國自然熱點-SPP1+巨噬細胞

頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）是一種非常侵襲性疾病，其特征是腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）異質(zhì)性。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）是TIME中的主要天然免疫細胞群，它們參與惡性腫瘤進展中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)過程。SPP1陽性巨噬細胞（SPP1 + Macs）在許多癌癥中都有發(fā)現(xiàn)，但它們對頭頸部鱗狀細胞癌的影響尚不清楚。本研究旨在識別并驗證SPP1 + Macs在頭頸部鱗狀細胞癌惡性進展中的作用和功能。單細胞RNA測序（scRNA-seq）結(jié)果顯示，在頭頸部鱗狀細胞癌的腫瘤免疫微環(huán)境中，髓系細胞具有異質(zhì)性，并且與腫瘤細胞強烈相關(guān)，并識別出了與頭頸部鱗狀細胞癌患者預(yù)后不良正相關(guān)的腫瘤特異性SPP1陽性巨噬細胞。GSVA表明，SPP1陽性巨噬細胞積極參與細胞因子的產(chǎn)生。Luminex液態(tài)懸浮芯片檢測分析表明，SPP1陽性巨噬細胞來源的TNF-α和IL-1β起著重要作用。無論是在體外實驗還是體內(nèi)實驗中，以及使用VGX-1027（一種抑制巨噬細胞來源的TNF-α和IL-1β的抑制劑）都證實了SPP1陽性巨噬細胞來源的TNF-α和IL-1β通過支持腫瘤細胞的增殖和遷移來促進頭頸部鱗狀細胞癌的進展。從機制上講，，。此外，SPP1陽性巨噬細胞來源的TNF-α和IL-1β通過不同的信號通路促進了腫瘤細胞和其他鄰近巨噬細胞中OPN的表達。SPP1陽性巨噬細胞可能是一個候選靶點，通過它能夠增強抗腫瘤效果。本文于2024年12月發(fā)表于“J Exp Clin Cancer Res”（IF=11.4）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）在HNSCC臨床樣本中鑒定出腫瘤特異性SPP1⁺ Macs

為了確定頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的細胞組成，我們收集了5對相鄰的正常組織和腫瘤組織，并將其消化成單細胞懸液進行單細胞RNA測序分析（圖1A）。經(jīng)過質(zhì)量控制和不純細胞過濾后，保留了71,539個細胞的轉(zhuǎn)錄組進行后續(xù)分析。通過UMAP進行降維處理后，將這些細胞分為14個簇，然后歸類為九種主要細胞類型（圖1B，C），如下：上皮細胞，成纖維細胞，平滑肌細胞，內(nèi)皮細胞，肥大細胞，髓系細胞，漿細胞和T細胞。所有五種患者的相鄰正常組織和腫瘤組織中都存在這九種主要細胞類型。然而，每種細胞類型的浸潤程度不同，這可能反映了頭頸部鱗狀細胞癌階段的差異（圖1D）。為了進一步探索頭頸部鱗狀細胞癌的腫瘤免疫微環(huán)境（TIME），我們比較了相鄰正常組織和腫瘤組織之間免疫細胞和非免疫細胞的比例，并將免疫細胞分為五個亞群：B細胞（MS4A1和BANK1），肥大細胞（TPSAB1和CPA3），漿細胞（JCHAIN和TNFRSF17），髓系細胞（FPR3和MS4A4A）和T細胞（CD3D和CD3E）（圖1E，F）。與每位患者的相鄰正常組織相比，腫瘤組織中的髓系細胞、T細胞和肥大細胞的數(shù)量有所上調(diào)。在所有相鄰正常組織中，髓系細胞大約占免疫細胞的14.32%，但在患者腫瘤組織中，它們的比例各不相同，平均占免疫細胞的26.42%（圖1G）。腫瘤組織中髓系細胞的增加表明這些細胞可能與頭頸部鱗狀細胞癌的腫瘤進展有關(guān)。隨后使用CellChat探索免疫細胞與上皮細胞之間的通訊。與相鄰正常組織相比，腫瘤組織中髓系細胞與上皮細胞之間的相互作用明顯不同（圖1H）。因此，我們重點關(guān)注髓系細胞，并根據(jù)先前的研究將這些細胞分為七個亞群，其中cDC1s、cDC2s、pDCs和單核細胞分別以BIRC3、CD1C、GZMB和S100A8的高表達為特征。還識別出了三種不同的巨噬細胞亞群——SPP1+巨噬細胞、MNDA+巨噬細胞和IGKC+巨噬細胞（圖1I，J）。有趣的是，MNDA+巨噬細胞和IGKC+巨噬細胞在相鄰正常樣本中富集，而SPP1+巨噬細胞在幾乎所有腫瘤樣本中都有所增加（圖1I）。這些結(jié)果表明，SPP1+巨噬細胞可能在頭頸部鱗狀細胞癌的惡性進展中執(zhí)行不同的功能。

2）腫瘤特異性SPP1⁺ Macs與HNSCC不良預(yù)后呈正相關(guān)

在研究了腫瘤和相鄰正常組織之后，我們接下來調(diào)查了髓系細胞中SPP1的表達?；鹕綀D和UMAP圖顯示，SPP1在髓系細胞中顯著上調(diào)，并且在巨噬細胞中高表達（圖2A，B）。此外，SPP1+巨噬細胞在腫瘤組織中的髓系細胞總數(shù)中占49.77%，而在相鄰正常組織的髓系細胞總數(shù)中僅占19.52%（圖2C）。免疫組化染色（MIHC）揭示，SPP1與CD68+細胞顯著共定位，并且SPP1在來源于頭頸部鱗狀細胞癌腫瘤組織的巨噬細胞中的表達高于來源于相鄰正常組織的巨噬細胞（圖2D，E）。SPP1在頭頸部鱗狀細胞癌腫瘤樣本中的表達顯著高于正?？谇簧掀そM織樣本（圖2F）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，SPP1表達與TNM分期呈正相關(guān)（圖2G）。此外，SPP1的曲線下面積（AUC）為0.8495，這表明SPP1可能是頭頸部鱗狀細胞癌的生物標志物（圖2H）。SPP1表達較高的患者生存率較低（圖2I）。對TCGA數(shù)據(jù)的分析揭示了相同的發(fā)現(xiàn)，這表明SPP1+巨噬細胞與不良預(yù)后相關(guān)，且SPP1表達水平與頭頸部鱗狀細胞癌患者的癌癥分期和腫瘤等級呈正相關(guān)（圖2J）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明SPP1在頭頸部鱗狀細胞癌中上調(diào)，并且主要在巨噬細胞中表達，這表明SPP1作為預(yù)后生物標志物的潛在價值。

3）SPP1⁺ Macs通過分泌細胞因子促進HNSCC進展

為了評估SPP1+巨噬細胞對頭頸部鱗狀細胞癌的生物學(xué)影響，我們將巨噬細胞分為兩個亞群，SPP1+巨噬細胞和其他所有巨噬細胞，并基于單細胞RNA測序數(shù)據(jù)進行了GSVA。結(jié)果表明，與普通巨噬細胞相比，SPP1+巨噬細胞積極參與細胞因子的產(chǎn)生（圖3A）。因此，我們假設(shè)SPP1+巨噬細胞可能通過分泌細胞因子促進頭頸部鱗狀細胞癌的進展。在這里，我們利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)在THP-1細胞中過表達或敲減SPP1。在用PMA處理48小時誘導(dǎo)THP-1細胞分化為巨噬細胞后，通過western blotting和實時PCR分別測量了THP-1細胞來源的巨噬細胞中SPP1的蛋白質(zhì)和mRNA水平（圖3B）。為了研究SPP1+巨噬細胞對頭頸部鱗狀細胞癌細胞的直接或間接影響，我們從SPP1陰性對照組（SPP1-NC；SPP1-NC THP-1細胞來源的巨噬細胞）和SPP1過表達組（SPP1-OE；SPP1-OE THP-1細胞來源的巨噬細胞）收集了細胞培養(yǎng)上清液，用于進一步的間接培養(yǎng)HN6和CAL27細胞，同時使用另一個共培養(yǎng)模型來探索直接影響（圖3C）。與SPP1-NC相比，SPP1-OE在直接和間接培養(yǎng)系統(tǒng)中都促進了HN6和CAL27細胞的增殖，而直接共培養(yǎng)系統(tǒng)強烈加速了頭頸部鱗狀細胞癌細胞的生長（圖3D，E）。SPP1-OE顯著促進了HN6和CAL27細胞的遷移（圖3F，G）。為了進一步探索SPP1+巨噬細胞釋放哪些候選細胞因子作用于頭頸部鱗狀細胞癌細胞，我們使用了Luminex液相懸浮芯片檢測來比較SPP1-NC組和SPP1-OE組之間40種常見趨化性和炎癥性細胞因子的表達。與SPP1-NC組相比，SPP1-OE組中差異表達最高的5種細胞因子是MIF、CXCL8、CXCL5、TNF-α和IL-1β（圖3H, I）。隨后，我們使用ELISA測量了這些細胞因子在SPP1-NC組和SPP1-OE細胞組新鮮上清液中的濃度。結(jié)果表明，MIF、TNF-α和IL-1β是在SPP1-OE巨噬細胞中上調(diào)最顯著且高表達的基因（圖3J, K）。因此，在后續(xù)實驗中，我們重點關(guān)注了這三種因素。

4）SPP1⁺ Mac衍生的TNF-α和IL-1β在體外加速HNSCC細胞的增殖和遷移

為了研究SPP1+巨噬細胞來源的TNF-α和IL-1β是否促進頭頸部鱗狀細胞癌細胞增殖，用添加TNF-α和IL-1β的巨噬細胞上清液或VGX-1027處理腫瘤細胞，比較巨噬細胞對腫瘤細胞的影響。MTT試驗和共培養(yǎng)集落形成試驗顯示，與SPP1-NC細胞組相比，SPP1-NC + rhTNF-α、SPP1-NC + rhIL-1β和SPP1-NC + rhTNF-α + rhIL-1β細胞組顯著增加了HN6和CAL27細胞的增殖（圖4A, B）。隨后，我們將VGX-1027添加到SPP1-NC和SPP1-OE組的上清液中以阻斷TNF-α和IL-1β的效果，發(fā)現(xiàn)SPP1-OE組的增殖率顯著降低，而SPP1-NC組的增殖率略有降低（圖4C, D）。結(jié)果表明，抑制巨噬細胞來源的TNF-α和IL-1β減少了腫瘤細胞的生長，并且SPP1-NC也表現(xiàn)出TNF-α和IL-1β的分泌。同樣，當與SPP1-KD細胞培養(yǎng)時，rhTNF-α和rhIL-1β促進了HNSCC細胞的生長（圖4E, F），這表明TNF-α和IL-1β在SPP1+巨噬細胞中的功能與SPP1不同。傷口愈合和Transwell遷移試驗顯示，SPP1-NC+rhTNF-α、SPP1-NC+rhIL-1β、SPP1+rhTNF-α+rhIL-1β、SPP1-KD+rhTNF-α或SPP1-KD+rhIL-1β處理強烈加速了這些細胞的遷移，而VGX-1027處理顯著減緩了HNSCC細胞的遷移（圖4G, H）。這些結(jié)果共同表明，TNF-α和IL-1β可能在SPP1+巨噬細胞促進HNSCC細胞體外增殖和遷移的過程中發(fā)揮主要作用。

5）SPP1⁺ Macs分泌的TNF-α和IL-1β受NF-κB信號通路調(diào)控

在建立了SPP1+巨噬細胞與TNF-α和IL-1β之間的聯(lián)系之后，我們接下來研究了它們分泌的機制。我們對單細胞RNA測序數(shù)據(jù)的GSVA揭示了SPP1+巨噬細胞與I kappa B/激酶nf-kappa B信號通路相關(guān)（圖3A）。因此，我們研究了NF-kappa B信號通路是否影響SPP1+巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β。我們用PDTC（一種選擇性的NF-kappa B抑制劑）預(yù)處理SPP1-NC和SPP1-OE巨噬細胞3小時，以評估SPP1-OE巨噬細胞的影響。與SPP1-NC巨噬細胞相比，SPP1-OE巨噬細胞表現(xiàn)出p65和IκBα的磷酸化增加以及IκBα表達的減少。PDTC處理減弱了p65和IκBα的磷酸化（圖5A）。在SPP1-NC巨噬細胞中，p65主要定位于細胞質(zhì)中，而在SPP1-OE巨噬細胞中，p65在細胞核中積累。經(jīng)過PDTC預(yù)處理后，p65保持在細胞質(zhì)中（圖5B）。共聚焦顯微鏡的結(jié)果也證實了這些結(jié)果，并表明NF-kappa B信號通路可能在SPP1+巨噬細胞中被激活（圖5C）。隨后，我們使用ELISA來確定PDTC抑制巨噬細胞中的NF-kappa B信號是否減少了TNF-α和IL-1β的分泌。PDTC顯著減少了SPP1-NC和SPP1-OE巨噬細胞分泌的TNF-α和IL-1β（圖5D, E）。此外，MTT和Transwell遷移實驗顯示，用PDTC預(yù)處理巨噬細胞后，與這些巨噬細胞共培養(yǎng)的HN6和CAL27細胞的增殖和遷移被抑制（圖5F, G）。總之，我們的發(fā)現(xiàn)表明，SPP1+巨噬細胞通過激活NF-kappa B信號通路增加了TNF-α和IL-1β的分泌。

6）SPP1⁺ Mac衍生的TNF-α和IL-1β促進巨噬細胞和腫瘤細胞中OPN的表達

為了進一步探索SPP1+巨噬細胞分泌的TNF-α和IL-1β如何促進頭頸部鱗狀細胞癌的進展，我們將重組人TNF-α（rhTNF-α）和重組人IL-1β（rhIL-1β）單獨以及同時添加到HN6和CAL27腫瘤細胞中。先前的研究表明，TNF-α和IL-1β在不同細胞類型中激活PI3K/Akt、NF-κB、MAPK/Erk和STAT3信號通路。因此，我們檢測了哪個信號通路與TNF-α和IL-1β調(diào)節(jié)腫瘤細胞的能力相關(guān)。Western blot分析顯示，在HN6和CAL27細胞中，NF-κB信號通路被單獨的TNF-α和IL-1β以及TNF-α和IL-1β共同激活（圖6A）。此外，PDTC減少了TNF-α和IL-1β誘導(dǎo)的腫瘤細胞增殖和遷移能力的增加（圖6B-E）。有趣的是，我們還觀察到當腫瘤細胞用TNF-α或IL-1β處理時，OPN表達也會增加，而當它們同時用TNF-α和IL-1β處理時，顯示出雙重效果（圖6A, F-G）。我們進一步使用流式細胞術(shù)檢測表達，并使用PDTC抑制功能（圖6G, H）。結(jié)果顯示，TNF-α和IL-1β激活了NF-κB信號通路，然后促進了腫瘤細胞中OPN表達和腫瘤細胞進展。鑒于TNF-α和IL-1β促進了腫瘤細胞中OPN的表達，我們想知道TNF-α和IL-1β是否也促進鄰近巨噬細胞中OPN的表達。當巨噬細胞用TNF-α或IL-1β單獨處理或同時用TNF-α和IL-1β處理時，OPN在蛋白質(zhì)和mRNA水平上的表達均上調(diào)（圖6I）。然而，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-1β在巨噬細胞中激活了STAT3，但沒有激活NF-κB信號通路。在用TNF-α和IL-1β處理的巨噬細胞中使用Stattic（一種阻斷STAT3的藥物）減少了OPN表達（圖6J-L）。簡而言之，SPP1+巨噬細胞來源的TNF-α和IL-1β促進了巨噬細胞和腫瘤細胞中OPN的表達。

7）SPP1⁺ Macs促進HNSCC在體內(nèi)的進展

為了進一步驗證SPP1+巨噬細胞對體內(nèi)頭頸部鱗狀細胞癌生長的影響，我們使用了HN6 HNSCC腫瘤細胞與從THP-1細胞分化的巨噬細胞按7:3比例混合的方法來建立小鼠模型。經(jīng)過VGX-1027或PDTC處理3小時后，將SPP1-NC、SPP1-OE、SPP1-KD、SPP1-OE + VGX-1027或SPP1-OE + PDTC細胞組皮下注射到裸鼠中（圖7A）。為了保持持久的效果，我們每隔3天圍繞腫瘤注射VGX-1027和PDTC。有趣的是，SPP1-KD、SPP1-OE + VGX-1027和SPP1-OE + PDTC組的腫瘤重量和體積顯著低于SPP1-NC組（圖7B-D）。在取出移植腫瘤后，進行了IHC染色和多重免疫組化染色，以探索OPN、TNF-α和IL-1β的表達水平。兩種染色結(jié)果均表明，SPP1-OE、SPP1-OE + VGX-1027和SPP1-OE + PDTC組的OPN表達高于其他組。我們還發(fā)現(xiàn)，SPP1-OE + PDTC組的OPN表達低于其他兩組，這可能表明PDTC如我們之前所示抑制了腫瘤細胞中OPN的表達。TNF-α和IL-1β在SPP1-OE + VGX-1027和SPP1-OE + PDTC組的表達低于SPP1-OE組，甚至低于SPP1-NC組，此外，結(jié)果顯示OPN、TNF-α和IL-1β在SPP1-KD組的表達最低（圖7E, F）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明SPP1+巨噬細胞通過激活NF-kappa B信號通路分泌細胞因子TNF-α和IL-1β來促進HNSCC的進展。

結(jié)論：

SPP1陽性巨噬細胞激活NF-kappa B途徑，增加TNF-α和IL-1β的分泌，這促進了頭頸部鱗狀細胞癌細胞的增殖和遷移。我們還證明了TNF-α和IL-1β在腫瘤細胞和巨噬細胞中上調(diào)了OPN的表達；因此，這些因素可能成為通過增強抗腫瘤效果來提高療效的候選靶點。

實驗方法：

單細胞測序，RT-PCR，Western blot，IHC，免疫熒光，mIHC，免疫細胞化學(xué)，芯片檢測，ELISA，MTT，克隆形成實驗，transwell，傷口愈合實驗，流式。

參考文獻：

Liu C, Wu K, Li C, Zhang Z, Zhai P, Guo H, Zhang J. SPP1+?macrophages promote head and neck squamous cell carcinoma progression by secreting TNF-α and IL-1β. J Exp Clin Cancer Res. 2024 Dec 26;43(1):332. doi: 10.1186/s13046-024-03255-w.