對動脈粥樣硬化具有保護作用，是AAA發(fā)生的重要危險因素;然而，GM3對AAA發(fā)展的潛在貢獻尚未得到調查。作者進行了一項代謝組學研究，以評估人類AAA患者血漿中的GM3水平。作者通過Western blotting和免疫熒光染色分析了GM3合成酶（ST3GAL5）在小鼠動脈瘤模型和人類AAA組織中的表達。通過RNA測序、親和純化和質譜、蛋白質組學分析、表面等離子體共振分析和功能研究，解析GM3調控鐵死亡的分子機制。作者在體內的平滑肌細胞（SMCs）中有條件地刪除和過表達St3gal5，以研究其在AAA中的作用。作者發(fā)現，人類腹主動脈瘤患者的血漿GM3水平顯著降低。腹主動脈血管平滑肌細胞GM3含量和ST3GAL5表達在腹主動脈瘤患者和腹主動脈瘤小鼠模型中降低。RNA測序分析表明，沉默ST3GAL5可誘導人主動脈平滑肌細胞發(fā)生鐵死亡。作者發(fā)現GM3直接與TFR1（轉鐵蛋白受體1）的胞外結構域相互作用，并破壞其與全轉鐵蛋白的相互作用。TFR1是細胞攝取鐵的關鍵細胞膜蛋白。SMC特異性St3gal5敲除加重了病變部位的鐵沉積，顯著促進了小鼠AAA的發(fā)展，而GM3補充抑制了脂質過氧化，減少了主動脈平滑肌細胞的鐵沉積，顯著降低了AAA的發(fā)病率。綜上所述，GM3失調可促進AAA血管平滑肌細胞鐵死亡，GM3可能成為治療AAA的新靶點。本文于2023年11月發(fā)表于《Circulation》，IF:37.8，Q1。

技術路線：

主要實驗結果：

1、GM3在人和小鼠腹主動脈瘤中表達下調

         為了探討AAA患者鞘脂水平的變化，作者采用液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）對100名AAA患者和100名對照組的血漿進行了靶向代謝組學分析研究。正交偏最小二乘-判別分析的評分圖表明，人AAA的鞘脂譜發(fā)生了顯著改變（圖1A），而投影評分圖中的變量重要性確定GM3分子是導致組間差異的前3個變量（圖1B）。進一步分析數據（熱圖和火山圖）證實，GM3水平在AAA中顯著降低（圖1C和1D）。此外，GM3血漿濃度較低與AAA風險增加相關（圖1E）。在100例AAA患者中，4種GM3類型（GM3 16:0、GM3 18:0、GM3 20:0和GM3 22:0）的水平顯著低于100例對照（圖1F）。作者還通過LC-MS/MS分析了GM3在AAA和AngII處理ApoE?/?小鼠模型中的水平。結果表明，AngII治療小鼠的病變中GM3水平低于鹽水治療對照（圖1G）。綜上所述，這些數據表明GM3在人和小鼠腹主動脈瘤中表達下調，并且可能在腹主動脈瘤中起重要作用。

圖1 AAA患者和小鼠AAA病變血漿中GM3水平降低

2、下調ST3GAL5導致VSMCs中GM3水平降低促進AAA進展

         鑒于VSMC功能障礙是AAA的主要病理特征，作者進一步通過免疫熒光染色比較了AAA患者和小鼠模型腹主動脈VSMCs中GM3的含量。結果顯示，腹主動脈瘤患者腹主動脈VSMCs的GM3水平顯著降低（7倍），而接受AngII治療的ApoE - / -小鼠腹主動脈GM3水平顯著降低（5倍;圖2A-2C）。這些結果證明VSMCs中GM3水平降低與AAA疾病進展密切相關。作者發(fā)現GM3降低了AAA發(fā)生率（圖2D和2E）和彈性蛋白破裂程度（圖2F）。這些結果表明，GM3可能對腹主動脈瘤有潛在的治療作用。接下來，作者想研究可能導致GM3水平變化的酶。ST3GAL5將乳糖神經酰胺轉化為GM3，而GM3可被ST8SIA1和B4GALNT1進一步催化，分別形成GM2和GD3（圖2G）。作者的數據表明，ST3GAL5在人AAA組織和AngII處理的ApoE - / -小鼠主動脈動脈瘤的蛋白質水平顯著下調（圖2H和2I）。作者還發(fā)現，在AAA患者和小鼠AAA病變的VSMCs中，ST3GAL5水平顯著降低（圖2J-2L）。這些結果證實了ST3GAL5是GM3的關鍵酶調節(jié)因子，并在AAA進展中發(fā)揮重要作用。

圖2 T3GAL5在人和小鼠AAA中下調

3、GM3調節(jié)人主動脈平滑肌細胞鐵平衡和鐵死亡

         為了了解GM3如何影響血管平滑肌細胞的細胞過程，作者對轉染ST3GAL5 siRNA （siST3GAL5）或對照siRNA （siNC）的人主動脈平滑肌細胞（HASMCs）進行了RNA測序（圖3A）。差異表達基因的KEGG通路富集分析突出了細胞衰老、細胞周期、自噬和鐵死亡等細胞過程（圖3B）。同時，感染siST3GAL5的HASMCs細胞死亡增加。只有鐵死亡抑制劑ferrostain-1顯著地抑制了ST3GAL5敲低引起的細胞死亡增加，而壞死、凋亡和自噬抑制劑necrostain-1、emricasan或氯喹均無這一作用（圖3C），這意味著GM3主要影響HASMC鐵死亡。這些結果表明，鐵死亡的過程，包括鐵超載，SMC谷胱甘肽消耗和脂質過氧化，在AAA的發(fā)展過程中發(fā)生。

         同樣，沉默ST3GAL5的HASMCs表現出明顯的鐵死亡特征。相對于對照細胞的水平，在siST3GAL5轉染細胞中，脂質活性氧（ROS）生成、丙二醛生成、細胞內總鐵和Fe2+顯著增加，而谷胱甘肽水平顯著降低（圖3D-3I）。接下來，由于研究發(fā)現ST3GAL5敲除可誘導HASMCs發(fā)生鐵死亡，因此作者研究了ST3GAL5過表達在鐵死亡誘劑咪唑酮抹去素處理的HASMCs中減輕鐵死亡的能力。正如預期的那樣，ST3GAL5過表達顯著抑制了咪唑酮抹去素誘導的細胞死亡（圖3J和3K）。ST3GAL5過表達還部分阻斷了咪唑酮抹去素誘導的脂質ROS生成增加、丙二醛生成和鐵負荷增加，以及谷胱甘肽水平降低（圖3L-3Q）。值得注意的是，在基礎條件下，ST3GAL5過表達對HASMCs中的谷胱甘肽和丙二醛水平、脂質ROS生成或死亡沒有影響（圖3J-3N），但總鐵和Fe2+被輕度下調（圖3O-3Q）。因此，作者推測GM3缺失可能通過影響平滑肌細胞的鐵沉積來誘導鐵死亡?？傊?，這些數據表明，GM3主要通過鐵死亡介導的機制影響SMC的死亡。

圖3 GM3調節(jié)HASMCs的鐵死亡

4、GM3通過與TFR1結合調節(jié)平滑肌細胞的鐵穩(wěn)態(tài)

         在確定GM3影響平滑肌細胞的鐵水平后，作者研究了GM3是否影響細胞外不穩(wěn)定鐵的水平。不穩(wěn)定鐵池被認為是由受細胞鐵穩(wěn)態(tài)調節(jié)的松散結合的氧化還原活性鐵組成的細胞質區(qū)室。高水平的不穩(wěn)定鐵已被證明會促進氧化應激。用鈣黃綠素- AM（與鐵結合后淬滅的熒光探針）通過流式細胞術分析HASMCs中不穩(wěn)定的鐵。敲低ST3GAL5導致的GM3缺失導致不穩(wěn)定鐵池顯著增加，而這種作用被GM3的加入所緩解;此外，ST3GAL5過表達顯著減少了不穩(wěn)定鐵池（圖4A）。接下來，作者探索了GM3影響細胞內鐵含量的機制。GM3是一種細胞膜脂質，由位于細胞膜外葉的脂質部分和突出于細胞外間隙的碳水化合物鏈組成。因此，GM3已被證明與膜受體結合并影響受體信號傳導。作者推測GM3與某些膜蛋白的結合可能直接或間接影響細胞內的鐵含量。為了確定HASMCs中潛在的結合伴侶，作者使用親和鏈霉親和素T1珠粒將與生物素標記的GM3結合的蛋白拉下來，并進行蛋白質組學分析（圖4B和4C）。在篩選出的15個GM3相互作用的候選膜蛋白中（圖4D），TFR1可能與GM3對細胞內鐵含量的影響有關。質膜上的全轉錄因子與TFR1結合，然后通過核內體內化，介導了細胞外鐵的轉運進入細胞。表面等離子體共振分析表明GM3和TFR1胞外結構域之間存在相互作用（圖4E）。作者還發(fā)現，GM3水平降低（在ST3GAL5敲低的細胞中）顯著增強了細胞的鐵攝取，而補充GM3后，細胞的鐵攝取受到抑制（圖4F）。競爭性表面等離子體共振實驗證實，GM3抑制了全轉錄因子和TFR1胞外結構域的結合（圖4G）。此外，流式細胞術分析鏈霉親和素/FITC與生物素-全轉錄因子的結合表明，GM3的缺失導致全轉錄因子和TFR1的結合增加，主要在細胞膜上;添加GM3逆轉了這一增加（圖4H）。鄰近實驗顯示，在ST3GAL5敲低的細胞中，TFR1和全轉錄因子進入細胞的轉運顯著增加（3倍）。將GM3重新引入這些細胞可抑制上述增加（圖4I和4J）。與這些發(fā)現一致，GM3水平降低促進了TFR1與核內體調節(jié)因子RAB5的結合，導致含鐵的核內體囊泡形成增加（圖4K和圖4L）。TFR1敲低恢復了siST3GAL5的作用，包括降低脂質ROS水平，以及增加細胞死亡、總鐵和Fe2+水平（圖4M-4P）。因此，作者得出結論，GM3通過干擾TFR1和holo- Tf之間的相互作用在鐵的轉運中發(fā)揮重要作用。

圖4 低GM3水平通過增強TFR1和holo-Tf相互作用誘導鐵攝取增加

5、KLF9的缺失通過增強H3k27ac和招募Pol II促進ST3GAL5的轉錄和表達

         在闡明了GM3在鐵轉運中的作用后，作者進一步探索了ST3GAL5改變AAA的潛在機制，如轉錄因子的調節(jié)。H3K27ac （HiChIP）監(jiān)管相互作用數據庫（GEO;https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/）揭示了HASMCs中ST3GAL5啟動子和遠端增強子之間的相互作用（圖5A和5B）。Ma等人最近通過H3K27ac HiChIP數據庫發(fā)現了KLF家族轉錄因子在AAA中的關鍵作用。值得注意的是，作者發(fā)現KLF家族轉錄因子KLF5、KLF6、KLF9、KLF10、KLF11和KLF16的推測結合位點位于ST3GAL5啟動子/增強子（GeneCards數據庫;https://genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ST3GAL5）。定量聚合酶鏈反應分析表明，KLF9（一個眾所周知的轉錄抑制因子）的敲低誘導ST3GAL5 mRNA水平顯著增加。相反，敲低其他5個KLF家族成員對ST3GAL5的轉錄沒有影響（圖5C）。染色體構象捕獲聚合酶鏈反應分析顯示，siKLF9增強了ST-3GAL5的啟動子和增強子區(qū)域之間的相互作用（圖5D）。接下來，作者通過CUT&RUN qPCR分析KLF9敲低后ST3GAL5調控區(qū)域中KLF9順式結合位點的變化。結果表明，轉染siKLF9后，KLF9與ST3GAL5的啟動子和增強子區(qū)域的結合顯著減弱，同時H3K27ac和Pol II結合顯著富集（圖5E-5G）?？傊?，這些數據提示，KLF9通過阻礙H3k27ac修飾和Pol II募集來抑制ST3GAL5的近端啟動子和遠端增強子之間的相互作用（圖5H）。細胞中KLF9敲低也誘導ST3GAL5蛋白水平顯著增加（4倍;圖5I和5J）。與這些發(fā)現一致，作者發(fā)現在AngII誘導的小鼠腹主動脈病變（圖5K）和人類AAA患者的主動脈平滑肌細胞（圖5L和圖5M）中，KLF9蛋白水平顯著升高。因此，作者的數據表明KLF9抑制ST3GAL5在AAA中的表達。

圖5 KLF9在AAA中表達上調，KLF9敲低可通過增加增強子-啟動子相互作用促進ST3GAL5轉錄

6、在體內平滑肌細胞中St3gal5表達增加可抑制AngII誘導的AAA

         為了探索GM3對體內AAA的治療潛力，作者使用腺相關病毒St3gal5 （AAV-St3gal5）或腺相關病毒增效綠色熒光蛋白（AAV-EGFP）感染ApoE - / -小鼠的腎上腹主動脈節(jié)段30日（通過外膜周給藥），之后輸入AngII 28日（圖6A）。在感染AAV-St3gal5或AAV-EGFP的鹽水輸入小鼠中，未發(fā)生AAA（圖6C）。相反，在輸入AngII的小鼠中，與AAV-EGFP組相比，AAV-St3gal5組的生存率較高，AAA發(fā)生率和最大腹主動脈直徑較低（圖6B-6E）。病變的組織學分析顯示，在接受AngII治療的AAV-St3gal5組中，Elastica van Gieson染色顯示彈性蛋白降解減少（圖6F和6G），柏林藍染色顯示鐵蓄積顯著減少（圖6F和6H）。在AngII處理的AAV-St3gal5組中，VSMCs中的Gpx4表達也顯著增加，而4-羥基壬烯醛水平顯著降低（圖6I和圖6J）。這些結果表明，GM3通過穩(wěn)定AAA細胞內鐵水平和減少脂質過氧化來保護VSMCs。

         血壓是腹主動脈瘤發(fā)病的重要危險因素。例如，一項研究分析了13年期間的605例腹主動脈瘤患者，結果顯示高血壓與腹主動脈瘤的發(fā)生密切相關。本研究表明VSMCs中St3gal5過表達可能通過減輕鐵死亡減輕小鼠AAA的發(fā)生和發(fā)展，而不是影響血壓。

圖6 VSMC特異性過表達St3gal5可減弱AngII誘導的小鼠AAA形成

7、SMCs中GM3缺失通過加重鐵失衡促進AAA發(fā)展

         為了進一步探索GM3在AAA平滑肌細胞內鐵穩(wěn)態(tài)維持中的作用，作者通過將St3gal5flox/flox ApoE?/?小鼠（St3gal5fl/fl ApoE?/?）與Myh11-CreERT2 ApoE?/?小鼠雜交，產生了平滑肌特異性St3gal5敲除ApoE?/?小鼠（St3gal5SMKO ApoE?/?）。作者使用他莫昔芬誘導產生的St3gal5SMKO ApoE - / -小鼠，然后輸入AngII/生理鹽水（圖7A）。在連續(xù)28日輸入AngII的St3gal5fl/fl ApoE?/?小鼠中，約60%發(fā)生AAA，而在輸入AngII的St3gal5SMKO ApoE?/?小鼠中，＞80%發(fā)生AAA。此外，St3gal5fl/fl ApoE?/?和St3gal5SMKO ApoE?/?血管灌注小鼠分別表現出20%和37.5%的不同死亡率（圖7B和7C）。離體分析和超聲數據證實，在輸入AngII的St3gal5SMKO ApoE - / -小鼠中，最大主動脈直徑顯著增加（圖7D, 7E）。在St3gal5SMKO ApoE?/?小鼠的病變中，彈性蛋白降解水平顯著高于St3gal5fl/fl ApoE?/?小鼠的病變（圖7F和7G）。此外，與接受AngII治療的St3gal5fl/fl ApoE?/?小鼠的病變相比，St3gal5SMKO ApoE?/?小鼠的病變中有較多的鐵蓄積（圖7F和7H），同時伴有VSMCs中4-羥基壬烯醛水平顯著升高（圖7I和7J）。最后，盡管兩個AngII治療組之間的Gpx4水平無顯著差異，但在鹽水輸入的St3gal5SMKO ApoE - / -組中，Gpx4水平顯著降低（圖7I和7J）。綜上所述，這些體內實驗結果支持GM3在調節(jié)AAA中VSMC鐵死亡的關鍵作用。

圖7 VSMC特異性ST3GAL5缺乏通過促進鐵失衡加重AAA形成

結論：

         作者已經全面證明了鞘脂代謝在腹主動脈瘤中的破壞，并強調了VSMCs中GM3缺失對該病的促進作用。作者的研究結果揭示了GM3能夠與細胞膜上的TFR1結合并抑制鐵的攝取，為闡明AAA中SMC鐵死亡的機制提供了新的思路。作者的研究還表明，KLF9通過轉錄抑制ST3GAL5的近端啟動子和遠端增強子的結合來抑制GM3的合成。綜上所述，作者的結果為將GM3作為潛在的AAA治療策略提供了基礎。

實驗方法：

         小鼠AAA模型及治療方案；細胞培養(yǎng)；細胞內Fe2+水平檢測；PI染色法；ELISA；組織學和免疫組織化學；免疫熒光染色；質粒構建及細胞轉染；總RNA分離和實時定量PCR；RNA測序；WB分析；親和純化及質樸分析；脂質過氧化、谷胱甘肽和鐵含量的測量；脂質提取和脂質組學分析；脂質過氧化MDA實驗；全轉鐵蛋白結合的流式細胞術分析；Calcein-AM染色及流式細胞術分析；表面等離子體共振分析；原位接近結扎試驗；Hi-C數據分析；染色體構象捕獲（3C）測定；剪切運行qPCR。

參考文獻：

         Zhang F, Li K, Zhang W, Zhao Z, Chang F, Du J, Zhang X, Bao K, Zhang C, Shi L, Liu Z, Dai X, Chen C, Wang DW, Xian Z, Jiang H, Ai D. Ganglioside GM3 Protects Against Abdominal Aortic Aneurysm by Suppressing Ferroptosis in Vascular Smooth Muscle Cells. Circulation. 2023 Nov 29. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.123.066110. Epub ahead of print. PMID: 38018467.