CircFOXO3促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展

   環(huán)狀RNA是一種新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA，被認(rèn)為可以介導(dǎo)多種類型腫瘤的進(jìn)展。越來越多的證據(jù)表明環(huán)狀RNA在癌癥中異常表達(dá)，并參與腫瘤的發(fā)展，包括增殖、存活和運(yùn)動(dòng)。另外環(huán)狀RNA主要作為miRNA海綿，它們通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA反應(yīng)元件相互溝通和調(diào)節(jié)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)miRNA靶向基因表達(dá)，結(jié)合蛋白質(zhì)，編碼蛋白質(zhì)和促進(jìn)核易位。這些發(fā)現(xiàn)表明，異位表達(dá)的環(huán)狀RNA在腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展中起重要作用。雖然已經(jīng)對(duì)環(huán)狀RNA在GBM中的作用進(jìn)行了初步研究，但對(duì)環(huán)狀rna在GBM中的臨床意義和作用機(jī)制仍未明確。因此，小編通過以下這篇文章，讓大家對(duì)circFOXO3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用機(jī)制有深刻的了解。

   本研究中，首先，我們通過qRT-PCR分析了GBM和非癌組織中circFOXO3的變化。接下來，我們使用功能損失和功能獲得的方法來評(píng)估circFOXO3對(duì)GBM細(xì)胞增殖和侵襲的影響。最后，我們進(jìn)行了熒光原位雜交、RNA下拉、雙熒光素酶報(bào)告基因和RNA免疫沉淀分析，以確認(rèn)環(huán)狀FOXO3和miR-138-5p/miR-432-5p在GBM中的相互作用。并用動(dòng)物模型驗(yàn)證了體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
結(jié)果：
1.人GBM組織中CircFOXO3高表達(dá)
   CircFOXO3包含一個(gè)外顯子，該外顯子通過反向剪接最終產(chǎn)生一個(gè)1435個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本（圖1A，B）。使用擴(kuò)增引物在GBM細(xì)胞中擴(kuò)增出連接位點(diǎn)上游和下游約100 bp的CircFOXO3 cDNA，并通過Sanger測(cè)序進(jìn)行分析。結(jié)果證實(shí)了circFOXO3連接（圖1C）。擴(kuò)增引物在有或無RNase R處理的cDNA中檢測(cè)到環(huán)狀RNA，證明circRNA是真正的環(huán)狀（圖1D）。
   為了研究circFOXO3在GBM中的表達(dá)是否變化，我們檢測(cè)了48例膠質(zhì)瘤和10例正常對(duì)照組中circFOXO3的表達(dá)。如圖1E所示，高級(jí)別膠質(zhì)瘤（HGG）的circFOXO3明顯高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）?？傊@些數(shù)據(jù)表明，circFOXO3表達(dá)的增加可能與GBM進(jìn)展密切相關(guān)。接著我們測(cè)定了4個(gè)GBM細(xì)胞（U87-MG、U251-MG、A172和T98G）和人類正常膠質(zhì)細(xì)胞（HEBs）中circFOXO3的表達(dá)水平。與HEBs相比，GBM細(xì)胞中circFOXO3明顯上調(diào)，U251-MG和U87-MG高表達(dá)，A172和T98G低表達(dá)。因此，U251-MG和U87-MG用于circFOXO3 KD，A172和T98G用于circFOXO3 OE（圖1F）。另外，我們有效地敲除了U87-MG和U251-MG細(xì)胞中的circFOXO3（圖1G和1I）。我們還成功構(gòu)建了circFOXO3表達(dá)慢病毒和過表達(dá)circFOXO3在A172和T98G中的表達(dá)（圖1H，I）。這為接下來探索circFOXO3在GBM細(xì)胞中的作用奠定了基礎(chǔ)。

2.CircFOXO3在體外促進(jìn)GBM的發(fā)生和侵襲
   為了驗(yàn)證circFOXO3的功能，我們進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，circFOXO3 KD可以顯著抑制U87-MG和U251-MG細(xì)胞的增殖（圖2A，B）。此外，集落形成實(shí)驗(yàn)表明，circFOXO3 KD可以減少集落數(shù)量（圖2C，E）和體積（圖2F）。然后，我們使用transwell和傷口愈合試驗(yàn)來分析circFOXO3對(duì)GBM細(xì)胞侵襲的影響。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，circFOXO3 KD細(xì)胞的侵襲力明顯減弱（圖2 G-I）。此外，傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明，U87-MG和U251-MG的傷口閉合速度比對(duì)照組慢（圖2J-L）。總的來說,這些發(fā)現(xiàn)為circFOXO3 KD在體外抑制GBM細(xì)胞的增殖和侵襲提供了證據(jù)，circFOXO3水平的升高對(duì)促進(jìn)GBM細(xì)胞的腫瘤發(fā)生和侵襲具有重要作用。

3.CircFOXO3在GBM細(xì)胞中充當(dāng)MiR-138-5p和MiR-432-5p的海綿
   環(huán)狀RNA主要位于細(xì)胞質(zhì)中，通常作為miRNA海綿來調(diào)控表達(dá)和活性。因此，我們首先搜索了circRNADb數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)circFOXO3沒有預(yù)測(cè)到任何蛋白特征。第二，FISH分析顯示circFOXO3含量豐富，位于胞質(zhì)中（圖3A）。基于上述發(fā)現(xiàn)，我們探討了circFOXO3是否與miRNAs結(jié)合。
   我們?cè)诓煌墓矓?shù)據(jù)庫(kù)（RegRNA、starBase、miRDB和CircInteractome）和以前的報(bào)告中篩選并分析了2種miRNA （miR-138-5p和miR-432-5p）。這些miRNA在膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)，且與circFOXO3相關(guān)的特異性miRNA有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在尋找與circFOXO3結(jié)合的miRNAs時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在circFOXO3中miR-138-5p/miR- 432-5p的結(jié)合位點(diǎn)（圖3B）。隨后，我們研究了circFOXO3與GBM細(xì)胞中miR-138-5p/ miR-432-5p的相關(guān)性。MiR-138-5p和miR-432-5p表達(dá)在circFOXO3 KD后上調(diào)，在circFOXO3 OE后下調(diào)（圖3C，D）。此外，過表達(dá)miR-138-5p/miR-432-5p后，circFOXO3水平明顯降低，抑制miR-138-5p/miR-432-5p后，circFOXO3水平升高（圖3E，F）。
   為了驗(yàn)證circFOXO3和miR-138-5p/miR-432-5p之間的直接結(jié)合，我們進(jìn)行了生物素偶聯(lián)miRNA捕獲和熒光素酶活性測(cè)定。生物素標(biāo)記的miR-138-5p/miR-432-5p及其突變模擬物被設(shè)計(jì)用于拉低過表達(dá)circFOXO3的T98G細(xì)胞中的circFOXO3。與突變體相比，我們發(fā)現(xiàn)野生型miR-138-5p/miR-432-5p中circFOXO3明顯富集（圖3G）。此外，HEK293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-138-5p/miR-432-5p模擬物和熒光素酶報(bào)告基因。與對(duì)照組相比，miR- 138-5p/miR-432-5p轉(zhuǎn)染降低了熒光素酶報(bào)告基因的活性。然后，我們對(duì)miR-138-5p/miR-432-5p的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)miR-138-5p/miR-432-5p模擬物和對(duì)照組的熒光素酶報(bào)告基因活性沒有差異（圖3H）。先前研究表明，環(huán)狀RNA與miRNA的結(jié)合是由AGO2介導(dǎo)的。因此，我們?cè)?span>U87-MG中進(jìn)行了anti-AGO2 RIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示circFOXO3和miR-138-5p/miR-432-5p在AGO2中富集（圖3I）。這些結(jié)果表明circFOXO3可以作為miR-138-5p/miR-432-5p的海綿。

4.MiR-138-5p/miR-432-5p通過靶向GBM細(xì)胞中的NFAT5而下調(diào)并作為抑癌基因
   考慮到circFOXO3和miR-138-5p/miR-432-5p之間的相互作用，我們接下來評(píng)估了miR-138-5p/miR-432-5p在GBM中的表達(dá)和功能。如圖4A和B所示，HGG中miR-138-5p/miR-432-5p明顯低于正常對(duì)照組。此外，CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，miR-138-5p/miR-432-5p表達(dá)降低可顯著提高細(xì)胞活力（圖4C，D）。此外，transwell實(shí)驗(yàn)表明，miR-138-5p/miR-432-5p抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞的侵襲能力明顯高于nc轉(zhuǎn)染細(xì)胞（圖4E）。
   根據(jù)既往報(bào)道，某些GBM致癌基因是miR-138-5p/miR-432-5p的靶標(biāo)。因此，使用mirDIP數(shù)據(jù)庫(kù)在miR-138-5p/miR-432-5p靶標(biāo)中選擇了14個(gè)致癌基因。在這些致癌基因中，有3個(gè)（CDK6、NFAT5和SP1）與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。因此，我們改變了miR-138-5p/ miR-432-5p的表達(dá)，并檢測(cè)了各自靶細(xì)胞的水平（圖4F，G）。Western blot分析顯示過表達(dá)miR-138-5p或miR-432-5p的細(xì)胞中NFAT5表達(dá)下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-138-5p或miR-432-5p抑制劑的細(xì)胞中NFAT5表達(dá)上調(diào)（圖4 G）。此外，GBM中NFAT5 mRNA和蛋白水平較高（圖4H，I）。NFAT5被證明具有miR-138-5p/miR-432-5p的結(jié)合位點(diǎn)（圖4J）。然后，克隆NFAT5的野生型和突變體3個(gè)未翻譯區(qū)域序列，分別構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒和突變體載體。共轉(zhuǎn)染miR-138-5p/miR-432-5p模擬物和報(bào)告質(zhì)粒后，熒光素酶活性顯著降低。相反，miR-138-5p/miR- 432-5p模擬物和突變載體共轉(zhuǎn)染對(duì)熒光素酶活性沒有明顯影響（圖4K）。因此，本研究結(jié)果證實(shí)NFAT5是miR-138-5p/ miR-432-5p的直接靶點(diǎn)。

5.CircFOXO3可以調(diào)節(jié)MiR-138-5p和MiR- 432-5p靶點(diǎn)
   我們測(cè)量了這些靶點(diǎn)在circFOXO3 OE或KD后的表達(dá)。結(jié)果表明，當(dāng)circFOXO3過表達(dá)時(shí)，NFAT5的上調(diào)最為顯著（圖5A，B）。鑒于NFAT5與circFOXO3共享MREs，我們通過相關(guān)性分析和拯救實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，探討circFOXO3是否通過海綿miR-138-5p/ miR-432-5p調(diào)控NFAT5表達(dá)，從而發(fā)揮其致癌作用。相關(guān)分析顯示，circFOXO3與NFAT5呈中度正相關(guān)（圖5C）。此外，circFOXO3與miR-138-5p或miR-432-5p呈中度負(fù)相關(guān)（圖5D，E）。
此外，通過共轉(zhuǎn)染circFOXO3 KD和miR-138-5p和/或miR-432-5p抑制劑U87-MG來進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR和western blot檢測(cè)顯示，與circFOXO3 KD組相比，NFAT5 mRNA和蛋白水平在circFOXO3 KD和miR-138-5p/miR- 432-5p抑制劑共轉(zhuǎn)染的U87-MG細(xì)胞中部分升高（圖5F，G）。與circFOXO3 KD組相比，miR- 138-5p/miR-432-5p抑制劑共轉(zhuǎn)染的U87-MG細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)（圖5H）。這些結(jié)果表明，抑制miR-138-5p/miR-432-5p可以部分恢復(fù)circFOXO3 KD誘導(dǎo)的增殖抑制。同樣，circFOXO3 KD也可以部分減弱miR-138-5p/miR-432-5p介導(dǎo)的U87-MG細(xì)胞的侵襲的下調(diào)（圖5I）。

6.CircFOXO3的抑制抑制了異種移植體在體內(nèi)的生長(zhǎng)
   為了確定circFOXO3在體內(nèi)對(duì)GBM進(jìn)展的影響，我們將circFOXO3 KD或circFOXO3 NC細(xì)胞注入麻醉裸小鼠體紋狀體。植入后，少數(shù)動(dòng)物開始出現(xiàn)發(fā)病跡象，通過MRI對(duì)小鼠進(jìn)行評(píng)估以確定顱內(nèi)腫瘤形成。結(jié)果表明，CircFOXO3抑制顯著降低了腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲。引人注目的是，植入circFOXO3 KD細(xì)胞的小鼠中位生存期為56.5天，而對(duì)照組100%在37天內(nèi)死亡（圖6A-D）。在circFOXO3 KD組中，NFAT5的表達(dá)持續(xù)下降（圖6E，F）?？傊@些結(jié)果表明，circFOXO3在體內(nèi)對(duì)GBM的進(jìn)展至關(guān)重要。

總結(jié)：
   我們首次證明circFOXO3在GBM組織中過表達(dá)，并作為miR- 138-5p/miR-432-5p海綿通過ceRNA機(jī)制調(diào)節(jié)NFAT5的表達(dá)，從而在體內(nèi)外促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。我們證明circFOXO3是GBM中一個(gè)新潛在的治療靶點(diǎn)。我們的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了circRNA和miRNA相互作用在腫瘤發(fā)生中的重要性。