CAFs中NNMT的m6A去甲基化通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞M2極化促進(jìn)胃癌進(jìn)展

癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）是胃癌（GC）腫瘤微環(huán)境中主要的間質(zhì)細(xì)胞，它們與免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相互作用，推動癌癥進(jìn)展。然而，這些相互作用與其作為治療靶點的潛在價值之間的確切聯(lián)系仍然不清楚。在這項研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)來自CAFs的NNMT促進(jìn)了M2巨噬細(xì)胞的極化，反過來又促進(jìn)了GC細(xì)胞的增殖和遷移。此外，我們還發(fā)現(xiàn)CAFs中的NNMT表達(dá)是通過FTO m6A去甲基化來調(diào)控的。NNMT和FTO在腫瘤組織和CAFs中均高表達(dá)，臨床樣本中FTO與NNMT水平之間存在正相關(guān)。從機(jī)制上講，F(xiàn)TO與NNMT mRNA結(jié)合，減少了m6A修飾并增強(qiáng)了NNMT表達(dá)。在CAFs中敲除NNMT或FTO有效地抑制了M2巨噬細(xì)胞的極化并抑制了GC的進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)已在患者來源的類器官模型和胃癌裸鼠模型中得到驗證。總的來說，我們的數(shù)據(jù)揭示了FTO通過調(diào)節(jié)CAFs中NNMT的m6A去甲基化促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化，從而推動GC進(jìn)展。這為胃癌的診斷和治療提供了一個潛在的全新靶點。本文于2024年12月發(fā)表于“Cancer Letters”（IF=9.1）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）CAFs促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化

患者來源的CAFs和NFs（圖1A）表達(dá)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物纖維連接蛋白。此外，作為腫瘤來源的成纖維細(xì)胞，CAFs與NFs相比，具有特異性表達(dá)PDGFRα、FAP和α-SMA的特性（圖1B和C）。WB結(jié)果與免疫熒光結(jié)果一致（圖1D）。為了研究CAFs與巨噬細(xì)胞極化之間的關(guān)系，我們建立了一個共培養(yǎng)系統(tǒng)。將CAFs和NFs與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析M1/M2巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物。結(jié)果顯示，與NFs + THP-1組相比，CAFs + THP-1組中CD206+（M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）的比例顯著增加，而CD86+（M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）的比例降低。這些發(fā)現(xiàn)表明CAFs在體外促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化（圖1E）。

2）CAFs促進(jìn)類器官模型和裸鼠GC增殖

我們成功構(gòu)建了胃癌患者來源的類器官（PDOs）并通過病理學(xué)方法對其進(jìn)行了驗證（圖2A）。當(dāng)與CAFs共培養(yǎng)時，類器官顯示出增強(qiáng)的生長，這可能是由于CAFs分泌的細(xì)胞因子促進(jìn)了胃癌增殖（圖2B）。為了驗證這一假設(shè)，我們將類器官培養(yǎng)在CAFs上清液（條件培養(yǎng)基，CM）和類器官擴(kuò)張培養(yǎng)基（GO）等比例混合的培養(yǎng)基中。EdU和Calcein-AM染色顯示，在DMEM和CM組中的類器官出現(xiàn)了顯著的細(xì)胞死亡，這可能是由于GO中缺少必要的生長因子。然而，GO + CM組與GO和GO + DMEM組相比，顯示出顯著增加的增殖。這些結(jié)果表明CAFs來源的上清液促進(jìn)了PDOs中胃癌的增殖（圖2C）。CAFs同樣促進(jìn)了多種胃癌細(xì)胞系的增殖，其中AGS細(xì)胞系的增殖最為顯著。因此，將CAFs與AGS細(xì)胞以1:1的比例混合，在裸鼠中建立皮下腫瘤模型。測量腫瘤大小和重量，結(jié)果顯示CAFs + AGS組的腫瘤體積和重量顯著大于NFs + AGS組（圖2E）。這表明CAFs能夠在體內(nèi)促進(jìn)胃癌生長。對腫瘤中的M1/M2巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行WB分析，結(jié)果顯示與NFs + AGS組相比，CAFs + AGS組中M1標(biāo)志物（CD86、TNF-α和iNOS）的水平降低，而M2標(biāo)志物（CD206、Arg-1和IL-10）的水平增加（圖2F）。綜上所述，這些結(jié)果表明CAFs通過促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化來增強(qiáng)胃癌增殖。

3）NNMT在GC組織中高表達(dá)，尤其是在CAFs中

我們之前的研究將NNMT識別為構(gòu)建"CAFS-score"預(yù)后模型中的四個關(guān)鍵基因之一。TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示NNMT在胃癌組織中的表達(dá)較高。這與我們對胃癌臨床樣本的RT-qPCR（圖3A）和WB（圖3B）實驗結(jié)果一致，并且其表達(dá)隨著病理分期的提高而增加（圖3C）。緊接著，我們對兩個胃癌單細(xì)胞數(shù)據(jù)集（GSE150290/GSE183904）進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并發(fā)現(xiàn)NNMT在胃癌組織的CAFs中高表達(dá)（圖3D）。同時在患者來源的CAFs和NFs中進(jìn)行了驗證（圖3E和F）。以上結(jié)果表明，NNMT在GC組織中高表達(dá)，尤其是在CAFs中。

4）NNMT敲低抑制巨噬細(xì)胞M2極化和腫瘤生長

NNMT敲減載體成功構(gòu)建并轉(zhuǎn)染入CAFs中（圖4A和B）。結(jié)果顯示，與CAFs-sh-NC組相比，CAFs-sh-NNMT組中FAP和α-SMA陽性細(xì)胞的數(shù)量減少，F(xiàn)AP和α-SMA的表達(dá)也降低。這表明NNMT敲減減弱了CAFs的成纖維細(xì)胞特性（圖4C–E）。同時，將CAFs-sh-NNMT與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)顯示，與CAFs-sh-NC + THP-1組相比，CAFs-sh-NNMT + THP-1組中CD206+細(xì)胞的比例顯著降低，而CD86+細(xì)胞的比例增加，表明在CAFs中敲減NNMT可以抑制M2巨噬細(xì)胞的極化（圖4F）。進(jìn)一步地，將CAFs-sh-NNMT與AGS細(xì)胞以1:1的比例混合后皮下注射到裸鼠中建立腫瘤模型。與CAFs-sh-NC + AGS組相比，CAFs-sh-NNMT + AGS組中的腫瘤在體積和重量上都更小，表明NNMT敲減抑制了胃癌腫瘤的生長（圖4G和H）。對腫瘤中的M1/M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行WB分析，結(jié)果顯示與CAFs-sh-NC + AGS組相比，CAFs-sh-NNMT + AGS組中CD86、TNF-α和iNOS的表達(dá)增加，而CD206、Arg-1和IL-10的表達(dá)減少（圖4I）。這些發(fā)現(xiàn)表明，NNMT敲減有效地抑制了CAFs介導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞極化，從而抑制了腫瘤的發(fā)展。

5）FTO在GC中高表達(dá)，與NNMT表達(dá)呈正相關(guān)

m6A去甲基化酶FTO可以在卵巢癌中調(diào)節(jié)NNMT的m6A去甲基化，但FTO是否在胃癌CAFs中調(diào)節(jié)NNMT表達(dá)尚未被研究。我們通過GEPIA數(shù)據(jù)庫預(yù)測了FTO在胃癌中的表達(dá)趨勢，結(jié)果顯示FTO在胃癌患者中高表達(dá)（圖5A）。進(jìn)一步分析了FTO與NNMT在胃癌中的表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者之間存在正相關(guān)關(guān)系（圖5B）。通過RT-qPCR（圖5C）和WB（圖5D）進(jìn)一步檢測了收集的NT和TT組織中的FTO表達(dá)，結(jié)果顯示TT組中的FTO表達(dá)顯著高于NT組。結(jié)合對TT組織中NNMT表達(dá)的預(yù)檢測，發(fā)現(xiàn)其與FTO的表達(dá)一一對應(yīng)，并通過Pearson分析了兩者的相關(guān)性，結(jié)果顯示TT組織中FTO與NNMT表達(dá)之間存在正相關(guān)（圖5E）。為了檢測不同腫瘤分期患者中FTO的差異表達(dá)，選擇了4個分期患者的TT組織進(jìn)行IHC染色，并檢測了每個組織中FTO陽性細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示，F(xiàn)TO陽性細(xì)胞數(shù)量與腫瘤疾病進(jìn)展相關(guān)（圖5F）。繼續(xù)檢測CAFs和NFs中的FTO表達(dá)，結(jié)果顯示與NFs相比，CAFs中的FTO表達(dá)升高（圖5G和H）。因此，F(xiàn)TO通過調(diào)節(jié)NNMT在GC進(jìn)展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

6）FTO通過降低NNMT m6A修飾水平促進(jìn)NNMT表達(dá)

為了檢測FTO對NNMT的調(diào)控作用，我們在CAFs中同樣轉(zhuǎn)染了FTO相關(guān)載體，并通過RT-qPCR和WB檢測載體轉(zhuǎn)染效率。FTO表達(dá)結(jié)果表明載體轉(zhuǎn)染成功（圖6A-B）。與CAFs-OE-NC組相比，CAFs-OE-FTO組NNMT的表達(dá)明顯升高，而CAFs-sh-FTO組NNMT的表達(dá)明顯降低，說明FTO正向調(diào)節(jié)NNMT的表達(dá)（圖6C-D）。然后用RIP檢測FTO是否與NNMT mRNA結(jié)合，結(jié)果顯示，與抗IgG對照組相比，抗FTO組的NNMT mRNA大量富集，表明FTO能夠識別并結(jié)合NNMT mRNA（圖6E）。為確定FTO對NNMT m6A修飾的調(diào)控作用，進(jìn)一步用MeRIP-qPCR檢測轉(zhuǎn)染FTO載體后NNMT mRNA m6A修飾水平，結(jié)果顯示，CAFs- OE-FTO組NNMT m6A水平降低，CAFs-sh-FTO組NNMT m6A水平升高（圖6F）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明FTO通過降低GC CAFs中NNMT m6A修飾水平來促進(jìn)NNMT的表達(dá)。

7）FTO通過上調(diào)CAFs中NNMT，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，從而調(diào)控GC進(jìn)程

將CAFs-sh-FTO與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測M1/M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，結(jié)果顯示與CAFs-sh-NC + THP-1組相比，CAFs-sh-FTO + THP-1組中CD206+細(xì)胞的比例降低，而CD86+細(xì)胞的比例升高，表明敲減FTO可以抑制M2巨噬細(xì)胞極化（圖7A）。將轉(zhuǎn)染了FTO載體的CAFs與AGS混合后皮下注射到裸鼠中。結(jié)果顯示，與CAFs-sh-NC + AGS組相比，CAFs-sh-FTO + AGS組的腫瘤體積和重量均減小，表明敲減FTO可以在體內(nèi)抑制胃癌腫瘤的生長（圖7B和C）。通過WB檢測腫瘤中M1/M2巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果顯示與CAFs-sh-NC + AGS組相比，CAFs-sh-FTO + AGS組中M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86、TNF-α和iNOS的表達(dá)升高，而M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206、Arg-1和IL-10的表達(dá)降低（圖7D）。這表明敲減FTO可以抑制TME中的M2巨噬細(xì)胞極化。最后，通過RT-qPCR（圖7E）和WB（圖7F）檢測腫瘤中NNMT mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示CAFs-sh-FTO + AGS組腫瘤中的NNMT表達(dá)顯著低于CAFs-sh-NC + AGS組。綜上所述，這些結(jié)果表明在CAFs中敲減FTO可以抑制NNMT的表達(dá)，并通過消除CAFs誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞極化來減緩胃癌的進(jìn)展。

結(jié)論：

我們證明了FTO和NNMT在GC組織和CAFs中高表達(dá)，并且FTO通過m6A去甲基化上調(diào)NNMT，從而促進(jìn)TAM的M2型極化并導(dǎo)致GC進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)為CAFs介導(dǎo)的TAM相互作用提供了新的視角，并為破壞CAFs介導(dǎo)的TME調(diào)節(jié)和改善患者預(yù)后提供了潛在的治療靶點。

實驗方法：

流式，CCK-8，Transwell，克隆形成，免疫熒光，EdU，western blot，qRT-PCR，免疫沉淀，免疫組化。

參考文獻(xiàn)：

Mak TK, Li K, Zhao Z, Wang K, Zeng L, He Q, Lu W, Chen W, He Y, Li J, Zhang C. m6A demethylation of NNMT in CAFs promotes gastric cancer progression by enhancing macrophage M2 polarization. Cancer Lett. 2024 Dec 24;611:217422. doi: 10.1016/j.canlet.2024.217422.