PDX1抑制潛在NF-kB增強子調(diào)節(jié)β細胞功能異質(zhì)性

         單個細胞在多細胞組織中的身份和功能是由血統(tǒng)決定和活動依賴的轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用確定的，其機制尚不完全清楚。通過構(gòu)建人胰島內(nèi)染色質(zhì)狀態(tài)的單細胞圖譜，作者發(fā)現(xiàn)由血統(tǒng)決定因子胰十二指腸家族盒基因1（PDX1）的高或低活性所主導(dǎo)的β細胞亞型。PDX1活性降低的β細胞在潛在的核因子kB（NF-kB）增強子上顯示出增加的染色質(zhì)可及性。Pdx1低活性小鼠在夜間展現(xiàn)了NF-kB的解抑制和葡萄糖耐受力受損。與染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）一起進行的三維分析揭示了PDX1通過涉及SIN3A的長程染色質(zhì)接觸在晝夜和炎癥增強子上沉默NF-kB。相反，在β細胞中Bmal1基因敲除破壞了全基因組范圍內(nèi)的PDX1和NF-kB DNA結(jié)合。最后，拮抗NF-kB的白細胞介素-1β（IL-1β）受體，改善了Pdx1低活性胰島的胰島素分泌。作者的研究揭示了由PDX1活性梯度定義的單個β細胞的功能亞型，并確定NF-kB是胰島素促分泌療法的靶點。

         該研究于2024年1月發(fā)表在《Cell Metab》，IF：29.0。

圖形摘要：

技術(shù)路線：   

結(jié)果:

1、單細胞染色質(zhì)可及性測序識別了人胰島中不同β細胞群體內(nèi)PDX1和潛在NF-kB增強子的特征

         為了闡明血統(tǒng)和活動依賴性轉(zhuǎn)錄因子之間的組合相互作用如何決定 β 細胞的異質(zhì)性和功能，作者使用單核酸可及性測序（snATAC-seq）在從集成胰島分發(fā)計劃（IIDP）獲得的人類尸體胰島中進行了染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的分析（圖1A）。作者在20,519個單個胰島細胞中鑒定了334,116個可及性 CREs，并使用統(tǒng)一流形逼近和投影（UMAP）降維方法將它們分成19個不同的簇。這19個簇包括規(guī)范內(nèi)分泌細胞類型，其中有四個α 細胞簇（a1–4）、三個β 細胞簇（b1–3）和一個δ 細胞簇（圖1B），分別以染近編碼葡萄糖素（GCG）、胰島素/胰島素樣生長因子2（INS/ IGF2）和生長抑素（SST）的基因附近的染色質(zhì)可及性為特征（圖1C）。通過在規(guī)范細胞標記的可及性確定的其他胰島相關(guān)細胞亞群包括星狀細胞（PDGFRB）、神經(jīng)嵴細胞（SOX10）、淋巴和髓系免疫細胞（CCL4）、內(nèi)皮細胞（PECAM1）、導(dǎo)管細胞（KRT19）和腺泡細胞（REG1A）（圖1B和圖1C）。

         snATAC-seq相較于單細胞mRNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的一個關(guān)鍵優(yōu)勢在于其能夠檢測轉(zhuǎn)錄因子在基因啟動子和遠端增強子上的調(diào)控活性。為了檢查是否差異基因調(diào)控潛在地支持了β細胞的異質(zhì)性，作者首先比較了b1和b2 β細胞亞簇之間的基因活性分數(shù)。這兩個亞簇分別占總β細胞數(shù)量的47.2%和45.1%。作者發(fā)現(xiàn)了600個具有顯著變異（p < 0.05）的基因，其中包括β細胞定義基因，如INS（6.45e-87）、MAFA（2.25e-50）和GLP1R（2.37e-36），以及炎癥基因，如PTGER3（1.471551e-05）、IL2（5.968259e-15）和LPAR1（8.646495e-15）。使用snATAC-seq基因活性分數(shù)作為Seurat中的聚類傳遞錨點，對來自12個非糖尿病人類胰島的單細胞RNA測序（GEO: GSE114297）進行分析，揭示了β1和β2亞群之間的RNA表達的log2-fold變化與染色質(zhì)基因活性分數(shù)之間存在顯著相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)揭示了跨細胞類型的單細胞轉(zhuǎn)錄豐度和染色質(zhì)可及性之間的對應(yīng)關(guān)系。

         為了闡明影響β細胞異質(zhì)性的表觀遺傳機制，作者使用chromVAR識別β1與β2亞群之間的差異TF活性，以測量與TF相關(guān)的染色質(zhì)可及性。比較β1和β2細胞簇之間的motif Z 分數(shù)，發(fā)現(xiàn)在幾個β細胞LDTF（Lineage-Determining Transcription Factor）的motif上存在差異可及性，這與靠近INS基因的可及性增加相對應(yīng)（圖1D）。在已知的LDTF中，PDX1，胰腺發(fā)育的主要調(diào)控因子之一，是差異富集motif中最顯著的之一，同時也是成熟β細胞中表達最高的TF之一（圖1D、圖1E）。作者進一步發(fā)現(xiàn)，在β1和β2細胞之間的差異可及性位點中，有58%的位點包含PDX1的motif，而在背景峰值集合中只有40%。因此，作者將這些β1和β2亞群分別稱為PDX1高和PDX1低細胞。在PDX1高細胞中富集的其他TF包括已知在成熟β細胞發(fā)育中所需的NEUROD1、NKX6.1和bHLH胰腺轉(zhuǎn)錄因子1A（PTF1A），以及其他bHLH TF，其DNA結(jié)合motif包含分子時鐘的靶標經(jīng)典E-box motif（圖1E）。相反，具有在INS位點低可及性的β2細胞亞簇在可及性上高度富集了可及性NF-kB1、kruppel樣因子KLF14、JUNB和干擾素調(diào)節(jié)因子6（IRF6）的TF motif（padj < 0.001）（圖1E），這些TF在應(yīng)激、免疫應(yīng)答、細胞增殖和存活期間調(diào)控炎癥基因的信號誘導(dǎo)表達?？偟膩碚f，作者對染色質(zhì)活性的單細胞測序揭示了人類胰島內(nèi)胰島素產(chǎn)生細胞的雙峰分布，其中一個是INS豐富簇，具有高PDX1活性，另一個是INS低簇，具有低PDX1活性，但具有NF-kB TF活性的顯著富集。

         作者的數(shù)據(jù)表明， PDX1和時鐘調(diào)控元素在INS豐富簇中共存，支持了PDX1和節(jié)律基因表達可能在β細胞功能中發(fā)揮作用的可能性。為了檢查β細胞身份的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是否以晝夜節(jié)律方式調(diào)控，作者通過在人類胰島中進行ATAC-seq來評估染色質(zhì)的24小時節(jié)律開放，首先使用1小時的 forskolin 脈沖同步其分子時鐘。在forskolin給藥后的24小時內(nèi)，每4小時進行一次基因組分析，遠遠超過 forskolin 對染色質(zhì)作用的約1小時半衰期（圖1A）。作者在24小時時間序列內(nèi)生成了每個捐贈者的Z分數(shù)，使用標準化的ATAC-seq計數(shù)，并使用經(jīng)驗Jonckheere-Terpstra-Kendall算法（eJTK_CYCLE）鑒定了全基因組的3,125個統(tǒng)計學(xué)上有節(jié)律的ATAC-seq峰值（圖1F）。這些有節(jié)律的位點位于與胰島細胞身份（SIX3、PDX1和GCG）、晝夜表達（PER2和NPAS2）以及炎癥（ETS2和TNFRSF21）有關(guān)的基因的增強子附近。在有節(jié)律的ATAC-seq峰值處進行的TF motif富集分析表明，在TFs方面存在顯著的富集（例如，PDX1、NEUROD1和PTF1A）（padj < 0.05）（圖1F），這些TFs也在PDX1高細胞中富集（圖1E）?？傮w而言，這些研究表明，PDX1和其他TF在一天中的有節(jié)奏共同激活染色質(zhì)可能有助于β細胞的功能。

2、PDX1通過抑制NF-kB增強子來調(diào)控β細胞功能

         轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用在基因組的非編碼調(diào)控區(qū)域內(nèi)推動內(nèi)分泌胰腺的身份和功能?；谠谡宫F(xiàn)差異NF-kB和時鐘活動模式的不同細胞群中發(fā)現(xiàn)PDX1活性特征的發(fā)現(xiàn)，作者試圖通過對具有PDX1基因遺傳缺陷的小鼠胰島進行snATAC-seq分析（圖2A）來剖析PDX1在控制炎癥和晝夜基因網(wǎng)絡(luò)中的功能。由于Pdx1基因敲除導(dǎo)致胚胎致死，作者利用攜帶Pdx1關(guān)鍵調(diào)控增強子（區(qū)域IV）內(nèi)突變的第二等位基因（突變體Pdx1?AIV/-）的雜合小鼠，其與對照的Pdx1+/-小鼠相比，發(fā)育后期表現(xiàn)出低胰島素血癥、葡萄糖耐量受損和減少的β細胞增殖（圖2A）。使用從Pdx1?AIV/-和對照Pdx1+/-小鼠在斷奶后（10–18周齡）收集的核酸單體數(shù)據(jù)，作者鑒定了來自9,480個單個胰島細胞的187,343個可及性CREs，并將其分為15個獨特的胰島細胞亞群，其中包括三個β細胞亞群（圖2B）。這三個小鼠β細胞亞群的PDX1活性變化與作者在人類尸體胰島中的觀察相似（圖1B–1E）。比較Pdx1?AIV/-突變體和Pdx1+/-基因型的所有三個β細胞亞群中染色質(zhì)可及性的集合，揭示了在1,373個唯一基因上的1,902個染色質(zhì)峰值的顯著改變。Pdx1區(qū)域IV增強子區(qū)域是最顯著的下調(diào)非編碼CRE，與該增強子的半合子性一致，其次是Ins1啟動子（圖2C）。來自匯總的β細胞亞群的motif分析顯示，在促進β細胞功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上，Pdx1?AIV/-突變小鼠中的染色質(zhì)可及性減少，包括NEUROD1、NEUROG2、PTF1A和bHLH因子（圖2D），這提供了遺傳證據(jù)，支持作者在人類胰島中的發(fā)現(xiàn)，即PDX1高亞群與與β細胞和晝夜功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)（圖1E和圖1F）。相反，在Pdx1缺陷突變體中染色質(zhì)可及性增加的位點含有與促炎信號有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，包括NF-kB1、NF-kB2和RELA（圖2D）。在Pdx1?AIV/-缺陷突變體中檢測到染色質(zhì)景觀的改變，其中促炎增加，胰島素分泌網(wǎng)絡(luò)減少，類似于作者在富含或貧乏PDX1和NF-kB的人類胰島中觀察到的唯一增強子簽名（圖1E和圖1F）。基因本體路徑分析進一步指示了PDX1在誘導(dǎo)β細胞中糖應(yīng)答性胰島素分泌的基因以及同時抑制促炎調(diào)控元件方面的作用（圖2E）。

3、晝夜節(jié)律分析揭示了PDX1對NF-kB增強子活性的節(jié)律調(diào)控

         觀察到來自Pdx1缺陷動物的胰島在與晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的增強子內(nèi)顯示致密染色質(zhì)的現(xiàn)象（圖2E），促使作者檢查Pdx1缺陷對β細胞增強子的時間調(diào)控的影響。為了檢查Pdx1?AIV/-突變體和Pdx1+/-對照小鼠胰島在內(nèi)在晝夜周期的兩個不同階段的染色質(zhì)可及性，作者將胰島暴露于1小時的 forskolin 脈沖，并在節(jié)奏性胰島素分泌的最低點和最高點收集胰島（圖3A）。作者按照適用于低輸入樣本的Omni-ATAC-seq協(xié)議進行ATAC-seq，并在所有混合樣本中鑒定了132,195個唯一的可及性位點（圖3A）。似然比檢驗（LRTs）使用DESeq2中的規(guī)范化ATAC-seq計數(shù)數(shù)據(jù)，以確定在與晝夜時間或Pdx1基因型相關(guān)方面，有1,207個顯著改變的CREs（圖3B和圖3C）。使用這些數(shù)據(jù)在這些位點的規(guī)范化ATAC-seq計數(shù)進行的無偏主成分分析顯示了與基因型和晝夜時間相關(guān)的染色質(zhì)開放的不同模式。

         為了在這些數(shù)據(jù)中識別這些數(shù)據(jù)之間的染色質(zhì)可及性調(diào)控模式，作者進行了k均值聚類，并識別出依賴于晝夜時間和/或基因型的三個不同基因簇。group 1位點在Pdx1缺陷的胰島中在兩個時間點上的可及性減少，但在對照的胰島中在CT48時更為顯著地開放，而group 2位點在CT36時具有特異性的可及性增加，并且在Pdx1缺陷的胰島中更為可及性增加（圖3B和圖3C）。group 3位點僅受晝夜時間的調(diào)控，而不受基因型的調(diào)控。與時鐘和PDX1在促進胰島素分泌方面的協(xié)同作用有關(guān)，group 1位點富集有PDX1、MAFA和NKX6.1結(jié)合位點，包括促進Ins1和Mafa表達的經(jīng)典PDX1 CREs（padj < 0.001）（圖3B和圖3C）。相反，在group 2峰集內(nèi)富集在Pdx1缺陷細胞中發(fā)生的ATAC-seq峰，出現(xiàn)在與炎癥介質(zhì)Tnfrsf11b、Nfkbiz、Il-1b以及E26轉(zhuǎn)換特異性（ETS）因子Etv1和Ets2相關(guān)的位點（圖3B–3D），并在NF-kB、RELA以及即刻早期復(fù)合物FOS::JUNB的結(jié)合位點中富集（圖3C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Pdx1的喪失導(dǎo)致炎癥和應(yīng)激反應(yīng)基因的去抑制和節(jié)奏性重編程。在Pdx1缺陷的胰島中，編碼α-細胞富集的腎上腺素受體ADRB1和ADRA1b的基因也表現(xiàn)出增加的晝夜變異性，表明PDX1正常通過可能涉及晝夜因素的機制抑制胰島α細胞轉(zhuǎn)錄（圖3B–3F）。值得注意的是，Pdx1?AIV/-突變體中的淋巴、巨噬細胞和外分泌細胞未顯示出差異的PDX1活性，表明group 2基因的增加染色質(zhì)可及性不能歸因于非β細胞類型的信號。最后，與group 1和group 2相反，group 3的染色質(zhì)可及性僅依賴于晝夜時間（圖3B、）。這些位點富集有D盒結(jié)合蛋白（DBP）。

         為了確定在作者的同步ATAC-seq數(shù)據(jù)集中確定的差異染色質(zhì)特征是否對應(yīng)于整體動物的晝夜胰島素分泌動力學(xué)，作者在Pdx1?AIV/-突變體和Pdx1+/異型對照小鼠中進行了口服葡萄糖耐量試驗（oGTTs），分別在白天（白天 ）和夜晚（ZT14）進行。與對照小鼠相比，Pdx1?AIV/-突變小鼠顯示出明顯受損的葡萄糖耐量（p < 0.0001），在夜間更為明顯（圖3E）。通過混合效應(yīng)建模分析整體葡萄糖曲線，還發(fā)現(xiàn)Pdx1基因型、一天中的時間和葡萄糖水平之間存在顯著的相互作用。與對照組相比，這些小鼠在兩個時間點的胰島素和C肽水平均顯著降低（圖3E），而在突變體中，晚上的胰島素和C肽水平降低的幅度更大。總體而言，這些數(shù)據(jù)揭示了PDX1在整個白天通過改變分泌和促炎基因網(wǎng)絡(luò)的控制來調(diào)節(jié)染色質(zhì)緊縮、β細胞成熟和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的需求。

         為了檢查分子時鐘是否通過控制PDX1染色質(zhì)結(jié)合而對節(jié)律胰島素分泌有貢獻，作者在Bmal1敲除（KO）小鼠β細胞系（Beta-TC-6）中進行了PDX1 ChIP-seq。作者發(fā)現(xiàn)BMAL1的喪失在β細胞中顯著降低了PDX1 DNA結(jié)合的全基因組水平，包括在控制與胰島素分泌調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達的區(qū)域，如Ins1、Neurod1和Six2。因此，分子時鐘的喪失導(dǎo)致了PDX1調(diào)節(jié)與β細胞功能相關(guān)的基因的互相受損。

4、PDX1形成長程染色質(zhì)環(huán)以調(diào)控NF-kB和晝夜節(jié)律時鐘增強子活性

         鑒于作者的觀察到PDX1和NF-kB調(diào)控元素區(qū)分了成年β細胞的不同亞群（圖1和2），作者試圖確定PDX1是否直接全基因組抑制NF-kB。作者首先研究了PDX1耗竭如何影響p65的活性，p65是一個經(jīng)典的NF-kB亞單位，使用針對PDX1的小干擾RNA（siRNA）和對照siRNA在Beta-TC-6中進行了48小時處理，并使用p65 ChIP-seq進行比較（圖4A）。作者觀察到PDX1的喪失在5,268個獨特位點上增加了p65的全基因組占有率，盡管p65蛋白水平相似（圖4A）。這種結(jié)合的增加包括NF-kB/炎癥靶點，如Tnfrs11a，以及編碼晝夜節(jié)律抑制子PER2的基因（圖4A），與先前的研究一致。發(fā)光度分析顯示，Pdx1低表達的胰島表現(xiàn)出縮短的周期長度。因此，β細胞中PDX1的喪失增加了NF-kB的全基因組結(jié)合，并改變了核心時鐘抑制子的表達，這表明PDX1對NF-kB的抑制反過來改變了時鐘功能。

         三維染色質(zhì)分析揭示了LDTFs在廣泛分離的基因組區(qū)域之間形成聯(lián)系，以控制β細胞功能，但是是否PDX1通過遠程聯(lián)系來控制SDTFs尚未確定（圖4B）。在Pdx1-knockdown β細胞中，p65結(jié)合位點富集在距離（>500 bp）PDX1在對照細胞類型中觀察到的DNA結(jié)合位點較遠的位置。因此，作者利用三維染色質(zhì)構(gòu)象捕獲結(jié)合PDX1 ChIP-seq（HiChIP-seq）的方法來映射PDX1與遠離的調(diào)控元件之間的遠程相互作用（圖4B）。作者鑒定了4,155個長程（>5 kb）染色質(zhì)相互作用，涉及PDX1與遠離的順式調(diào)控區(qū)域之間的相互作用（圖4C）。其中包括497個細胞因子誘導(dǎo)的、NF-kB結(jié)合位點，這些位點在IL-1b處理的β細胞中被p65 ChIP-seq鑒定為NF-kB靶點。值得注意的是，在這些環(huán)中，IL-1b誘導(dǎo)的p65峰值的比例比作者的小鼠胰島ATAC-seq peak集中所有可訪問CREs中NF-kB基序的背景發(fā)生率高3倍。在PDX1染色質(zhì)環(huán)中，觀察到一個顯著的環(huán)，位于距離腫瘤壞死因子（TNF）受體相關(guān)因子3相互作用蛋白1（Traf3ip1）2.1 kb的PDX1結(jié)合位點上游和Per2基因的50 UTR內(nèi)的NF-kB結(jié)合位點之間（圖4C）。為了測試PDX1是否通過招募共抑制復(fù)合物在這些遠離的增強子處抑制NF-kB，作者進行了帶有轉(zhuǎn)錄共抑制劑SIN3A的染色質(zhì)免疫沉淀實驗，SIN3A與PDX1共同建立β細胞身份。在4,925個SIN3A結(jié)合位點中，有41%與PDX1調(diào)控的基因共定位，包括Traf3ip1和TNF相關(guān)基因，如Tnfsf4和Traf5（圖4C）。此外，作者發(fā)現(xiàn)PDX1的喪失在全基因組范圍內(nèi)破壞了SIN3A染色質(zhì)結(jié)合，包括在靠近編碼Nfkbie的基因附近的IL-1b誘導(dǎo)的NFkB結(jié)合位點上降低了SIN3A的結(jié)合。

5、使用IL-1β受體拮抗劑抑制NF-kB信號可以增強PDX1缺陷的β細胞功能

         人類PDX1低表達和小鼠Pdx1DAIV/缺陷β細胞均表現(xiàn)出在促炎網(wǎng)絡(luò)和NF-kB靶點（如IL-1b）上增加染色質(zhì)開放性的特征（圖1和2）。IL-1受體（IL-1R）是胰島β細胞中表達最高的細胞因子受體之一。暴露于IL-1b可重塑β細胞染色質(zhì)景觀，而IL-1b的拮抗在人類中代表了一種成熟的抗炎策略。炎癥似乎也通過機制在2型糖尿病的β細胞功能障礙中起作用，盡管具體機制尚不明確。作者發(fā)現(xiàn)，IL-1b刺激野生型小鼠的β細胞導(dǎo)致經(jīng)典NF-kB靶點（包括Nfkbiz和Nfkbia）的表達增加，并抑制了PDX1靶點（包括Mafa、Glp1r和Pdx1本身）的表達（圖4D）。IL-1b還抑制了野生型Beta-TC-6細胞的葡萄糖刺激的胰島素釋放（圖4E）。相反，使用IL-1b受體拮抗劑（IL-1RA）處理從Pdx1DAIV/缺陷小鼠中分離的胰島，顯著增強了胰島素分泌（圖4G），與通過阻斷IL-1b誘導(dǎo)的NF-kB信號來治療PDX1缺陷的療效相一致?？傮w而言，作者的表觀基因組和遺傳研究表明，在與PDX1和/或時鐘功能相關(guān)的β細胞失效狀態(tài)中，阻斷NF-kB上游的炎癥可能提供一種新型的胰島素促分泌療法。

 實驗方法：

         snATAC-seq、RNAscope多重分析、Bulk ATAC-seq、ChIP-seq、HiChIP-seq、RNA-seq、Pdx1 敲低、WB、胰島素分泌測定、LumiCycle 分析。

參考文獻：

         Weidemann BJ, Marcheva B, Kobayashi M, et al. Repression of latent NF-κB enhancers by PDX1 regulates β cell functional heterogeneity. Cell Metab. 2024;36(1):90-102.e7.