間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體應(yīng)用于骨質(zhì)疏松治療
骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少和骨密度降低為特征的全身性代謝性疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的外泌體是其分泌組的重要組成部分，包含多種細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和細(xì)胞外囊泡（EVs）。這些外泌體通過調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞活動(dòng)，促進(jìn)骨形成和維持骨穩(wěn)態(tài)。外泌體的生物活性使其在組織再生中具有重要潛力。該研究發(fā)現(xiàn)，MSCs的外泌體能夠增強(qiáng)成骨活性，減少骨吸收，在骨質(zhì)疏松癥治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。這種外泌體介導(dǎo)的骨再生機(jī)制為開發(fā)新型非細(xì)胞療法提供了理論基礎(chǔ)。該研究于2025年2月發(fā)表在《Stem Cell Research & Therapy》，IF=7.1。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
1. 體外和體內(nèi)MSCs的成骨作用增強(qiáng)，由Smurf1缺失的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基介導(dǎo)
為了測試Smurf1沉默MSCs的分泌組是否具有顯著的成骨潛力，研究者研究了Smurf1沉默的大鼠MSCs的條件培養(yǎng)基（rCM-Smurf1）是否能夠增強(qiáng)體外和體內(nèi)的成骨分化。Smurf1沉默MSCs的分泌組可能通過旁分泌機(jī)制影響其他MSC群體的成骨分化。為此，研究者用rCM-Smurf1和轉(zhuǎn)染對照GapmeR的rMSCs的條件培養(yǎng)基（rCM-Ctrl）處理rMSCs 48小時(shí)，然后誘導(dǎo)成骨分化12天。研究者關(guān)注了，如Runx2和Alpl，以評(píng)估分化過程的初始階段。結(jié)果顯示，在用rCM-Smurf1處理的細(xì)胞中，成骨早期標(biāo)志物Runx2的表達(dá)在分化第8天略有增加，盡管這一增加并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，研究者觀察到，在第8天和第12天，用rCM-Smurf1處理的細(xì)胞中Alpl的表達(dá)水平顯著增加，表明在這種條件下成骨分化得到增強(qiáng)（圖1A）。用rCM-Smurf1預(yù)處理的細(xì)胞中ALPL活性顯著增加以及通過Alizarin Red染色測量的礦化水平也顯著更高（圖1A和B）。此外，為了分析rCM-Smurf1在體內(nèi)的成骨能力，研究者將rMSCs接種在藻酸鹽支架上，并用rCM-Smurf1和rCM-Ctrl預(yù)處理16小時(shí)，然后將其異位植入Sprague-Dawley大鼠的皮下位置（圖1B）。使用空支架（無細(xì)胞）和未處理的MSCs接種的支架作為對照。植入物在8周后被手術(shù)移除，并通過組織學(xué)技術(shù)分析新骨形成的程度。在用rCM-Smurf1預(yù)處理的細(xì)胞的支架中，骨基質(zhì)特別豐富，通過Masson-Goldner技術(shù)染色的膠原蛋白呈深藍(lán)色區(qū)域廣泛存在（圖1C）。在更高倍率下觀察，rCM-Smurf1樣本中嵌入基質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞被空區(qū)域包圍，類似于骨細(xì)胞在骨細(xì)胞陷窩內(nèi)的形態(tài)。新骨形成的定量分析清楚地表明，在rCM-Smurf1支架中骨基質(zhì)的存在顯著更高。此外，使用抗堿性磷酸酶（ALPL）和抗骨鈣素（OCN）抗體的免疫組化分析表明，與用rCM-Ctrl預(yù)處理的細(xì)胞接種的支架相比，用rCM-Smurf1預(yù)處理的細(xì)胞接種的支架中這些成骨蛋白的水平顯著更高。
圖1 體外和體內(nèi)MSCs的成骨作用增強(qiáng)，由Smurf1缺失的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基介導(dǎo)
2. Smurf1沉默的人類MSC條件培養(yǎng)基作為人類骨質(zhì)疏松癥MSC成骨分化的誘導(dǎo)劑
利用人類細(xì)胞系生成促成骨條件培養(yǎng)基（CM）將顯著簡化基于分泌組的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)過程。鑒于該項(xiàng)目的長期目標(biāo)是開發(fā)用于人類應(yīng)用的此類產(chǎn)品，研究者研究了在原代rMSCs中觀察到的效果是否能夠在人類MSC細(xì)胞系中復(fù)制。研究者通過使用20 nM的GapmeR濃度，在建立了SMURF1沉默條件。研究者評(píng)估了來自SMURF1沉默的ASC52telo的條件培養(yǎng)基（hCM-SMURF1）和在ASC52telo細(xì)胞系中產(chǎn)生的對照CM（hCM-Ctrl）的成骨潛力。研究者發(fā)現(xiàn)在用hCM-SMURF1預(yù)處理的ASC52telo細(xì)胞中，ALPL的表達(dá)有增加的趨勢。然而，與用hCM-Ctrl孵育的細(xì)胞相比，用hCM-SMURF1孵育的ASC52telo細(xì)胞的礦化水平顯著更高，這表明hCM-SMURF1對這一過程有積極作用。
在之前的研究中，研究者證明了骨質(zhì)疏松癥患者的骨髓MSCs（hMSCs-OP）與健康供體來源的MSCs相比，表現(xiàn)出顯著降低的成骨潛力。為了在體外評(píng)估CM-SMURF1作為潛在的促成骨治療劑的適用性，必須確定其在增強(qiáng)hMSCs-OP的成骨分化中的有效性。因此，研究者在人類MSC細(xì)胞系ASC52telo中轉(zhuǎn)染SMURF1或Ctrl GapmeRs，使用與之前相同的程序制備CM。然后評(píng)估這兩種CM（hCM-SMURF1和hCM-Ctrl）的促成骨能力，通過用這些CM預(yù)處理從骨質(zhì)疏松癥患者的股骨頭中分離的hMSCs-OP 48小時(shí)，然后開始成骨分化（圖2）。在23名符合研究者嚴(yán)格納入標(biāo)準(zhǔn)的骨質(zhì)疏松癥女性患者的原代細(xì)胞培養(yǎng)中，分別進(jìn)行分析。在成骨分化第20天的分析顯示，主要成骨基因RUNX2和ALPL的表達(dá)水平在兩組間沒有顯著差異。然而，在用hCM-SMURF1預(yù)處理的hMSCs-OP中觀察到ALPL表達(dá)有增加的趨勢（圖2A，上圖）。重要的是，在所有實(shí)驗(yàn)中，用hCM-SMURF1預(yù)處理的hMSCs-OP的堿性磷酸酶活性和礦化程度的顯著差異被清晰地觀察到（圖2A和B）。此外，與用hCM-SMURF1處理的原代細(xì)胞相比，用hCM-SMURF1處理的ALPL活性和礦化水平與用BMP2處理的水平高度相似（圖2A）。為了深入了解hCM-SMURF1如何影響骨形成，研究者使用了來自三名骨質(zhì)疏松癥患者的股骨頭的體外人骨培養(yǎng)。在適當(dāng)培養(yǎng)基中與hCM-SMURF1或hCM-Ctrl共培養(yǎng)。骨樣本在培養(yǎng)中維持4天，50%的CM。在此之后，骨樣本被分離，總mRNA被提取以定量關(guān)鍵骨穩(wěn)態(tài)標(biāo)志物的基因表達(dá)。有趣的是，來自轉(zhuǎn)染SMURF1 GapmeR的MSCs的CM顯示出RANKL表達(dá)水平顯著降低，RANKL是促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和激活的關(guān)鍵分子，導(dǎo)致骨吸收（圖2C，上圖）。作為RANKL的誘餌受體，OPG的表達(dá)水平保持不變，從而導(dǎo)致RANKL/OPG比率降低（圖2B，下圖）。這一比率反映了骨吸收和形成的平衡，較高的比率表明破骨細(xì)胞活性增加，可能導(dǎo)致骨丟失，而較低的比率表明骨吸收減少，可能有助于骨保護(hù)。然而，在M-CSF和BGLAP的水平上沒有觀察到顯著變化（圖2C，下圖）。
圖2 Smurf1沉默的人類MSC條件培養(yǎng)基作為人類骨質(zhì)疏松癥MSC成骨分化的誘導(dǎo)劑
3. CM-SMURF1的生物安全性及其對基本細(xì)胞功能的影響
研究者使用ASC52telo細(xì)胞系進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，以深入了解CM產(chǎn)生的生物安全性，并研究其對基本細(xì)胞功能的可能影響。最初，研究者通過在9天內(nèi)進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了hMSCs中SMURF1沉默的CM對細(xì)胞增殖的影響。研究者的發(fā)現(xiàn)在用hCM-SMURF1處理的細(xì)胞中，在第7天觀察到細(xì)胞增殖有適度但具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加，然而這種增殖效應(yīng)在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)并未持續(xù)（圖3A）。細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)以連續(xù)兩天的MTT吸光度比值表示（例如，第5天/第3天，第7天/第5天），提供相對生長動(dòng)態(tài)的分析，而不是絕對細(xì)胞數(shù)量。隨后，研究者試圖通過劃痕實(shí)驗(yàn)確定hCM-SMURF1在機(jī)械損傷后促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)的能力（圖3B）。在用不同CM處理的單層細(xì)胞中引入缺陷后，在0、12、24和36小時(shí)監(jiān)測恢復(fù)情況，直到平板表面被完全覆蓋。研究者觀察到用CM處理的細(xì)胞的遷移能力總體上有所改善，然而，研究者的結(jié)果表明用對照CM和hMSCs中SMURF1沉默的CM之間沒有顯著差異。為了研究不同CM對MSCs基本特性的影響，研究者研究了用CM-SMURF1孵育是否會(huì)影響MSCs的趨化反應(yīng)。為此，研究者使用基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1-α（SDF1-α）作為基準(zhǔn)趨化因子來評(píng)估MSCs的趨化反應(yīng)。與未加CM的對照細(xì)胞相比，CM-Ctrl和CM-SMURF1均顯示出比未處理的CM更強(qiáng)的吸引hMSCs的能力（圖3C）。研究者還注意到，與對照CM相比，向hCM-SMURF1的細(xì)胞遷移率顯著更高。
圖3 CM-SMURF1的生物安全性及其對基本細(xì)胞功能的影響
4. 從CMs中分離并鑒定囊泡分?jǐn)?shù)
接下來，研究者分離了hCM-SMURF1和hCM-Ctrl樣本中的細(xì)胞外囊泡（EVs）。通過納米粒子跟蹤分析（NTA）確定分離的EVs的總顆粒數(shù)和平均大小。分離的EVs的平均顆粒直徑為131.3 ± 3.7 nm（CM-Ctrl）和114.3 ± 6 nm（CM-SMURF1）（圖4A）。這表明兩種制備物中均存在納米級(jí)囊泡。主要峰值在50-150 nm范圍內(nèi)表明存在外泌體，外泌體的典型大小范圍為30-50 nm。透射電子顯微鏡（TEM）進(jìn)一步證實(shí)了兩種樣本中EVs的存在，顯示出分泌組非可溶性部分的典型囊泡結(jié)構(gòu)（圖4B）。為了進(jìn)一步鑒定分離的外泌體，研究者使用免疫珠子測定法，采用珠子結(jié)合捕獲抗體和熒光標(biāo)記的檢測抗體。流式細(xì)胞儀分析證實(shí)，來自CM-Ctrl和CM-SMURF1的外泌體在其表面均表達(dá)特定標(biāo)記物CD63和CD9（圖4C）。用Vybrant CM-Dil對外泌體染色，證實(shí)了MSCs成功攝取了分離的外泌體。使用活細(xì)胞共聚焦顯微鏡記錄了與標(biāo)記外泌體孵育2小時(shí)的ASC57telo細(xì)胞的高分辨率3D圖像（圖4D）。
圖4 從CMs中分離并鑒定囊泡分?jǐn)?shù)
5. 分析CM-SMURF1的可溶性和囊泡分?jǐn)?shù)的成骨活性
在建立了從hCM-Ctrl和hCM-SMURF1中分離可溶性（SF）和囊泡分?jǐn)?shù)（VF）的方法后，研究者研究了它們單獨(dú)誘導(dǎo)成骨分化的潛力。在誘導(dǎo)成骨之前，ASC52telo細(xì)胞用來自CM-Ctrl或CM-SMURF1的可溶性或囊泡分?jǐn)?shù)孵育48小時(shí)，按照已建立的未分離CM的相同方法進(jìn)行。隨后，替換培養(yǎng)基，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行成骨分化。在誘導(dǎo)后第16天分析成骨標(biāo)志物，結(jié)果顯示與CM-Ctrl相比，CM-SMURF1的可溶性分?jǐn)?shù)中RUNX2表達(dá)顯著增加。同樣，ALPL表達(dá)也增加，這通過與CM-Ctrl相比CM-SMURF1的可溶性分?jǐn)?shù)中增強(qiáng)的堿性磷酸酶活性得到證實(shí)（圖5A）。盡管在比較CM-Ctrl和CM-SMURF1的囊泡分?jǐn)?shù)時(shí)，上述參數(shù)未觀察到顯著變化，但在CM-Ctrl和CM-SMURF1的可溶性和囊泡分?jǐn)?shù)中，通過Alizarin Red染色定量的礦化程度顯著更高，這可能反映了兩種分?jǐn)?shù)在體外礦化過程中都有一定的貢獻(xiàn)（圖5A和B）。接下來，研究者試圖鑒定hCM-SMURF1和hCM-Ctrl的可溶性和囊泡分?jǐn)?shù)中差異調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。為此，研究者通過質(zhì)譜分析比較了來自四次獨(dú)立沉默實(shí)驗(yàn)的CM-Ctrl和hCM-SMURF1的可溶性和囊泡分?jǐn)?shù)的蛋白質(zhì)組。該研究鑒定了兩種分?jǐn)?shù)中的一些受影響蛋白質(zhì)（圖5C）。在這些蛋白質(zhì)中，研究者鑒定了在CM-SMURF1的可溶性分?jǐn)?shù)中過表達(dá)的關(guān)鍵骨形成調(diào)節(jié)因子PREPL和FMOD，而在CM-SMURF1的囊泡分?jǐn)?shù)中，SPARC和CCN2過表達(dá)。在所有情況下，通過qPCR驗(yàn)證的MS結(jié)果與MS分析中發(fā)現(xiàn)的這些蛋白質(zhì)的相對豐度一致（圖5D）。GO分析顯示，與CM-SMURF1外泌體分?jǐn)?shù)中顯著富集的蛋白質(zhì)相關(guān)的GO功能注釋生物學(xué)過程為“細(xì)胞外基質(zhì)組織”和“骨化”。
圖5 分析CM-SMURF1的可溶性和囊泡分?jǐn)?shù)的成骨活性
6. Smurf1沉默的細(xì)胞條件培養(yǎng)基減少OVX誘導(dǎo)的骨丟失
研究者使用了去卵巢（OVX）小鼠模型來模擬絕經(jīng)后女性的骨質(zhì)疏松癥，旨在評(píng)估轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（CM）對骨再生的影響。為了進(jìn)行這項(xiàng)分析，研究者首先在小鼠MSC系C3H10t1/2中生成了實(shí)驗(yàn)性CM，研究者能夠在這個(gè)細(xì)胞系中高效沉默Smurf1基因。在去卵巢手術(shù)后一周，研究者在小鼠股骨髓腔內(nèi)進(jìn)行了一次性注射（圖6A）。建立了三組OVX小鼠：一組注射NaCl（NaCl組），一組注射轉(zhuǎn)染對照GapmeR的小鼠MSCs的條件培養(yǎng)基（CM-Ctrl組），一組注射轉(zhuǎn)染Smurf1靶向GapmeR的小鼠MSCs的條件培養(yǎng)基（CM-Smurf1組）。還包含一個(gè)未進(jìn)行去卵巢手術(shù)的對照組（No-OVX組）（圖6B）。在注射后一個(gè)月，使用微計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro-CT）分析股骨遠(yuǎn)端的骨小梁變化（圖6A）。與未去卵巢的No-OVX小鼠相比，NaCl處理組的骨小梁顯著減少，骨骼幾乎耗盡了骨小梁結(jié)構(gòu)。重要的是，與OVX小鼠和CM-Ctrl組相比，注射CM-Smurf1的小鼠顯示出更高的骨小梁比例（圖6B）。進(jìn)一步的微CT參數(shù)分析顯示，與OVX和CM-Ctrl組相比，CM-Smurf1組的骨體積/總體積（BV/TV）比值顯著增加，表明Smurf1沉默的促成骨活性對CM的積極影響。CM-Smurf1的積極效應(yīng)也反映在骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁間距（Tb.sp）的值上，盡管在CM-Ctrl和CM-Smurf1組之間未觀察到顯著差異（圖6C）。
圖6 Smurf1沉默的細(xì)胞條件培養(yǎng)基減少OVX誘導(dǎo)的骨丟失
結(jié)論
研究發(fā)現(xiàn)Smurf1沉默后的外泌體中富集的蛋白質(zhì)與“細(xì)胞外基質(zhì)組織”和“骨化”相關(guān)，這表明這些蛋白質(zhì)可能在骨形成過程中發(fā)揮重要作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Smurf1沉默的細(xì)胞條件培養(yǎng)基（CM-Smurf1）顯著增加了骨小梁的骨量，減少了骨丟失。這表明CM-Smurf1具有促進(jìn)骨形成的潛力，可能成為治療骨質(zhì)疏松癥的有效手段。
實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞培養(yǎng)、GapmeR 技術(shù)沉默基因表達(dá)、條件培養(yǎng)基制備、體外成骨分化實(shí)驗(yàn)、卵巢切除（OVX）小鼠模型、體內(nèi)異位骨形成模型、體外人骨組織培養(yǎng)、外泌體分離、納米粒子跟蹤分析（NTA）、透射電子顯微鏡（TEM）和流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)分析、micro CT 掃描。
參考文獻(xiàn)
González-González A, álvarez-Iglesias I, García-Sánchez D, Dotta M, Reyes R, Alfonso-Fernández A, Bolado-Carrancio A, Díaz-Rodríguez P, Pérez-Nú?ez MI, Rodríguez-Rey JC, Delgado-Calle J, Pérez-Campo FM. Paracrine activity of Smurf1-silenced mesenchymal stem cells enhances bone regeneration and reduces bone loss in postmenopausal osteoporosis. Stem Cell Res Ther. 2025 Feb 7;16(1):50. doi: 10.1186/s13287-025-04165-0. PMID: 39920824; PMCID: PMC11806587.