DNA甲基化檢測(cè)

一、結(jié)合重亞硫酸鹽的測(cè)序法實(shí)驗(yàn)流程（BSP）（Bisulfite Genomic Sequence）

原理：結(jié)合重亞硫酸鹽的測(cè)序法是一種靈敏的能直接檢測(cè)分析基因組DNA甲基化模式的方法。重亞硫酸鹽處理后，用針對(duì)改變后的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。 PCR產(chǎn)物中原先非甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)保持不變。PCR產(chǎn)物克隆后進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)這個(gè)方法能得到特定位點(diǎn)在各個(gè)基因組DNA分子中的甲基化狀態(tài)。

該方法特點(diǎn)是：
1. 特異性高，它能夠提供特異性很高的分析結(jié)果，這是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比擬的；
2. 靈敏度高，可以用于分析少于100個(gè)細(xì)胞的檢測(cè)樣品。用微量的基因組DNA進(jìn)行分析就能得到各個(gè)DNA分子精確的甲基化位點(diǎn)分布圖。
  
                   圖1 結(jié)合亞硫酸鹽的測(cè)序法流程圖
DNA用重亞硫酸鹽處理后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段純化后連接進(jìn)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，過(guò)夜培養(yǎng)后挑單個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。得到每個(gè)DNA分子特定區(qū)域甲基化位點(diǎn)的分布圖。
 
結(jié)合重亞硫酸鹽測(cè)序法技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程
A．DNA制備
用DNA抽提試劑盒（Promega, cat. no. A1125）抽提組織，細(xì)胞培養(yǎng)物，石蠟包埋組織切片樣品中的基因組DNA。
B．重亞硫酸鹽處理
C．DNA純化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)純化重亞硫酸鹽處理后的DNA樣品。
D．DNA脫磺基反應(yīng)
E．PCR擴(kuò)增
F．PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳后回收純化，隨后連接到pGEM-T EASY 載體中克隆及測(cè)序。
 

二、甲基化特異性的PCR實(shí)驗(yàn)流程
（methylation-specific PCR, MSP）

原理：甲基化特異性的PCR是一種靈敏度高且操作相對(duì)簡(jiǎn)單的甲基化研究方法。重亞硫酸鹽處理DNA后，基因組DNA發(fā)生的由甲基化狀態(tài)決定的序列改變。隨后進(jìn)行引物特異性的PCR。該方法引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。MSP中設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，即一對(duì)結(jié)合處理后的甲基化DNA鏈（引物對(duì)M），另一對(duì)結(jié)合處理后的非甲基化DNA鏈（引物對(duì)U）。檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用引物M能擴(kuò)增出片段，則說(shuō)明檢測(cè)位點(diǎn)存在甲基化；若用引物U擴(kuò)增出片段，則說(shuō)明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化（圖3）。

該方法優(yōu)點(diǎn)是：
1、檢測(cè)靈敏度高，樣品消耗少，僅需1μg的基因組DNA，可用于石蠟包埋樣本；
2、快速、簡(jiǎn)單，省時(shí)；
3、如果結(jié)合Real-time定量PCR技術(shù)（Taqman 探針）則能對(duì)樣品中檢測(cè)位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行定量檢測(cè)(Methylight)。 

           圖2 甲基化特異性的PCR（MSP）流程示意圖
用亞硫酸鹽處理后DNA分子發(fā)生了由甲基化狀態(tài)決定的序列改變。用甲基化特異性的引物（primer M）和非甲基化特異性的引物（primer U）進(jìn)行擴(kuò)增。只有結(jié)合完全的甲基化或

MSP技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程
A．DNA抽提
用DNA抽提試劑盒（Promega, cat. no. A1125）抽提組織，細(xì)胞培養(yǎng)物，石蠟包埋組織切片樣品中的基因組DNA。
B. 重亞硫酸鹽處理
C．DNA純化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)純化重亞硫酸鹽處理后的DNA樣品。
D．DNA脫磺基反應(yīng)
E．甲基化特異性的PCR反應(yīng)
針對(duì)改變后的DNA序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物（M，U），進(jìn)行PCR反應(yīng)。為了避免非特異性擴(kuò)增用TaKaRa的hotstart酶。隨后對(duì)PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖進(jìn)行分析。
實(shí)例：
檢測(cè)肝癌細(xì)胞株Bel7405，Bel7404中SFRP1基因啟動(dòng)子甲基化。重亞硫酸鹽處理后，針對(duì)改變的DAN序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物
M: (forward: AGTTAGTGTCGCGCGTTC; reversal: CCGATACCCATACCGACTC) 299 bp
U：(forward:GGAGTTGGGGTGTATTTAGTTTG; reversal: CCAATACCCATACCAACTCTACA) 247 bp
 
圖3：PCR擴(kuò)增結(jié)果圖

三、高分辨率熔解曲線（HRM）法 

     高分辨率熔解曲線分析技術(shù)（High Resolution Melting ），簡(jiǎn)稱HRM ，是近年來(lái)興起的一種檢測(cè)基因突變、進(jìn)行基因分型而及甲基化檢測(cè)的新方法。基本原理是基于核酸分子由于片段長(zhǎng)短、GC含量、GC 分布及單個(gè)堿基差異等物理性質(zhì)不同而造成DNA 分子在加熱變性時(shí)都會(huì)有不同的熔解曲線的形狀和位置，并配合運(yùn)用高濃度的飽和熒光染料，可以迅速的檢測(cè)出核酸片段中GC含量和單堿基的突變。近年來(lái)，公司引進(jìn)了Roche LightCycler? 480 II 和ABI VIIA7 全自動(dòng)熒光定量PCR系統(tǒng)，為客戶提供專業(yè)化、個(gè)性化的甲基化HRM檢測(cè)服務(wù)。

操作流程：
﹡待測(cè)基因序列片段或位點(diǎn)甲基化引物設(shè)計(jì)（300bp以內(nèi)）。
﹡利用甲基化轉(zhuǎn)移酶修飾的DNA和非甲基化修飾的DNA制備標(biāo)準(zhǔn)品（0％，1％，5％，10％，20％，50％，100％梯度HRM標(biāo)準(zhǔn)曲線）
﹡亞硫酸氫鹽處理樣品DNA
﹡上機(jī)檢測(cè)
﹡數(shù)據(jù)處理，形成報(bào)告（包括實(shí)驗(yàn)過(guò)程、試劑耗材、熒光PCR儀原始文件、測(cè)序文件等）。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：
     對(duì)2個(gè)病例的某基因20個(gè)CG位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，分析出不同的甲基化程度。

四、焦磷酸測(cè)序法 

     焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）技術(shù)是由4種酶（DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、熒光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)）催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。每一輪測(cè)序反應(yīng)體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果該dNTP與模板配對(duì)，則會(huì)在DNA聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的3'末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸(PPi)。摻入的dNTP和釋放的PPi是等量的。CpG甲基化焦磷酸測(cè)序檢測(cè)法基于引物延伸的Pyrosequencing技術(shù)，通過(guò)將鏈合成過(guò)程中釋放出的焦磷酸(PPi)轉(zhuǎn)化成光信號(hào)來(lái)監(jiān)測(cè)鏈的合成過(guò)程。通過(guò)檢測(cè)CpG對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上C/T滲入的比例對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)的甲基化程度進(jìn)行定量分析方法。

操作流程：
﹡DNA亞硫酸鹽處理
﹡用焦磷酸測(cè)序?qū)ｉT引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)甲基化引物
﹡進(jìn)行PCR擴(kuò)增預(yù)實(shí)驗(yàn)及正式實(shí)驗(yàn)
﹡PCR產(chǎn)物上焦磷酸測(cè)序儀檢測(cè)
 
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

各種方案比較

服務(wù)說(shuō)明
 
①樣品要求：
﹡血液樣品：樣品為EDTA抗凝或枸椽酸鈉抗凝，樣品量大于0.5 ml，樣品采集后于-20℃或-80℃保存，低溫（≤-4℃）運(yùn)輸。
﹡組織樣品：樣品可以為新鮮組織（最好-80℃保存）或石蠟包埋的組織，也可以是95%乙醇中固定的組織，組織量大于100 mg。
﹡DNA樣品：純度OD260/280 比值為1.8-1.9，濃度≥50ng/ul，體積≥50ul。
②提供詳細(xì)的基因信息
     BSP方法要求待測(cè)序列≤300bp，HRM待測(cè)序列≤200bp，HRM待測(cè)序列≤200bp，焦磷酸測(cè)序待測(cè)序列≤60bp，且上下游保留200bp用于引物設(shè)計(jì)；MS方法要求提供待測(cè)序列的CG侯選位點(diǎn)。我們會(huì)根據(jù)客戶的基因序列信息選擇不同的檢測(cè)方法，并在方案實(shí)驗(yàn)過(guò)程中隨時(shí)與客戶溝通。
③提供結(jié)果  
    實(shí)驗(yàn)報(bào)告（實(shí)驗(yàn)步驟，包括BSP法的5個(gè)克隆統(tǒng)計(jì)結(jié)果等)、PCR電泳照片、測(cè)序彩色波形圖、HRM標(biāo)準(zhǔn)曲線圖、焦磷酸測(cè)序原始文件、基因芯片的原始文件等。

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