線粒體自噬抑制衰老過程中胞質(zhì)mtDNA依賴的cGAS/STING炎癥激活

巨自噬隨著年齡的增長而減少，這一變化被認為是衰老過程的標志。線粒體自噬，一種線粒體必要選擇性自噬降解，是否也會隨著年齡的增長而減少，目前尚不清楚。在作者對Mito-QC報告小鼠多器官有絲分裂的分析中，老年小鼠的有絲分裂要么增加，要么不變。轉(zhuǎn)錄組學分析顯示，老年小鼠視網(wǎng)膜中I型干擾素反應明顯上調(diào)，與胞質(zhì)mtDNA水平升高和CGAS/STING通路激活有關(guān)。重要的是，這種一致的改變在來自老年供體的原始人類成纖維細胞中不斷重復。在老年小鼠中，用尿石素A誘導線粒體自噬會降低CGAS/STING的激活并改善神經(jīng)功能的惡化。這些發(fā)現(xiàn)表明，線粒體自噬的誘導是減少年齡相關(guān)炎癥和增加健康壽命的策略。該研究于2024年1月發(fā)表在《nature communications》，IF 16.6。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 生理衰老期間線粒體自噬水平增加或保持穩(wěn)定

與衰老相關(guān)的線粒體自噬變化已被廣泛研究。然而，線粒體自噬在衰老組織中是上調(diào)還是下調(diào)仍不清楚。這在一定程度上是由于目前可用于線粒體自噬研究的工具和讀數(shù)的稀缺性和復雜性。在本研究中，作者使用可固定的mito-QC報告基因C57BL/6J小鼠評估了線粒體自噬，該小鼠普遍表達由pH不敏感的mCherry組成的嵌合蛋白，pH不敏感的GFP，以及線粒體分裂1蛋白（FIS1）的線粒體靶向序列（MTS）（圖1a）。因此，顯微鏡可用于區(qū)分細胞質(zhì)線粒體（mCherry+GFP+）和經(jīng)歷溶酶體降解的線粒體（mCherry+GFP?）。對年輕（6-8個月）和老年（24-26個月）小鼠組織樣本的共聚焦成像分析顯示，老年小鼠的腎臟、大腦、視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）、神經(jīng)視網(wǎng)膜、小腦和肝臟中的線粒體自噬水平顯著較高（圖1b）。相反，胰腺、脾臟、肌肉、心臟和肺部的線粒體自噬水平在各組之間沒有差異（圖1b）。先前的文獻報道表明，溶酶體降解不足會導致使用串聯(lián)熒光報告器對實驗的混淆解釋。由于溶酶體功能缺陷與衰老有關(guān)，作者評估了用蛋白酶抑制劑Leupeptin（40 mg/kg，16小時）或載體（鹽水）處理的年輕和老年小鼠視網(wǎng)膜中的線粒體溶酶體水平。

在所分析的大多數(shù)器官中觀察到PINK1誘導的泛素Ser65磷酸化增加（圖1c，d），表明與年齡相關(guān)的線粒體自噬增加是由PINK1/Parkin通路驅(qū)動的，該通路對線粒體膜電位的擾亂作出反應。作者還測量了視網(wǎng)膜中參與受體介導的線粒體自噬的蛋白質(zhì)水平（BNIP3L/NIX、BNIP3、FKBP8、PHB2、FUNDC1），沒有發(fā)現(xiàn)與年齡相關(guān)的變化。

與作者和其他人的先前報告一致，與年輕小鼠相比，老年小鼠表現(xiàn)出總體巨自噬減少，如自噬體數(shù)量（LC3+）增加所證明的，而不伴隨自溶小體數(shù)量（LC3+LAMP1+）的變化而變化。這些在老年小鼠中的觀察結(jié)果，加上自噬銜接子Sequestome-1/p62和多泛素化蛋白的積累，以及自噬調(diào)節(jié)因子缺乏轉(zhuǎn)錄變化，表明巨自噬流量的普遍阻斷與線粒體自噬的增加相一致。由于線粒體功能障礙也被認為是衰老的主要驅(qū)動因素之一，作者試圖確定伴隨生理衰老的轉(zhuǎn)變的原因和后果，從而使線粒體的降解優(yōu)于其他自噬底物。

圖1：小鼠生理性衰老與多個器官的線粒體自噬穩(wěn)定或增加有關(guān)

2. 老年小鼠中，游離胞質(zhì)mtDNA觸發(fā)cGAS/STING介導的I型干擾素反應和炎癥

視網(wǎng)膜是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一個定義明確、易于接近的部分，它是顯示出與年齡相關(guān)的線粒體自噬最強烈增加的器官之一。來自老年小鼠的視網(wǎng)膜顯示出與炎癥和對病毒或內(nèi)源性胞質(zhì)DNA有反應的幾種有關(guān)途徑上調(diào)（圖2a）。事實上，前三個陽性富集標志是干擾素反應（INFα，IFNγ）和TNFα信號傳導（圖2b）。使用干擾素進行更精細的分析顯示，67.5%的顯著上調(diào)的差異表達基因（DEG）對應于干擾素刺激的基因（ISG），并且所有基因都參與I型干擾素反應（圖2c）?？紤]到視網(wǎng)膜的免疫特權(quán)性質(zhì)和本研究中所有小鼠所接受的嚴格獸醫(yī)監(jiān)測，作者假設內(nèi)源性胞質(zhì)DNA可能會觸發(fā)這種炎癥反應。年輕和老年視網(wǎng)膜的抗-DNA免疫染色顯示，老年組的胞質(zhì)DNA量增加，其中大部分位于富含線粒體的區(qū)域（圖2d）。視網(wǎng)膜樣品的亞細胞分級用于進一步探索老年小鼠胞質(zhì)DNA的增加，顯示老年小鼠與年輕小鼠相比，胞質(zhì)部分的完整mtDNA水平（mt-Nd2、mt-Co1、mt-Cytb）顯著增加10倍（圖2e）。

干擾素基因（cGAS/STING）軸的環(huán)狀GMP-AMP合酶刺激因子已被確定為mtDNA釋放引發(fā)炎癥的主要傳感器和下游效應物之一。與轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)一致，作者觀察到cGAS和STING的蛋白質(zhì)水平顯著增加（圖2f），導致下游轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）的激活，如磷酸化-IRF3Ser396水平的增加所反映的（圖2f）。IRF3下游幾個基因（Ifit1、Ifi44、Ifih1、Cxcl10、Rtp4）的轉(zhuǎn)錄水平在老年視網(wǎng)膜中也顯著上調(diào)（圖2g）。因為在多個器官中觀察到與年齡相關(guān)的線粒體自噬增加（圖1b），作者還評估了肝、腦、腎和肌肉中的cGAS/STING激活。與年輕小鼠相比，老年小鼠的腎臟和肌肉樣本中的STING水平顯著較高。為證實這些發(fā)現(xiàn)，作者使用來自C57BL/6J小鼠的公開轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GSE141252）分析了17個不同器官和5個不同年齡組（4、9、12、18、24個月）的cGAS/STING介質(zhì)和下游靶基因的水平。在所分析的17個器官中的12個（腎上腺、棕色脂肪組織、小腦、大腦額葉皮層、心臟、腎臟、大腸、肝臟、肺、肌肉、皮膚和白色脂肪組織）中觀察到轉(zhuǎn)錄水平增加的常見模式，表明老年小鼠中cGAS/STING介導的炎癥的增加不僅限于視網(wǎng)膜。

圖2：老年小鼠mtDNA釋放增加引發(fā)cGAS/STING介導的炎癥

最后，作者研究了在老年小鼠中觀察到的線粒體自噬、mtDNA釋放和cGAS/STING激活的增加是否也在不同物種中保持不變。首先，作者對先前發(fā)表的數(shù)據(jù)（GSE113957）進行轉(zhuǎn)錄組學分析，這些數(shù)據(jù)來自原代正常人真皮成纖維細胞（NHDF），根據(jù)臨床指南分為兒科、青年人、成人、中年人、老年人或老年人（圖3a）。與作者在小鼠中的發(fā)現(xiàn)相一致，老年組顯示出最高水平的cGAS/STING介質(zhì)和下游IRF3靶點（圖3b），以及與所有其他組相比干擾素反應（INFα、IFNγ）和TNFα信號的富集（圖3b）。此外，與所有其他基因相比，在老年組上調(diào)的DEG中，50.3%對應于ISG，并被歸類為干擾素I型應答基因（圖3d）。IFIH1和RTP4（IRF3的下游靶標）表達的相關(guān)性分析顯示與年齡呈正相關(guān)（圖3e）。最后，來自年輕供體（28歲）和年老供體（62歲）（圖3f，g）的NHDF s in-house分析顯示后一組磷酸化-泛素化Ser65和胞質(zhì)DNA焦點的顯著高水平（圖3h）。與在老年小鼠視網(wǎng)膜中觀察到的表型相似，在受體介導的線粒體自噬效應物的水平上沒有觀察到變化，也沒有觀察到心磷脂向線粒體外膜（OMM）的易位。這些數(shù)據(jù)支持cGAS/STING介導的炎癥增加和線粒體自噬之間的年齡依賴性關(guān)聯(lián)，并表明這種關(guān)聯(lián)在器官和物種中是保守的。這些觀察結(jié)果表明，PINK1/Parkin介導的線粒體自噬可能隨著衰老的進展而選擇性上調(diào)，以改善線粒體質(zhì)量控制并抵消mtDNA的釋放，從而限制cGAS/STING的激活。

圖3：在老年供體的原代人真皮成纖維細胞中也觀察到cGAS/STING被細胞質(zhì)DNA激活

3. 線粒體自噬的藥理學激活可減少老年小鼠的神經(jīng)炎癥并改善其神經(jīng)功能

最近的研究強調(diào)了線粒體自噬誘導劑在動物模型中延長壽命和健康壽命的能力，以及它們作為治療阿爾茨海默病和肌萎縮等年齡相關(guān)疾病的潛力。基于作者的觀察結(jié)果，即線粒體自噬隨著生理衰老而上調(diào)，作者假設通過藥物誘導線粒體自噬可以改善與衰老相關(guān)的一些有害變化（即神經(jīng)炎癥以及神經(jīng)和視覺功能下降）。作者使用線粒體自噬誘導劑尿鋰蛋白A（UA）進行了一項干預研究，尿鋰蛋白是一種源自石榴或樹莓等可食用植物和水果的天然代謝產(chǎn)物，已在臨床試驗中進行研究。作者對每天腹膜內(nèi)注射UA（2.3 mg/kg）或載體8周的年輕（6個月）和老年（22個月）小鼠進行了神經(jīng)生理學、行為學和視網(wǎng)膜免疫組織化學和轉(zhuǎn)錄組學分析（圖4a）。灌注腦的質(zhì)譜（UPLC-ESI-QTOF-MS）和作為陽性對照的血漿樣品顯示，游離UA穿過血腦屏障并到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)（圖4a）。由于灌注的大腦樣本沒有經(jīng)過酶水解，這是第一項明確顯示到達大腦的精確泌尿代謝形式的研究。因此，這些結(jié)果支持了先前的假設，即游離UA作為直接效應物參與腦組織。UA治療顯著增加了年輕和老年小鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜中的線粒體自噬（圖4b）和RPE（圖4c），盡管后者的程度較低。與媒介物治療的小鼠相比，UA治療的老年小鼠后肢抱膝得分（用作一般神經(jīng)功能的讀數(shù)）顯著較低（圖4d）。與載體處理的小鼠相比，使用新型物體識別（NOR）測試評估，用UA處理的老年小鼠也顯示出改善的識別記憶（圖4e）。Rod介導的黃昏和夜間視力隨著年齡的增長而惡化，嚴重影響老年人的生活質(zhì)量。通過視網(wǎng)膜神經(jīng)生理學的視網(wǎng)膜電圖（ERG）評估，UA治療的老年小鼠顯示出暗視（暗）視力改善，這表明Rod介導的視覺功能改善（圖4f，g），以及參與視黃醇代謝的基因表達增加。在用UA治療的年輕或老年小鼠中，未觀察到中視（混合）和明視（光）視力的差異。在用UA處理的老年小鼠中，桿狀光轉(zhuǎn)導蛋白視覺阻滯蛋白（光刺激異常整合的指標）的內(nèi)化也減少。免疫組織化學表明，UA改善了老年小鼠的CtBP2+mGluR6+突觸完整性（圖4h），進一步表明UA促進了衰老過程中視覺功能的保存。UA還降低了脂質(zhì)過氧化衍生的4-HNE+聚集體（圖4i），表明線粒體質(zhì)量控制的改善也可能減少衰老視網(wǎng)膜中的氧化應激。光學相干斷層掃描（OCT）分析顯示沒有主要的形態(tài)計量學變化（圖4j），主要視網(wǎng)膜細胞類型的數(shù)量發(fā)生了變化。

圖4：促進線粒體自噬可改善與年齡相關(guān)的神經(jīng)衰退

至關(guān)重要的是，UA的線粒體自噬刺激降低了老年視網(wǎng)膜中胞質(zhì)DNA的水平（圖5a）和DNA結(jié)合的cGAS（圖5a）。此外，干擾素反應（INFα、IFNγ）和TNFα信號傳導是老年小鼠中前3個陽性富集特征（圖2b），也是UA治療的老年小鼠中的前3個陰性富集特征（圖5b）。在用UA誘導線粒體自噬后，老年小鼠的cGAS/STING介質(zhì)和下游基因的轉(zhuǎn)錄水平也降低（圖5c）。視網(wǎng)膜老化傳統(tǒng)上也與神經(jīng)膠質(zhì)炎癥反應增加有關(guān)。UA處理的老年小鼠顯示出膠質(zhì)纖維酸性蛋白/GGFP+星形膠質(zhì)細胞增生顯著減少（圖5d），并且有輕微的電離鈣結(jié)合銜接子分子1/Iba1+小膠質(zhì)細胞浸潤減少的趨勢（圖5e），表明cGAS/STING信號減少也可以直接減少膠質(zhì)細胞激活。

圖5：在老年小鼠中觀察到，UA治療可減弱cGAS/STING反應的增加

UA也被描述為同時刺激線粒體生物發(fā)生，以便在線粒體自噬誘導后恢復健康的線粒體。在UA治療的小鼠視網(wǎng)膜中，細胞質(zhì)線粒體質(zhì)量（mitoQC；FIS1-GFP+）確實增加，這一現(xiàn)象在老年小鼠中更為明顯（圖6a）。為進一步剖析cGAS/STING、線粒體自噬和線粒體穩(wěn)態(tài)之間的相互作用，作者使用ARPE-19細胞系建立了線粒體DNA釋放的體外模型。ABT-737是一種Bcl-2抑制劑，它可以觸發(fā)線粒體外膜中Bax/Bak孔的形成，導致其內(nèi)部成分（包括mtDNA18）的釋放。細胞也用泛胱天蛋白酶抑制劑Q-VDOPh（QVD）處理，以避免細胞色素c釋放引起的細胞凋亡誘導（圖6b）。用ABT-737處理增加了胞質(zhì)DNA焦點的數(shù)量，當細胞與UA共同處理但不與選擇性cGAS抑制劑G140共同處理時，這種現(xiàn)象完全恢復（圖6c）。ABT-737也刺激了cGAS/STING信號級聯(lián)，UA和G140都消除了這種作用（圖6d）?？傊@些數(shù)據(jù)驗證了UA通過促進線粒體質(zhì)量控制和消除其觸發(fā)事件（mtDNA釋放）而不是調(diào)節(jié)下游信號傳導來減少cGAS/STING介導的炎癥。值得注意的是，當細胞與G140共同處理時，ABT-737誘導的線粒體自噬減少，這表明線粒體自噬確實是對cGAS/STING激活的細胞保護反應（圖6e）。我們在老年C57BL/6J小鼠上（圖1c，d）和來自老年供體的NHDF（圖3h）重復了該發(fā)現(xiàn)，ABT-737顯著增加了磷酸化-泛素化Ser65水平，表明PINK1/Parkin依賴線粒體自噬的激活。類似地，在受體介導的線粒體自噬效應物中沒有觀察到變化、心磷脂水平或其向OMM的易位。模擬了作者在小鼠視網(wǎng)膜中的發(fā)現(xiàn)，UA還在ABT-737模型中誘導線粒體生物發(fā)生，并略微減少線粒體ROS的產(chǎn)生（圖6f）。最值得注意的是，線粒體呼吸測定分析顯示，UA恢復了ABT-737處理的細胞的基礎呼吸和ATP產(chǎn)生，并顯著提高備用呼吸能力（圖6g）。

圖6：UA誘導線粒體生物發(fā)生，改善線粒體功能

最后，為完全確定線粒體自噬是否是UA衍生的有益作用的唯一原因，或者是否也涉及線粒體生物發(fā)生，作者在ARPE-19細胞中評估了相同的讀數(shù)，其中PINK1/Parkin依賴線粒體自噬（PINK1；PARK2 siRNA；圖7f）和/或線粒體生物發(fā)生（100μM氯霉素；圖7c）同時下調(diào)。PINK1/Parkin敲低有效地消除了ABT-737和UA的線粒體自噬誘導（圖7a，b）。線粒體生物發(fā)生抑制對線粒體自噬水平?jīng)]有影響（圖7a，b），也沒有UA誘導的胞質(zhì)DNA減少（圖7d，e）。然而，在ABT-737處理的細胞中，PINK1/Parkin敲低完全消除了UA介導的胞質(zhì)DNA焦點的減少（圖7e，f），表明該途徑確實是抑制mtDNA釋放的原因。

圖7：UA 的 PINK1/Parkin 依賴性線粒體自噬刺激介導胞質(zhì) ABT-737 誘導的 DNA 減少

 結(jié)論：

總之，這些數(shù)據(jù)構(gòu)成了支持藥物誘導線粒體自噬減輕年齡相關(guān)炎癥和神經(jīng)系統(tǒng)惡化的治療潛力的概念證明。

實驗方法：

線粒體自噬動物模型構(gòu)建，細胞培養(yǎng)，免疫熒光，qPCR，WB，尿石素代謝物測定，動物行為測試，透射電鏡，RNA測序，流式

參考文獻：

Jiménez-Loygorri JI, Villarejo-Zori B, Viedma-Poyatos á, Zapata-Mu?oz J, Benítez-Fernández R, Frutos-Lisón MD, Tomás-Barberán FA, Espín JC, Area-Gómez E, Gomez-Duran A, Boya P. Mitophagy curtails cytosolic mtDNA-dependent activation of cGAS/STING inflammation during aging. Nat Commun. 2024 Jan 27;15(1):830. doi: 10.1038/s41467-024-45044-1. Erratum in: Nat Commun. 2024 Feb 19;15(1):1504. PMID: 38280852; PMCID: PMC10821893.