scRNA-seq和scATAC-seq聯(lián)合分析揭示ccRCC異質(zhì)性和調(diào)控動(dòng)態(tài)

         透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）經(jīng)常具有高度的腫瘤異質(zhì)性。在單細(xì)胞水平上闡明ccRCC的染色質(zhì)圖譜可以加深對(duì)該疾病的功能狀態(tài)和調(diào)控動(dòng)態(tài)的理解。在這里，作者對(duì)19個(gè)ccRCC樣本進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和單細(xì)胞轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測(cè)序（scATAC-seq），并利用全外顯子組測(cè)序來(lái)了解個(gè)體間的異質(zhì)性。構(gòu)建了ccRCC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性圖譜，以揭示ccRCC中不同腫瘤細(xì)胞亞型的調(diào)控特征。研究發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)促進(jìn)ccRCC侵襲和遷移的長(zhǎng)非編碼RNA（RP11-661C8.2和CTB-164N12.1），并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。綜上所述，本研究全面描述了ccRCC的基因表達(dá)和DNA調(diào)控圖譜，可為ccRCC的生物學(xué)和治療提供新的見(jiàn)解。本文于2023年3月發(fā)表在《Cancer Research》IF:11.2期刊上。

技術(shù)路線：

 主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

1、單細(xì)胞多組學(xué)研究描繪了人類ccRCC轉(zhuǎn)錄組景觀

         考慮到先前在ccRCC進(jìn)行的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究數(shù)量，作者希望通過(guò)單細(xì)胞多組學(xué)方案（圖1A）進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。從19名患有局部ccRCC的患者中收集了新鮮的手術(shù)切除物制備單細(xì)胞懸液，一部分用于scRNA-seq，而其余部分則用于scATAC-seq（圖1A）。額外的組織或單細(xì)胞懸液用于大規(guī)模ATAC-seq或WES，如圖1A所示。經(jīng)過(guò)Seurat質(zhì)控后，從ccRCC中捕獲到了102,723條高質(zhì)量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息。為減輕批次效應(yīng)，使用Harmony跨樣本匯總細(xì)胞并聚類。基于先前研究中標(biāo)記基因的表達(dá)和細(xì)胞注釋，將ccRCC分類為22個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞類型，包括四種腫瘤細(xì)胞亞型（ccRCC 1、ccRCC 2、ccRCC 3和ccRCC 4）、四種內(nèi)皮細(xì)胞亞型（Endo cells 1、Endo cells 2、Endo cells 3和Endo cells 4）等（圖1B和C）。在ccRCC中，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞（30,339，29.53%）最多，其次是腫瘤細(xì)胞（19,819，19.29%；圖1D）。由于ccRCC的腫瘤異質(zhì)性，對(duì)來(lái)自19名不同個(gè)體的腫瘤樣本進(jìn)行了scRNA-seq。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞類型都來(lái)自每個(gè)樣本，而腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的個(gè)體差異更為顯著（圖1E）。例如，腫瘤細(xì)胞（ccRCC 4）僅來(lái)源于患者RCC84，而Endo cells 4僅來(lái)自三名個(gè)體（圖1E）。與先前研究一致，免疫細(xì)胞的廣泛浸潤(rùn)，特別是T細(xì)胞和TAMs，表征了ccRCC的免疫微環(huán)境（圖1B和D）。

圖1 ccRCC樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜總覽

2、通過(guò)scRNA-seq對(duì)腫瘤細(xì)胞的分子亞型進(jìn)行表征

         考慮到ccRCC的遺傳傾向，對(duì)所有ccRCC樣本進(jìn)行了全外顯子測(cè)序以了解個(gè)體之間的DNA變異。發(fā)現(xiàn)這些常見(jiàn)突變基因的變異與先前研究中的相似（圖2A）。VHL是最常見(jiàn)的突變基因，其突變率在本研究中為84.2%（圖2A）。有趣的是，發(fā)現(xiàn)CA9（15.8%）、KRT14（15.8%）和CD24（47.3%）的突變率也較高，這些突變是錯(cuò)義突變（圖2A）。將腫瘤細(xì)胞分為VHL、CA9、KRT14和CD24突變或非突變組，并比較它們的基因表達(dá)差異（圖2B–E）。發(fā)現(xiàn)突變和非突變的腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)非常相似，皮爾遜相關(guān)系數(shù)大于0.98（圖2B–E）。因此，這也表明在ccRCC中的單一突變基因并沒(méi)有引起腫瘤細(xì)胞所有基因表達(dá)的巨大變化。

圖2 scRNA-seq揭示了ccRCC中基因突變與基因表達(dá)的關(guān)系

         根據(jù)基因表達(dá)特征，腫瘤細(xì)胞通過(guò)scRNA-seq（圖3A）無(wú)偏地聚類成四個(gè)細(xì)胞亞型（ccRCC 1、ccRCC 2、ccRCC 3和ccRCC 4）。除ccRCC 4外，其余三個(gè)腫瘤細(xì)胞亞型都來(lái)自每個(gè)患者（圖3B）。盡管存在個(gè)體差異，但在腫瘤細(xì)胞中有對(duì)細(xì)胞亞群分類的良好代表性。最初，為客觀地揭示腫瘤細(xì)胞的特定基因表達(dá)，作者將其與鄰近正常上皮細(xì)胞進(jìn)行比較，這些細(xì)胞來(lái)源于作者先前的研究。不同腫瘤細(xì)胞亞型中存在基因表達(dá)的顯著差異。作者發(fā)現(xiàn)ccRCC 1高表達(dá)CA9和NDUF4AL2，而ccRCC 2高表達(dá)KCNQ1OT1和CP（圖3C）。ccRCC 3高表達(dá)NDUF4AL2和CYB5A，而ccRCC 4表達(dá)腫瘤細(xì)胞中大多數(shù)高表達(dá)的基因（圖3C）。CA9和NDUF4AL2在先前的研究中已被確認(rèn)為ccRCC的標(biāo)記基因。CP在先前的單細(xì)胞研究中被確認(rèn)為ccRCC的特異性標(biāo)記物，這在本研究中從更大的ccRCC樣本中得到了證實(shí)。KCNQ1OT1是一個(gè)致癌lncRNA，在先前的研究中已有報(bào)道。然而，這是通過(guò)scRNA-seq首次發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1在ccRCC的特定細(xì)胞亞型中高表達(dá)。

         根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)，進(jìn)行拷貝數(shù)變異（CNV）分析，發(fā)現(xiàn)這些腫瘤細(xì)胞亞型存在不同的CNV特征（圖3D）。作者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的特征是染色體3（chr3）上的缺失和染色體5（chr5）上的增益，與TCGA對(duì)ccRCC的項(xiàng)目結(jié)果一致。這個(gè)結(jié)果在ccRCC 1中更為集中，而在ccRCC 4中不明顯（圖3D）。這可能是由于腫瘤細(xì)胞的克隆或亞克隆導(dǎo)致的。

         擁有ccRCC的亞型信息后，作者試圖預(yù)測(cè)這四種腫瘤細(xì)胞類型的預(yù)后。先計(jì)算每個(gè)腫瘤細(xì)胞類型的差異表達(dá)基因（DEGs）。選擇每個(gè)細(xì)胞亞型的前100個(gè)DEGs，并基于在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)上對(duì)ccRCC的生存分析結(jié)果確定預(yù)后。發(fā)現(xiàn)ccRCC 1、ccRCC 2和ccRCC 3中的大多數(shù)DEGs表明積極的生存狀況，而ccRCC 4中的更多DEGs則表明不良預(yù)后，與前三個(gè)細(xì)胞亞型相比顯著（圖3E）。

圖3 人ccRCC腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性

3、構(gòu)建ccRCC的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性景觀

         在前一項(xiàng)研究中，已經(jīng)構(gòu)建了RCC中免疫細(xì)胞動(dòng)態(tài)染色質(zhì)景觀的單細(xì)胞圖譜，為理解ccRCC中免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)和調(diào)控動(dòng)態(tài)提供了豐富的資源。然而，需要構(gòu)建一個(gè)更全面的ccRCC單細(xì)胞染色質(zhì)可及性景觀，包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的大樣本，這可揭示腫瘤細(xì)胞的調(diào)控特征。在這項(xiàng)研究中，作者對(duì)19個(gè)ccRCC樣本進(jìn)行了scATAC-seq。經(jīng)過(guò)質(zhì)控后，捕獲到了61,693個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞核和190,916個(gè)唯一峰值。將這些細(xì)胞分類為29種不同的細(xì)胞類型，并確定了每種細(xì)胞類型的樣本來(lái)源（圖4A和B）。scATAC-seq的細(xì)胞注釋計(jì)算了腫瘤細(xì)胞（CA9和KRT14）、內(nèi)皮細(xì)胞（VWF和CDH5）、CAF（RGS5）、免疫細(xì)胞（PTPRC）、CD4+ T細(xì)胞（IL7R）、B細(xì)胞（SDC1）和NK細(xì)胞（KLRD1和KLRB1）的標(biāo)記基因活性分?jǐn)?shù)（圖4C）。隨后，對(duì)特定細(xì)胞類型的峰值進(jìn)行了分析，然后確定了這些峰值的相應(yīng)基因區(qū)域（圖4D）。基于以上工作，定義了ccRCC中的29種不同細(xì)胞類型（圖4A）。

圖4 ccRCC的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性和外觀

         利用scATAC-seq在所有細(xì)胞類型中確定了共同可及的染色質(zhì)區(qū)域，例如在chr9和chr17中（圖5A）。這些共同可及的染色質(zhì)區(qū)域還表明它們的調(diào)控過(guò)程并非細(xì)胞類型特異。因此，通過(guò)識(shí)別細(xì)胞類型特異的共同可及染色質(zhì)區(qū)域，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類型特異的調(diào)控過(guò)程。此外，scATAC-seq結(jié)果顯示非腫瘤細(xì)胞（如免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和CAF）的染色質(zhì)可及性在個(gè)體間是一致的（圖5B）。每種細(xì)胞類型都具有良好的樣本普適性，并且?guī)缀鮼?lái)自所有樣本（圖5B）。然而，基于染色質(zhì)可及性，腫瘤細(xì)胞可以被分類為16個(gè)細(xì)胞亞型（圖5C）。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞亞型來(lái)自單個(gè)ccRCC樣本（圖5C）。類似于先前對(duì)基底細(xì)胞癌的研究，ccRCC中腫瘤細(xì)胞的染色質(zhì)可及性顯示出顯著的個(gè)體間異質(zhì)性。

4、scATAC-seq揭示ccRCC腫瘤細(xì)胞染色質(zhì)調(diào)控的特點(diǎn)

         為研究腫瘤細(xì)胞染色質(zhì)調(diào)控的特征，利用scATAC-seq鑒定了16個(gè)腫瘤細(xì)胞亞型及每個(gè)亞型的染色質(zhì)可及性區(qū)域（圖5C）。作者發(fā)現(xiàn)CA9和KRT14在ccRCC細(xì)胞的可及性區(qū)域中充當(dāng)標(biāo)記基因，它們?cè)诿總€(gè)腫瘤細(xì)胞亞型中都保持染色質(zhì)可及性（圖5D和E）。為更好地發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞亞型之間的異質(zhì)性，對(duì)這16個(gè)細(xì)胞亞型中的前10個(gè)染色質(zhì)可及性區(qū)域進(jìn)行富集，并將這些區(qū)域映射到基因上，發(fā)現(xiàn)這些染色質(zhì)可及性區(qū)域既有重疊又有差異，呈現(xiàn)出一種不規(guī)則的狀態(tài)。這也可能表明ccRCC在DNA水平上存在遺傳傾向。

圖5 ccRCC單細(xì)胞染色質(zhì)可及性特征

5、scATAC-seq揭示lncRNA在體外促進(jìn)ccRCC侵襲和遷移

         有趣的是，作者通過(guò)scATAC-seq發(fā)現(xiàn)了四種lncRNA（RP11-661C8.2、CTB-32H22.1、CTB-164N12.1和RP11-267A15.1），這些lncRNA在腫瘤細(xì)胞亞型中具有特異的可及性（圖6A）。所有這些lncRNA都有一個(gè)共同的特征，即位于染色體5上（圖6A）。研究證明cis-acting的lncRNA可以激活、抑制或以其他方式調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)?？紤]到TCGA和本研究均證實(shí)ccRCC具有染色體5上拷貝數(shù)增加的特征，作者假設(shè)這些lncRNA可能在ccRCC中發(fā)揮特定的調(diào)控作用。因此，選擇了兩種lncRNA（RP11-661C8.2和CTB-164N12.1）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別利用ASO-5608和ASO-5717敲低 RP11-661C8.2和CTB-164N12.1。隨后驗(yàn)證這些lncRNA的生物學(xué)功能。

         發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)ASO處理后，ccRCC細(xì)胞系的增殖活性顯著減少，包括786-O組和Caki-2組（圖6B）。CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)ASO處理后ccRCC細(xì)胞系的增殖在24、48和72小時(shí)內(nèi)均受到了抑制，與NC組相比（圖6C）。NC組的劃痕愈合優(yōu)于ASO處理組，無(wú)論是在786-O還是Caki-2中（圖6D–F）。此外，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過(guò)ASO處理后，786-O和Caki-2的遷移顯著減少（圖6G和H）。在ASO處理后，ccRCC細(xì)胞系中E-cadherin的表達(dá)與NC組相比顯著增加（圖6I）。這些結(jié)果確認(rèn)RP11-661C8.2和CTB-164N12.1在體外促進(jìn)ccRCC的侵襲和遷移。

         作者通過(guò)質(zhì)譜法鑒定了與RP11-661C8.2和CTB-164N12.1相互作用的蛋白質(zhì)。根據(jù)可信的肽段和蛋白質(zhì)，富集了與RP11-661C8.2和CTB-164N12.1密切相互作用的蛋白質(zhì)，并展示最顯著的蛋白，如TPM1、TPM4、MYH9、HSPB1、CNBP、MYL6、PUF60和KRT8（圖6J）。發(fā)現(xiàn)這兩種lncRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)非常相似，除了CNBP更緊密地與RP11-661C8.2結(jié)合（圖6J）。隨后，將編碼這些蛋白質(zhì)的基因放入scRNA-seq數(shù)據(jù)中，以估計(jì)它們?cè)诿總€(gè)細(xì)胞亞型中的表達(dá)。有趣的是，這些基因在CAF和內(nèi)皮細(xì)胞3中幾乎都高表達(dá)（圖6J）。一些基因，如TPM1、HSPB1和KRT8，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)（圖6J）。因此，認(rèn)為RP11-661C8.2和CTB-164N12.1的調(diào)控功能是細(xì)胞類型特異的，主要調(diào)控CAF、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。

圖6 ccRCC腫瘤細(xì)胞中特異性lncRNA的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證

6、scATAC-seq揭示ccRCC的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

         scATAC-seq的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是發(fā)現(xiàn)特定的調(diào)控過(guò)程，特別是轉(zhuǎn)錄因子（TFs）。由于這是單細(xì)胞研究，可以將這些TFs特異地定位到細(xì)胞類型。作者發(fā)現(xiàn)許多具有細(xì)胞類型特異性和TF結(jié)合基序的TFs。如SPIC和EOMES分別是B細(xì)胞和NK細(xì)胞中的特異性TFs（圖7A）。與先前的研究相比，基序的DNA堿基序列也非常相似（圖7A）。作者發(fā)現(xiàn)ZEB1充當(dāng)了一個(gè)通用結(jié)合腫瘤細(xì)胞的TF，而ETV4是被非腫瘤細(xì)胞普遍結(jié)合的（圖7A）。此外，通過(guò)scATAC-seq鑒定了內(nèi)皮細(xì)胞（SOX8）、CAFs（EBF2）和T細(xì)胞（ETS1）的特異性TFs和基序（圖7A）。通過(guò)富集每種細(xì)胞類型中前10個(gè)最顯著的TFs，發(fā)現(xiàn)這些TFs具有細(xì)胞類型特異性，尤其是在腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間（圖7B）。為預(yù)測(cè)這些細(xì)胞類型特異性TFs的確切結(jié)合位置，進(jìn)行TF足跡分析（圖7C）。因此，正如前面提到的，定義scATAC-seq中的細(xì)胞類型時(shí)需要考慮TFs。

圖7 通過(guò)scATAC-seq鑒定ccRCC中TFs的特征

7、整合scATAC-seq和scRNA-seq分析揭示腫瘤細(xì)胞的調(diào)控特征

         基因表達(dá)的調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，受到表觀遺傳調(diào)控、lncRNA、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子等因素的影響。在這項(xiàng)研究中，作者通過(guò)整合scATAC-seq和scRNA-seq的結(jié)果，構(gòu)建二者的共嵌圖發(fā)現(xiàn)ccRCC的調(diào)控規(guī)律（圖8A）。盡管通過(guò)空間投影反映的scATAC-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)存在差異，但相同細(xì)胞類型之間的分布非常相似（圖8A）。

         通過(guò)整合scATAC-seq（16個(gè)亞型）和scRNA-seq（四個(gè)亞型）中的所有腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞亞型中染色質(zhì)可及性與基因表達(dá)之間存在相關(guān)性（圖8B）。ccRCC 1（scRNA-seq亞型）的基因表達(dá)與15個(gè)腫瘤細(xì)胞類型（scATAC-seq亞型）的染色質(zhì)可及性相關(guān)聯(lián)（圖8C），表明腫瘤細(xì)胞調(diào)控的復(fù)雜性。還發(fā)現(xiàn)一對(duì)腫瘤細(xì)胞類型，即ccRCC 2（scRNA-seq亞型）和ccRCC 11（scATAC-seq亞型），暗示染色質(zhì)可及性與基因表達(dá)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系（圖8C）。在先前的結(jié)果中，ccRCC 2和ccRCC 11主要來(lái)自樣本RCC84（圖2C）。因此，揭示由ccRCC 11的可及染色質(zhì)區(qū)域調(diào)控的ccRCC 2的基因表達(dá)特征是準(zhǔn)確的（圖8D）。然而，ccRCC 1（scRNA-seq亞型）的調(diào)控特征復(fù)雜，包括15個(gè)scATAC-seq腫瘤細(xì)胞亞型的調(diào)控特征（圖8E）。盡管如此，在所有15個(gè)腫瘤細(xì)胞亞型中發(fā)現(xiàn)了一些共同的可及染色質(zhì)區(qū)域：“chr11-111906243-111914666”、“chr19-10352456-10354286”、“chr5-178286237-178290844”和“chr7-73829891-73835325”（圖8E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，在研究的ccRCC腫瘤細(xì)胞的可及染色質(zhì)區(qū)域存在個(gè)體差異，同時(shí)也存在共同的調(diào)控區(qū)域。

圖8 整合scRNA-seq和scATAC-seq分析

實(shí)驗(yàn)方法：

         臨床樣本收集，細(xì)胞培養(yǎng)，scATAC-seq，scRNA-seq，生物信息學(xué)分析， 核/質(zhì)分離和qRT-PCR，流式細(xì)胞術(shù)，劃痕實(shí)驗(yàn)，transwell實(shí)驗(yàn)，RNA pull down+質(zhì)譜，免疫印記

參考文獻(xiàn)：

         Yu Z, Lv Y, Su C, Lu W, Zhang R, Li J, Guo B, Yan H, Liu D, Yang Z, Mi H, Mo L, Guo Y, Feng W, Xu H, Peng W, Cheng J, Nan A, Mo Z. Integrative Single-Cell Analysis Reveals Transcriptional and Epigenetic Regulatory Features of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 2023 Mar 2;83(5):700-719. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-22-2224. PMID: 36607615; PMCID: PMC9978887.