長鏈非編碼RNA Malat1可預(yù)防骨質(zhì)疏松和骨轉(zhuǎn)移
骨質(zhì)疏松癥以骨密度降低、骨脆性增加和骨折易感性增加為特征，反映了破骨細(xì)胞骨吸收超過成骨細(xì)胞骨形成的不平衡，并加速骨轉(zhuǎn)移。原發(fā)性骨質(zhì)疏松發(fā)生在衰老過程中，尤其是絕經(jīng)后女性。繼發(fā)性骨質(zhì)疏松與原發(fā)性骨質(zhì)疏松的結(jié)局相同，但由某些疾病或藥物引起。在這兩種情況下，過度的破骨細(xì)胞生成起著關(guān)鍵作用，并為治療干預(yù)提供了機會。破骨細(xì)胞是一類多核巨細(xì)胞（MGC），起源于單核/巨噬細(xì)胞譜系，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)和礦物質(zhì)的吸收。破骨細(xì)胞的生成由巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）啟動，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞標(biāo)志物如組織蛋白酶K（CTSK）和酸性磷酸酶5（ACP5，也稱為TRAP）的表達(dá)，隨后破骨細(xì)胞前體成熟和細(xì)胞-細(xì)胞融合。作為破骨細(xì)胞生成的主要調(diào)節(jié)因子，活化T細(xì)胞核因子1（NFATC1）被RANKL誘導(dǎo)，進(jìn)而與其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體，激活其編碼基因以及其他參與破骨細(xì)胞黏附、細(xì)胞融合和骨吸收的基因的轉(zhuǎn)錄。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度超過200個核苷酸且不翻譯成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本，通過與DNA、其他RNA和蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮功能。lncRNA通常進(jìn)化保守性較低。MALAT1是一個高度保守的核內(nèi)長鏈非編碼RNA，在的組織中大量表達(dá)。根據(jù)siRNA敲低培養(yǎng)細(xì)胞系的結(jié)果，MALAT1已被證明調(diào)節(jié)選擇性前體mRNA剪接。然而，目前缺乏MALAT1改變在低BMD和骨質(zhì)疏松中發(fā)揮作用的功能證據(jù)。該研究發(fā)表在《Nature Communications》，IF：16.6。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. MALAT1在人類和小鼠破骨細(xì)胞分化過程中下調(diào)
CMPs可分化為單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是破骨細(xì)胞的前體。作者分析了人胎盤CD14+巨噬細(xì)胞向MGCs分化過程中的基因表達(dá)（圖1a），其中破骨細(xì)胞是的主要細(xì)胞群。與CD14+巨噬細(xì)胞相比，MGCs中破骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)升高，包括NFATC1、CTSK、DCSTAMP、ATP6V0D2、ATP6V0E2和ATP6V0A1（圖1b，c）。相反，相對于CD14+巨噬細(xì)胞，MALAT1在MGCs中顯著下調(diào)（圖1a-c）。與破骨細(xì)胞的功能一致，基因集富集分析表明，與CD14+巨噬細(xì)胞相比，在MGCs中富集的基因集與膠原組織、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)重塑和骨骼發(fā)育相關(guān)（圖1d）。為了進(jìn)一步驗證Malat1在巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中的下調(diào)，作者用可溶性RANKL處理小鼠巨噬細(xì)胞/前破骨細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7，以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。在此處理后，破骨細(xì)胞的標(biāo)志物，包括NFATC1，Ctsk和Trap5，以時間依賴性的方式上調(diào)（圖1e-g），而Malat1的表達(dá)水平顯著降低（圖1h）。綜上所述，這些結(jié)果揭示了MALAT1作為一個lncRNA在人類和小鼠的破骨細(xì)胞生成過程中下調(diào)。
脂多糖（LPS）和TNF-α參與病理性破骨細(xì)胞生成。與之前的報告一致，作者觀察到單獨的LPS處理不足以啟動破骨細(xì)胞分化；相反，當(dāng)RAW264.7細(xì)胞用RANKL預(yù)處理時，LPS處理促進(jìn)了破骨細(xì)胞的生成，如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色所示（圖1i，j），這是一種廣泛使用的破骨細(xì)胞標(biāo)志物（圖1k），并上調(diào)了NFATC1和Ctsk的表達(dá)（圖1k）。另一方面，TNF-α可以通過依賴和不依賴RANKL的方式誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。事實上，作者發(fā)現(xiàn)用TNF-α處理RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和NFATC1和Ctsk的表達(dá)，無論是否用RANKL預(yù)處理（圖1i，l，m）。值得注意的是，Malat1在LPS或TNF-α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過程中顯著下調(diào)（圖1k，m）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Malat1可能參與對各種刺激做出反應(yīng)的破骨細(xì)胞生成。
圖1 MALAT1在破骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)下調(diào)
2. 遺傳模型顯示Malat1可預(yù)防骨質(zhì)疏松和骨轉(zhuǎn)移
為了研究Malat1在破骨細(xì)胞生成和骨質(zhì)疏松中的作用，作者使用了作者之前研究中描述的Malat1敲除小鼠模型（Malat1?/?），在Malat1的轉(zhuǎn)錄起始位點的下游插入一個轉(zhuǎn)錄終止子，導(dǎo)致Malat1 RNA表達(dá)的丟失，而不改變Malat1的鄰近基因的表達(dá)水平。此外，作者之前在小鼠中構(gòu)建了ROSA26基因座的Malat1轉(zhuǎn)基因靶向表達(dá)（Malat1Tg/Tg)，這使作者能夠通過產(chǎn)生Malat1?/?；Malat1Tg/Tg動物，在Malat1?/?小鼠中進(jìn)行遺傳拯救研究。作者收集了Malat1+/+，Malat1?/?，Malat1?/?小鼠的各種組織，包括骨髓，胃，結(jié)腸，小腸，肝臟和胰腺組織；Malat1Tg/Tg小鼠，通過qPCR檢測Malat1的表達(dá)水平。
通過對6個月大的動物進(jìn)行股骨微計算機斷層掃描（μCT）分析，作者發(fā)現(xiàn)雄性和雌性Malat1?/?小鼠的骨密度比年齡和性別匹配的Malat1+/+小鼠低得多；重要的是，這種骨質(zhì)疏松表型在Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠中得到了挽救（圖2a，b）。μCT數(shù)據(jù)的定量顯示，與Malat1+/+小鼠相比，骨小梁密度（圖2c，d）在Malat1?/?小鼠中顯著減少，并且這些減少在很大程度上被Malat1表達(dá)的遺傳恢復(fù)所逆轉(zhuǎn)（圖2c，d）。TRAP染色顯示，與Malat1+/+小鼠相比，Malat1?/?小鼠股骨中破骨細(xì)胞顯著增加，并且這種增加在Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠中被逆轉(zhuǎn)（圖2e）。股骨破骨細(xì)胞的定量分析顯示，相對于Malat1+/+小鼠，每骨周長的破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖2f）和每骨表面的破骨細(xì)胞表面（圖2g）在Malat1?/?小鼠中升高約2倍。
接下來，為了確定Malat1在調(diào)節(jié)骨病理性丟失中的作用，作者使用了一個成熟的炎癥性骨吸收小鼠模型，包括向顱骨皮下注射LPS。μCT成像顯示，與Malat1+/+或Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠相比，給8周齡的Malat1?/?小鼠注射LPS后，顱骨表面的骨質(zhì)破壞顯著加重（圖2h，i）。TRAP染色和定量顯示，注射LPS后，Malat1?/?小鼠的每骨周長有更高的破骨細(xì)胞數(shù)量（圖2j，k）和更多的破骨細(xì)胞表面每骨表面（圖2j，l），Malat1+/+或Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明Malat1缺乏促進(jìn)生理和炎癥條件下的骨質(zhì)疏松。
圖2 Malat1預(yù)防骨質(zhì)疏松
未經(jīng)治療的骨質(zhì)疏松癥與的癌癥患者骨轉(zhuǎn)移加速相關(guān)。治療骨質(zhì)疏松的藥物，如抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收的雙膦酸鹽，已被用于治療骨疾病，包括骨轉(zhuǎn)移。為了確定宿主中的Malat1是否對骨轉(zhuǎn)移具有保護作用，作者將熒光素酶標(biāo)記的B16F1黑色素瘤細(xì)胞注射到6個月大的雄性Malat1+/+，Malat1?/?，或Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠的脛骨中，作者發(fā)現(xiàn)宿主中的Malat1缺失顯著加劇了骨轉(zhuǎn)移，Malat1的重新表達(dá)挽救了這一表型。通過活體動物的生物發(fā)光成像（圖3a）和解剖的骨骼（圖3b，c），以及骨骼中可見腫瘤的肉眼檢查進(jìn)行測量（圖3d）。
圖3 Malat1保護黑色素瘤和乳腺腫瘤細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移
鑒于骨是乳腺癌的常見轉(zhuǎn)移部位，作者在3個月大的雌性Malat1+/+，Malat1?/?，和Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠的脛骨內(nèi)注射EO771細(xì)胞系，EO771細(xì)胞系來源于C57BL/6背景下的小鼠乳腺腫瘤。注射2×105熒光素酶標(biāo)記的EO771細(xì)胞后，3組動物在注射當(dāng)天的生物發(fā)光信號基線水平無明顯差異。在研究終點，作者觀察到Malat1?/?小鼠的信號顯著高于Malat1+/+和Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠（圖3e）。安樂死后，作者收集脛骨進(jìn)行離體成像（圖3f，g），證實了在體成像結(jié)果。作者還對脛骨進(jìn)行了x線成像，發(fā)現(xiàn)Malat1?/?小鼠有更多的溶骨性病變（圖3h）。此外，骨切片的he染色顯示，Malat1?/?小鼠的脛骨中有更高的腫瘤負(fù)荷，證據(jù)是靠近生長板的骨皮質(zhì)中有更多的癌變，腫瘤區(qū)域更深地延伸到遠(yuǎn)端骨髓腔（圖3i）。免疫組織化學(xué)染色RFP（與熒光素酶共表達(dá)）支持組織學(xué)分析（圖3i）。此外，TRAP染色顯示，與Malat1+/+和Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠相比，Malat1?/?小鼠脛骨中破骨細(xì)胞數(shù)量增加（圖3j-1）。結(jié)合B16F1模型的結(jié)果，這些發(fā)現(xiàn)共同表明，宿主小鼠中Malat1的缺失加劇了黑色素瘤和乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性骨定植。
3. 骨質(zhì)疏松、骨肉瘤或乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者骨組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析
為了評估MALAT1在骨質(zhì)疏松和骨轉(zhuǎn)移中的臨床相關(guān)性，作者分析了人類骨組織的單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)集包括：GSE190772樣本來自2例乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者，GSE162454樣本來自6例骨肉瘤患者，以及GSE169396特征為1例非骨質(zhì)疏松個體和3例骨質(zhì)疏松患者（髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中采集的股骨頭）的骨組織。骨肉瘤和乳腺癌骨轉(zhuǎn)移常表現(xiàn)出溶骨性特征。
作者使用“和諧”法去除樣本間的批間效應(yīng)，隨后應(yīng)用降維法對基于標(biāo)記基因的細(xì)胞類型進(jìn)行注釋。這些分析確定了不同患者組的細(xì)胞簇特異性轉(zhuǎn)錄組。然后，作者分析了非骨質(zhì)疏松個體（圖4a，b）、骨質(zhì)疏松患者（圖4c，d）、骨肉瘤患者（圖4e，f）和乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者（圖4g，h）的前破骨細(xì)胞（包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）和成熟破骨細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)。在每組中，與前破骨細(xì)胞相比，MALAT1在破骨細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著降低（圖4b，d，f，h）。骨質(zhì)疏松、骨肉瘤或乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的前破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)水平顯著低于非骨質(zhì)疏松個體（圖4i-k）。這些發(fā)現(xiàn)表明，破骨細(xì)胞中MALAT1表達(dá)的降低與骨質(zhì)疏松和骨病變相關(guān)，包括乳腺癌轉(zhuǎn)移和骨肉瘤。
圖4：骨質(zhì)疏松癥、骨肉瘤或乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者骨組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析
4. Malat1缺陷通過激活NFATC1促進(jìn)破骨細(xì)胞生成
由于作者研究中使用的Malat1?/?和Malat1Tg/Tg動物是全身敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠，因此上述觀察到的骨質(zhì)疏松表型可能是也可能不是破骨細(xì)胞前體中Malat1缺失的直接影響。為了解決這個問題，作者從Malat1+/+，Malat1?/?，和Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠中分離出原代骨髓來源的巨噬細(xì)胞（BMMs），然后用M-CSF和RANKL處理這些破骨細(xì)胞前體4-6天，誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化。qPCR證實了BMMs中的基因消融和Malat1表達(dá)恢復(fù)（圖5a）。在M-CSF和RANKL誘導(dǎo)分化后，作者通過TRAP染色檢測破骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)敲除Malat1導(dǎo)致TRAP陽性多核破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而重新表達(dá)Malat1逆轉(zhuǎn)了觀察到的破骨細(xì)胞生成的誘導(dǎo)（圖5b）。破骨細(xì)胞標(biāo)志物Ctsk和Trap5的mRNA水平在Malat1?/?細(xì)胞中明顯高于Malat1+/+和Malat1?/?；RANKL處理后Malat1Tg/Tg細(xì)胞（圖5c，d）。
圖5 Malat1缺陷通過NFATC1促進(jìn)破骨細(xì)胞生成
作者還使用CRISPR干擾（CRISPRi）在細(xì)胞系中敲低Malat1。選取sgRNA-2和sgRNA-3在RAW264.7細(xì)胞中敲低Malat1，并通過qPCR進(jìn)行驗證（圖5e），得到的兩個敲低Malat1的穩(wěn)定細(xì)胞株分別命名為Malat1 KD1和Malat1 KD2。RANKL誘導(dǎo)分化后，Malat1 KD1和Malat1 KD2細(xì)胞比對照RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生更多的trap陽性多核破骨細(xì)胞（圖5f）。鬼筆環(huán)肽和DAPI分別對F-actin環(huán)和細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色，結(jié)果顯示Malat1 KD1和Malat1 KD2細(xì)胞的每個破骨細(xì)胞的細(xì)胞核數(shù)量高于對照細(xì)胞（圖5g）。此外，在RANKL處理的RAW264.7細(xì)胞中，敲低Malat1可以上調(diào)Ctsk和Trap5的mRNA水平（圖5h，i）?？偟膩碚f，原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的結(jié)果表明，破骨細(xì)胞前體中Malat1的缺失促進(jìn)了RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。
接下來，作者將RANKL刺激時間延長至2天和5天，發(fā)現(xiàn)Malat1缺乏不影響Mitf、Erk1/2、c-Fos、IκBα、Creb1和p38的水平。另一方面，與Malat1+/+和Malat1?/?；Malat1Tg/Tg骨髓基質(zhì)細(xì)胞相比，Malat1敲除骨髓基質(zhì)細(xì)胞更多地誘導(dǎo)了NFATC1及其轉(zhuǎn)錄靶Ctsk（圖5j）。作者在RANKL處理的Malat1 KD1和Malat1 KD2 RAW264.7細(xì)胞中觀察到類似的結(jié)果（圖5k）。已知NFATC1作為其自身的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。與Malat1野生型相比，Malat1敲除的BMMs和RAW264.7細(xì)胞在RANKL刺激后顯示出更多的NFATC1 mRNA水平的誘導(dǎo)（圖5l，m）。Ctsk，一個經(jīng)典的NFATC1靶基因，包含兩個NFATC1結(jié)合位點在啟動子區(qū)域（圖5n）。染色質(zhì)免疫沉淀-qPCR檢測顯示，在RANKL處理后，Malat1敲低的RAW264.7細(xì)胞顯示NFATC1占據(jù)了比對照RAW264.7細(xì)胞更多的這兩個區(qū)域（圖5o，p）。重要的是，在敲低Malat1的RAW264.7細(xì)胞中，敲低NFATC1逆轉(zhuǎn)了RANKL刺激下對破骨細(xì)胞生成和Ctsk表達(dá)的誘導(dǎo)（圖5q，r）。綜上所述，這些結(jié)果表明Malat1缺失通過NFATC1促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。
作者還試圖確定Malat1過表達(dá)的影響。Malat1是一種高度富集的lncRNA，作者通過多種方法進(jìn)行了測試，并僅通過piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和電穿孔在RAW264.7細(xì)胞中過表達(dá)Malat1。在野生型細(xì)胞和小鼠中實現(xiàn)顯著的Malat1過表達(dá)的挑戰(zhàn)限制了對其過表達(dá)效應(yīng)的全面研究。然而，考慮到前破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中MALAT1表達(dá)的減少與骨質(zhì)疏松和骨轉(zhuǎn)移相關(guān)（圖4i-k），作者的功能缺失方法，再加上MALAT1在MALAT1缺陷小鼠和細(xì)胞系中的重新表達(dá)，適合于這項研究。
5. Malat1結(jié)合TEAD3抑制NFATC1活性和破骨細(xì)胞生成
Malat1如何調(diào)控NFATC1與其他蛋白的結(jié)合可以激活或抑制NFATC1的轉(zhuǎn)錄活性，而lncRNA通常通過與蛋白的相互作用來發(fā)揮其功能，Malat1已經(jīng)證明了這種作用模式。作者推測Malat1可能通過與NFATC1和/或其結(jié)合蛋白相互作用來調(diào)節(jié)NFATC1的自動擴增環(huán)路，因此作者搜索了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫Mentha（http://mentha.uniroma2.it/index.php）。
作者檢測了4個Tead家族成員在BMMs和RAW264.7細(xì)胞以及其他幾種小鼠細(xì)胞系中的蛋白水平。有趣的是，Tead1和Tead共激活因子Yap在BMMs和RAW264.7細(xì)胞中不可測，但在小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F1、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、MSC和小鼠成纖維細(xì)胞系L929中大量表達(dá)（圖6a）。相反，TEAD3在原發(fā)性骨髓基質(zhì)細(xì)胞中表現(xiàn)出相對特異性的表達(dá)模式。為了確定前破骨細(xì)胞中Malat1是否與NFATC1相互作用，作者進(jìn)行了RIP檢測，發(fā)現(xiàn)Malat1在RAW264.7細(xì)胞的pan-Tead和TEAD3免疫沉淀中均富集（圖6b，c），這驗證了在這些破骨細(xì)胞前體中Malat1和TEAD3之間的相互作用。為了確定Malat1是否直接結(jié)合TEAD3，作者對Malat1的6個非重疊的生物素化片段，作者發(fā)現(xiàn)所有6個Malat1片段，而不是一個無關(guān)的核RNA U1，都與TEAD3蛋白結(jié)合（圖6d），這表明TEAD3結(jié)合位點可能彌漫性分布在Malat1上。
圖6 Malat1與TEAD3結(jié)合抑制NFATC1活性
有趣的是，RAW264.7和U937細(xì)胞的RANKL處理上調(diào)了TEAD3，但沒有上調(diào)其他Tead家族成員（圖6e，f）。免疫共沉淀（co-IP）實驗表明，TEAD3，而不是Yap，與NFATC1相互作用（圖6g）。在驗證TEAD3與Malat1和NFATC1的相互作用后，作者試圖確定Malat1是否調(diào)節(jié)TEAD3與NFATC1的結(jié)合。為此，作者產(chǎn)生了Malat1敲除的HEK293T細(xì)胞，并將TEAD3和NFATC1轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。Co-IP檢測表明，Malat1缺失顯著增加了TEAD3和NFATC1之間的相互作用（圖6h，i）。為了進(jìn)一步證實這一結(jié)果，作者在Malat1敲除的HEK293T細(xì)胞中重新表達(dá)Malat1，發(fā)現(xiàn)恢復(fù)Malat1表達(dá)降低了TEAD3-NFATC1的相互作用（圖6j，k）。
NFATC1蛋白包含四個結(jié)構(gòu)域:n端和c端區(qū)域的兩個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（TAD）、一個中央DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）和一個n端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域（圖6l）。TEAD3蛋白主要由兩個結(jié)構(gòu)域組成：n端DBD（也稱為TEA結(jié)構(gòu)域）和c端yap結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因此，作者產(chǎn)生了NFATC1和TEAD3的截短突變體（圖6l），并進(jìn)行了co-IP檢測，發(fā)現(xiàn)Nfact1的n端區(qū)域和中央DBD，而不是Nfact1的c端TAD，可以結(jié)合TEAD3（圖6m）。此外，使用TEAD3截短突變體和全長NFATC1進(jìn)行的co-IP分析表明，TEAD3的TEA結(jié)構(gòu)域，而不是yap結(jié)合結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與NFATC1的相互作用（圖6n）。
作者進(jìn)一步研究了Malat1和TEAD3是否調(diào)節(jié)NFATC1的轉(zhuǎn)錄活性，通過使用包含串聯(lián)NFATC1結(jié)合位點或Ctsk啟動子的熒光素酶報告，作者發(fā)現(xiàn)TEAD3的過表達(dá)確實增強了NFATC1的轉(zhuǎn)錄活性（圖6o，p）。作者發(fā)現(xiàn)，與野生型或Malat1挽救的細(xì)胞相比，在Malat1敲除細(xì)胞中，TEAD3過表達(dá)導(dǎo)致NFATC1活性出現(xiàn)更高的劑量依賴性增加（圖6q，r）。這些結(jié)果支持以下模型：Malat1缺失解除對TEAD3的抑制，而TEAD3進(jìn)而結(jié)合并激活NFATC1。
利用CRISPR激活方法激活RAW264.7細(xì)胞內(nèi)源性TEAD3表達(dá)（圖7a、b），作者發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TEAD3促進(jìn)了破骨細(xì)胞分化（圖7c、d），上調(diào)了NFATC1、Trap5和Ctsk的表達(dá)（圖7e-h）。接下來，作者在RAW264.7細(xì)胞中敲低TEAD3（圖7i），發(fā)現(xiàn)敲低TEAD3減弱了RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化（圖7j，k），并下調(diào)了NFATC1和Ctsk的表達(dá)（圖7l）。此外，在敲除Malat1的RAW264.7細(xì)胞中，沉默TEAD3可以抵消RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和NFATC1和Ctsk表達(dá)的誘導(dǎo)（圖7m-p）。因此，Malat1缺失以TEAD3和NFATC1依賴的方式促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。
圖7 TEAD3促進(jìn)破骨細(xì)胞生成并介導(dǎo)Malat1缺陷的作用
結(jié)論：
該研究發(fā)現(xiàn)Malat1在人類和小鼠的破骨細(xì)胞生成過程中下調(diào)。值得注意的是，小鼠中Malat1的缺失促進(jìn)了骨質(zhì)疏松和黑色素瘤和乳腺腫瘤細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移，而Malat1的基因反加可以挽救這一過程。機制上，Malat1與TEAD3蛋白結(jié)合，阻斷TEAD3與NFATC1的結(jié)合和激活，從而抑制NFATC1介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄和破骨細(xì)胞分化。值得注意的是，臨床骨樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析表明，前破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中MALAT1表達(dá)的降低與骨質(zhì)疏松和轉(zhuǎn)移性骨病變相關(guān)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)證實了Malat1是一個可以預(yù)防骨質(zhì)疏松和骨轉(zhuǎn)移的lncRNA。
實驗方法：
基因工程小鼠模型，LPS誘導(dǎo)的炎性骨質(zhì)疏松模型，μCT骨掃描和分析，骨轉(zhuǎn)移測定，骨組織組織學(xué)，TRAP染色，甲苯胺藍(lán)染色，免疫組織化學(xué)染色，骨組織鈣黃綠素染色，細(xì)胞培養(yǎng)，破骨細(xì)胞分化，成骨細(xì)胞分化，肌動蛋白環(huán)染色，質(zhì)粒，慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，Malat1敲低、敲除和過表達(dá)，TEAD3敲低和過表達(dá)，RNA干擾，免疫沉淀，免疫印跡，RNA提取，cDNA合成，定量PCR，RT-PCR，染色質(zhì)免疫沉淀分析，RNA pulldown，RIP，熒光素酶報告基因檢測，酶聯(lián)免疫吸附實驗，批量RNA測序分析，單細(xì)胞RNA-seq分析
參考文獻(xiàn)：
Zhao Y, Ning J, Teng H, Deng Y, Sheldon M, Shi L, et al. Long noncoding RNA Malat1 protects against osteoporosis and bone metastasis. Nat Commun. 2024 Mar 16;15(1):2384. doi: 10.1038/s41467-024-46602-3. PMID: 38493144; PMCID: PMC10944492.