工程化間充質(zhì)干細(xì)胞激活血管生成素-1 信號(hào)促進(jìn)糖尿病傷口愈合中的血管生成

         血管功能不全與糖尿病足潰瘍（DFU）的發(fā)病機(jī)制和治療效果有關(guān)。雖然間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有治療糖尿病足潰瘍的潛力，但進(jìn)一步增強(qiáng)促進(jìn)糖尿病足潰瘍傷口血管生成的能力勢(shì)在必行。本研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病傷口愈合的整個(gè)過(guò)程中，血管生成素-1（ANG1）的表達(dá)始終處于受損狀態(tài)。工程化 MSC（MSCANG1）在80%的細(xì)胞中表現(xiàn)出強(qiáng)大的綠色熒光蛋白（EGFP）表達(dá)，并過(guò)表達(dá)和分泌ANG1蛋白。MSCANG1顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞的存活率和小管生成能力，促進(jìn)功能性血管的建立，改善血管滲漏。在 MSCANG1處理的糖尿病傷口中，蛋白激酶 B（Akt）通路的激活和原癌基因酪氨酸激酶 Src（Src）活性的抑制證實(shí)了高效的血管生成過(guò)程。MSCANG1處理的糖尿病傷口與間充質(zhì)干細(xì)胞處理的傷口相比，表皮和真皮重建以及皮膚附屬物再生的速度明顯加快。單純使用間充質(zhì)干細(xì)胞治療可促進(jìn)血管生成和DFU愈合，而使用ANG1對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行工程改造可為這一治療過(guò)程帶來(lái)實(shí)質(zhì)性的額外益處。含有 ANG1 的間充質(zhì)干細(xì)胞工程為開(kāi)發(fā)治療 DFU 的創(chuàng)新策略提供了一條前景廣闊的途徑。該研究于2025年2月發(fā)表在《Stem Cell Research & Therapy》，IF：7.1。

技術(shù)路線： 

1. 糖尿病傷口愈合過(guò)程中的血管生成和 ANG1 水平降低

         與正常小鼠相比，糖尿病小鼠的傷口愈合速度明顯較慢，從相同的初始傷口面積開(kāi)始，在損傷后 7 天、14 天和 21 天觀察到的傷口面積較大就是證明（圖 1A 和 B）。與血管生成在 DFU 的發(fā)展和結(jié)局中起關(guān)鍵作用的認(rèn)識(shí)一致，在損傷后 14 天和 28 天，與正常傷口相比，糖尿病傷口再生組織中含有 CD34 陽(yáng)性造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的血管樣結(jié)構(gòu)明顯較少（圖 1C 和 D）。這些觀察結(jié)果表明，與正常傷口相比，糖尿病傷口的血管生成不足，愈合延遲。

         研究人員檢測(cè)了正常和糖尿病傷口愈合過(guò)程中促血管生成因子和抗血管生成因子的時(shí)間表達(dá)，以確定構(gòu)建工程化MSC的合適候選因子。與糖尿病傷口愈合過(guò)程中血管生成減少的現(xiàn)象相一致的是，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 2（FGF2）、ANG1、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等促血管生成因子的表達(dá)水平普遍呈下降趨勢(shì)、 和轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF1）等促血管生成因子的表達(dá)水平降低，而芽胞 RTK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)拮抗劑 2（SPRY2）、凝血酶原蛋白 1（TSP1）、kisspeptin-1（KISS1）和 IV 型膠原 a1 鏈（COL4A1）等抗血管生成因子的表達(dá)水平同時(shí)升高。這些血管生成因子在糖尿病傷口愈合中的相互作用非常復(fù)雜，因?yàn)榕c正常愈合相比，一些促血管生成因子如基質(zhì)金屬肽酶 9（MMP9）被上調(diào)，而抗血管生成因子如基質(zhì)金屬蛋白酶 1 的組織抑制劑（TIMP1）和血小板因子 4（PF4）在糖尿病傷口愈合的后期被下調(diào)（圖 1E）。鑒于血管生成過(guò)程中促血管生成因子和抗血管生成因子之間錯(cuò)綜復(fù)雜的相互作用，這些因子的表達(dá)水平在整個(gè)愈合過(guò)程中顯示出動(dòng)態(tài)和不同的變化。值得注意的是，在整個(gè)糖尿病傷口愈合過(guò)程中，促血管生成因子ANG1的表達(dá)持續(xù)減少（圖1E），這表明ANG1可能是促進(jìn)血管生成不足的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)，是構(gòu)建用于糖尿病傷口愈合的工程化MSC的最佳候選者。

圖1. 糖尿病傷口愈合過(guò)程中 ANG1 信號(hào)傳導(dǎo)和血管生成受阻

2. 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) ANG1 的可追蹤間充質(zhì)干細(xì)胞

         設(shè)計(jì)并構(gòu)建一種慢病毒質(zhì)粒，其中含有通過(guò) t2A 連接子連接的 ANG1 和 GFP 基因（圖 2A），并對(duì)慢病毒感染的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCANG1）進(jìn)行這兩種外源蛋白穩(wěn)定表達(dá)的評(píng)估。GFP 免疫染色表明，MSCANG1 的 GFP 熒光水平與感染了 GFP 慢病毒（MSCGFP）的間充質(zhì)細(xì)胞相當(dāng)（圖 2B 和 C）。在 MSCANG1 和 MSCGFP 群體中，表達(dá) GFP 的細(xì)胞平均比例約為 80%（圖 2B 和 C），這表明工程化MSC能強(qiáng)有力地表達(dá)外源基因，適合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。WB 分析顯示，與 MSCGFP 細(xì)胞相比，MSCANG1 細(xì)胞裂解物和 條件培養(yǎng)基（CM） 中 ANG1 的表達(dá)水平大幅提高（圖 2F），證實(shí)了血管生成因子 ANG1 的成功表達(dá)和分泌。工程MSCs 的CM中 ANG1 的含量呈時(shí)間性增加，進(jìn)一步證實(shí) ANG1 蛋白是從 MSCANG1 細(xì)胞中釋放出來(lái)并逐漸在 CM 中積累（圖 2G）。

         隨后研究了ANG1對(duì)糖尿病傷口移植工程化MSC存活的影響。通過(guò)使用 GFP 免疫染色追蹤移植細(xì)胞觀察到 MSCANG1 在移植到糖尿病傷口 7 天后表現(xiàn)出與 MSCGFP 細(xì)胞相似的存活模式（圖 2D 和 E）。這表明間充質(zhì)干細(xì)胞中 ANG1 的產(chǎn)生不會(huì)影響間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)存活。

圖2. 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) ANG1（MSCANG1）的工程化MSC并確定其特征

3. MSCANG1 促進(jìn) HUVEC 的存活、腎小管生成和 akt 激活

         考慮到間充質(zhì)干細(xì)胞主要通過(guò)旁分泌機(jī)制發(fā)揮治療作用，作者用工程化MSC的CM處理HUVEC，評(píng)估MSCANG1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響。與對(duì)照組相比，用 MSCGFP-CM 處理的 HUVEC 的細(xì)胞數(shù)明顯增加（圖 3A），Annexin V 和 PI 陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞減少（圖 3B 和 C），這表明 MSCGFP 對(duì) HUVEC 的存活有適度的保護(hù)作用。此外，與 MSCGFP-CM 相比，MSCANG1-CM 進(jìn)一步提高HUVECs 的存活率，強(qiáng)調(diào)了 ANG1 和間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞存活的協(xié)同作用（圖 3A-C）。這種效應(yīng)通過(guò)鈣黃綠素-AM和PI染色得到證實(shí)。與 Ctrl 或 MSCGFP-CM 處理的 HUVECs 相比，MSCANG1-CM 處理的 HUVECs 表現(xiàn)出明顯更多的鈣素-AM 染色活細(xì)胞和更少的 PI 染色死細(xì)胞（圖 3D-F）。ANG1 蛋白的應(yīng)用對(duì) HUVECs 的存活產(chǎn)生類似的保護(hù)作用（圖 S2），進(jìn)一步突出 ANG1 的保護(hù)作用。內(nèi)皮細(xì)胞具有在體外形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力，這反映了它們?cè)隗w內(nèi)的血管生成潛能。同樣，用 MSCGFP-CM 處理可增強(qiáng) HUVECs 中毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成，而用 MSCANG1-CM 處理可進(jìn)一步顯著增強(qiáng)這種效應(yīng)（圖 3G 和 H）。

         Akt 通路與內(nèi)皮細(xì)胞的存活和血管生成能力密切相關(guān)。通過(guò) WB 分析觀察到與 Ctrl 和 MSCGFP-CM 處理的 HUVEC 相比，MSCANG1-CM 處理的 HUVEC 中內(nèi)皮細(xì)胞上 ANG1 的特異性受體 Tie2 的磷酸化和活化增加（圖 3I 和 J）。此外，在 MSCANG1-CM 處理的 HUVEC 中觀察到 Akt 磷酸化水平升高，這證明 MSCANG1 通過(guò) Tie2 顯著增強(qiáng) Akt 的活化（圖 3I 和 J）。值得注意的是，用 MSCGFP-CM 處理的 HUVEC 也表現(xiàn)出 Tie2 和 Akt 蛋白的輕微活化，這與 MSCGFP-CM 適度改善內(nèi)皮細(xì)胞存活和血管生成能力的觀察結(jié)果一致。

圖3. MSCANG1促進(jìn) HUVECs 的存活、腎小管生成和 Akt 活化

4. MSCANG1 促進(jìn) HUVEC 的功能成熟

         ANG1在血管生成過(guò)程中對(duì)血管穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)完整性起著關(guān)鍵作用。為評(píng)估工程化MSC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞完整性的影響，用工程化MSC的CM培養(yǎng)HUVECs，并通過(guò)量化穿透細(xì)胞的熒光染料Dextran-FITC來(lái)評(píng)估HUVECs單層的通透性（圖4A）。值得注意的是，與 Ctrl 和 MSCGFP-CM 培養(yǎng)的 HUVECs 相比，與 MSCANG1-CM 培養(yǎng)的 HUVECs 的 Dextran-FITC 穿透性明顯降低（圖 4B），這表明 ANG1 能有效減少內(nèi)皮屏障滲漏，從而促進(jìn)血管完整性。

         VE-Cadherin是內(nèi)皮細(xì)胞間粘附連接的關(guān)鍵成分，負(fù)責(zé)鈣依賴性細(xì)胞粘附，在維持血管完整性方面起著關(guān)鍵作用。觀察結(jié)果表明，與 Ctrl 和 MSCGFP-CM 處理的 HUVECs 相比，MSCANG1-CM 培養(yǎng)后 HUVECs 細(xì)胞邊界的 VE-cadherin 表達(dá)上調(diào)（圖 4C 和 D）。WB 分析還表明，在這些經(jīng) MSCANG-CM 處理的 HUVEC 中，VE-cadherin 的表達(dá)明顯增加（圖 4E 和 F）。此外，Src的磷酸化與細(xì)胞連接處 VE-cadherin穩(wěn)定性降低有關(guān)。與 Ctrl 和 MSCGFP-CM 處理相比，MSCANG1-CM 處理導(dǎo)致 HUVECs 中磷酸化 Src 水平降低（圖 4E 和 F）。

         先前的研究結(jié)果表明，naive 間充質(zhì)干細(xì)胞具有一定的血管生成潛能，與此相一致，MSCGFP-CM 處理也適度改善 HUVECs 的通透性、增加 VE-cadherin表達(dá)并降低了 Src 磷酸化（圖 4A-F）?？傊g充質(zhì)干細(xì)胞中外源性 ANG1 的表達(dá)可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的功能性成熟進(jìn)一步提高其血管生成能力。

圖4. MSCANG1促進(jìn)血管粘連蛋白的表達(dá)和血管完整性，并抑制 Src的激活

5. MSCANG1 移植促進(jìn)糖尿病傷口愈合中的血管生成

         移植各種工程化MSC 14天后，通過(guò)檢測(cè)血管的存在和成熟情況，評(píng)估糖尿病傷口愈合過(guò)程中的血管生成情況。CD34和α-SMA（一種周細(xì)胞標(biāo)記物）的雙重免疫染色顯示，與對(duì)照組和移植MSCGFP的傷口組織相比，移植MSCANG1的傷口組織內(nèi)層的CD34+細(xì)胞和外層的α-SMA+細(xì)胞的血管樣結(jié)構(gòu)明顯增加（圖5A和B）。WB 分析進(jìn)一步證實(shí)，在 MSCANG1 移植的糖尿病傷口再生組織中，CD34 表達(dá)升高（圖 5C 和 D）。

         傷口愈合過(guò)程中涉及的多種分子信號(hào)通路最終都匯聚到 Akt 的激活上，在糖尿病傷口愈合中普遍觀察到 Akt 激活受損。在本研究中，WB 分析顯示，在 MSCANG1 移植的糖尿病傷口中，Tie2 受體和下游 Akt 通路顯著磷酸化（圖 5E 和 F），表明 ANG1/Tie2/Akt 通路的激活是 MSCANG1 促進(jìn)糖尿病傷口愈合的血管生成機(jī)制的基礎(chǔ)。

         為評(píng)估再生傷口組織中血管的完整性和成熟度，研究人員檢測(cè)了內(nèi)皮間連接蛋白 VE-Cadherin 的表達(dá)。CD34 和 VE-Cadherin 免疫染色顯示，與對(duì)照組和 MSCGFP 處理的傷口相比，MSCANG1 處理的傷口顯示出更多的 CD34 和 VE-Cadherin 陽(yáng)性血管樣結(jié)構(gòu)（圖 6A 和 B）。WB 分析進(jìn)一步驗(yàn)證了 MSCANG1 處理的傷口中 VE-Cadherin 表達(dá)的升高（圖 6C 和 D）。此外，WB 分析顯示，與對(duì)照組和 MSCGFP 處理的傷口相比，MSCANG1 處理的傷口中 Src 表達(dá)減少（圖 6C 和 D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，MSCANG1 能有效抑制 Src 活性，從而促進(jìn)其下游效應(yīng)物 VE-Cadherin 的表達(dá)。

         綜上所述，這些結(jié)果表明，MSCANG1 可通過(guò)與 Tie2 受體結(jié)合，顯著激活 Akt 通路并抑制 Src 活性，從而在糖尿病傷口愈合過(guò)程中促進(jìn)血管生成并改善血管完整性。

圖5. MSCANG1促進(jìn)血管生成并激活糖尿病傷口愈合中的 Tie2/Akt 通路

圖6. MSCANG1促進(jìn)糖尿病傷口愈合中 VE-Cadherin 的表達(dá)并抑制 Src 的激活

6. MSCANG1 植入加速糖尿病傷口愈合

         作者接著研究 MSCANG1 接種是否能促進(jìn)糖尿病傷口愈合的過(guò)程。與觀察到的 MSCANG1 促進(jìn)傷口組織血管生成的情況一致，在移植后 7、14 和 21 天，與對(duì)照組或 MSCGFP 相比，移植 MSCANG1 的傷口面積明顯較小（圖 7A 和 B）。這些發(fā)現(xiàn)表明，工程化的 MSCANG1 能明顯加快傷口愈合。

         上皮恢復(fù)對(duì)重建傷口屏障至關(guān)重要，這是傷口愈合過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。利用血色素和伊紅（HE）染色以及上皮標(biāo)記物 K14 的免疫染色觀察到，與對(duì)照組和 MSCGFP 移植的傷口相比，移植 MSCANG1 的糖尿病傷口在移植后 14 天顯示出最窄的上皮間隙（EG）（圖 7C、D 和 F）。移植后第 28 天，所有傷口都被上皮覆蓋，與對(duì)照組相比，移植 MSCGFP 和 MSCANG1 的傷口真皮厚度（THK）顯著增加（圖 7C、D 和 G）。值得注意的是，接種 MSCGFP 和 MSCANG1 的傷口真皮厚度沒(méi)有明顯差異（圖 7C 和 G），這表明 MSCANG1 處理不會(huì)誘導(dǎo)真皮成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖。

         血管生成在皮膚附屬物的功能再生中起著關(guān)鍵作用。通過(guò)對(duì)再生毛囊的標(biāo)記物 K14 和 K17 進(jìn)行雙重免疫染色觀察到，在 MSCANG1 移植后 14 天和 28 天，糖尿病傷口過(guò)渡區(qū)的 K14 和 K17 定位于毛囊（圖 7E 和 H）?？傊@些研究結(jié)果表明，MSCANG1 可通過(guò)促進(jìn)表皮和真皮重建以及促進(jìn)皮膚附屬物再生來(lái)加速糖尿病傷口愈合。

圖7. MSCANG1治療促進(jìn)糖尿病傷口愈合過(guò)程

結(jié)論

         綜上所述，本研究表明，在糖尿病傷口愈合過(guò)程中，ANG1明顯缺乏。MSCANG1 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的存活、遷移和功能性緊密連接的形成有顯著影響。此外， MSCANG1 促進(jìn)血管生成，其間Akt 的激活和 Src 活性的抑制起著關(guān)鍵作用。間充質(zhì)干細(xì)胞與 ANG1 的工程設(shè)計(jì)為治療結(jié)果提供實(shí)質(zhì)性的協(xié)同優(yōu)勢(shì)，并為開(kāi)發(fā)治療 DFU 的創(chuàng)新策略提供一條前景廣闊的途徑。

實(shí)驗(yàn)方法

         細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，細(xì)胞活力評(píng)估，管形成實(shí)驗(yàn)，體外滲透性試驗(yàn)，正常和糖尿病創(chuàng)面模型的制備，動(dòng)物處理和傷口面積評(píng)估，免疫組化，qRT-PCR，Western blot

參考文獻(xiàn)

         Deng Q, Du F, Pan S, Xia Y, Zhu Y, Zhang J, Li C, Yu S. Activation of angiopoietin-1 signaling with engineering mesenchymal stem cells promoted efficient angiogenesis in diabetic wound healing. Stem Cell Res Ther. 2025 Feb 21;16(1):75. doi: 10.1186/s13287-025-04207-7. PMID: 39985096; PMCID: PMC11846275.