口腔癌患者的放化療影響唾液微生物群

         口腔鱗狀細(xì)胞癌（SCC）與口腔微生物生態(tài)失調(diào)有關(guān)。在這項(xiàng)獨(dú)特的研究中，作者通過16S rRNA基因測序比較了SCC患者治療前后的唾液微生物組，并檢查了微生物組學(xué)變化與抗微生物蛋白表達(dá)的相關(guān)性。SCC的治療與總體細(xì)菌豐富度和多樣性降低有關(guān)。微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，包括卟啉單胞菌科和普雷沃菌科的豐度下降，乳酸桿菌科的豐度增加。在放化療治療前后，微生物群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生顯著變化，而僅手術(shù)治療沒有發(fā)生變化。在單獨(dú)接受放化療的患者中，在治療前后，有反應(yīng)者和無反應(yīng)者之間有幾種細(xì)菌種群的豐度存在差異。微生物組學(xué)的變化與DMBT1（一種人類唾液中的抗微生物蛋白）的表達(dá)變化有關(guān)。此外，作者發(fā)現(xiàn)，治療后增加的唾液DMBT1可以作為治療后唾液生物標(biāo)志物，這與微生物變化有關(guān)。具體而言，治療后人類唾液DMBT1的增加與孿生球菌屬spp.、巴斯德氏菌科spp.、乳酸菌spp.和 奧利桿菌屬spp.豐度增加相關(guān)。這是首次研究SCC患者口腔微生物組學(xué)治療相關(guān)變化（放化療和手術(shù)）以及唾液中抗微生物蛋白表達(dá)變化的縱向研究?？谇晃⑸锶旱慕M成可以預(yù)測治療反應(yīng)；唾液DMBT1可能在調(diào)節(jié)SCC患者的口腔微生物組學(xué)中發(fā)揮作用。本研究于2023年11月發(fā)表在《Microbiome》，IF 15.5。

技術(shù)路線：

 主要研究結(jié)果：

1 唾液微生物組學(xué)的縱向分析

         圖1A是整個研究工作流程的示意圖，包括樣本收集、分析和主要比較。Z作者研究了從治療前到治療后口腔微生物組學(xué)的變化，這些唾液是從SCC患者診斷時和6個月后（0和6個月中）收集的，以確定治療完成后不久發(fā)生的變化。初始治療包括放化療、化療、放療和手術(shù)。NMDS分析表明，在0個月和6個月之間，微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異（圖1B）。此外，治療處理后樣品中的微生物豐富度和多樣性均降低（圖1C、D）。治療后厚壁菌門顯著增加，擬桿菌、梭桿菌和變形菌門減少（圖1E）。在相對豐度至少為0.1%的細(xì)菌家族中，擬桿菌科、伯克霍爾德菌科、丹毒菌科、黃桿菌科、毛螺菌科、奈瑟菌科、乳桿菌科、鉤端菌科、普雷沃菌科、巴氏桿菌科、消化鏈球菌科和卟啉單胞菌科顯著減少，雙歧桿菌科、乳細(xì)菌科和假單胞菌科明顯增加（圖1F）。有幾種OTU在治療后顯著降低，包括未分類的巴氏桿菌科（OTU0006）、卟啉單胞菌屬（OTU0028，Lachnoanaerobaculum（OTU0045）、未分類的黃桿菌科（OTU0064）、未歸類的乳桿菌屬（OTU0013）和普雷沃氏菌（OTU0002）（圖1G）。該分析中只有兩個OTU在治療后顯著增加，即鏈球菌（OTU0024）和乳酸桿菌（OTU0025）。

         通過LEfSe分析，其中一些菌在0月至6個月之間差異最大，盡管發(fā)現(xiàn)其他OTU與基線樣品相關(guān)，包括放線菌（OTU0007）和普雷沃氏菌（OTU4010），或在治療后樣品中富集，包括乳桿菌（OTU0011）、普雷沃氏菌，乳酸桿菌（OTU0020）和假單胞菌（OTU0066）?？傊?，這些研究表明，SCC治療后唾液微生物組學(xué)發(fā)生了變化。

圖1：SCC治療后口腔微生物組學(xué)的多樣性和豐富度下降

2 與單獨(dú)手術(shù)或放化療相關(guān)的唾液微生物組學(xué)特征

         放療、手術(shù)、放化療和化療是SCC的治療選擇。由于微生物組學(xué)可以影響治療反應(yīng)，使用從SCC患者第0個月和第6個月采集的匹配樣本，作者研究了與放化療（圖2）或手術(shù)（圖3）相關(guān)唾液中的微生物變化。由于樣本量?。?span><12/組），排除了接受手術(shù)后輔助放療、手術(shù)后放化療或僅接受放療或僅接受化療的患者。

         與開始治療前的時間0相比，接受0個月和6個月放化療的匹配樣本的患者（n=33）在6個月時表現(xiàn)出微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著差異（圖2A）。多樣性沒有顯著變化（圖2B），盡管治療后豐富度下降（圖2C）。在門水平上，厚壁菌門的相對豐度增加，擬桿菌門和變形桿菌門相對豐富度減少（圖2D）。此外，放化療后，在豐度＞0.1%的科中，普雷沃菌科、巴氏桿菌科、奈瑟菌科、鉤端螺旋菌科和鉤端螺旋桿菌科顯著減少，乳桿菌科和假單胞菌科增加。ALDEx2進(jìn)一步鑒定與治療前和治療后相關(guān)的OTU。具體而言，乳酸桿菌（OTU0025）顯著增加，未分類的巴氏桿菌科（Pasteudellaceae spp.）顯著減少。通過LEfSe分析，其中一些OTU在放化療前后也被鑒定為具有差異性豐富。PICRUST分析顯示，參與膜和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分子、能量代謝、細(xì)菌分泌系統(tǒng)和細(xì)菌運(yùn)動蛋白的通路在治療前具有更高的相關(guān)性；參與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路的代表性增加與治療后有關(guān)（圖2H）。總之，這些研究表明，放化療治療SCC后，唾液微生物組學(xué)發(fā)生了變化。

圖2：放化療后微生物組學(xué)顯著變化

         對于單獨(dú)接受手術(shù)治療的患者（n=15），總體群落結(jié)構(gòu)和多樣性沒有顯著差異（圖3A，3B）。有趣的是，豐富度在6個月時顯著減少（圖3C）。盡管在門（圖3D）或家族水平（數(shù)據(jù)未顯示）上的相對豐度在手術(shù)前后沒有顯著差異，但LEfSe分析顯示，治療前未分類的乳桿菌屬（OTU0013）、鉤端毛滴蟲（OTU0106）、未分類的黃桿菌科（OTU0064）以及治療后的韋氏菌（OTU0185）和假單胞菌（OTU4066）占主導(dǎo)地位（圖3E，F）。

         基于PICRUSt和LEfSe分析，與治療相關(guān)的KEGG通路顯示，與遺傳信息處理相關(guān)通路，如手術(shù)前的翻譯（即核糖體）、脂多糖生物合成和DNA復(fù)制，以及治療后涉及氨基酸代謝（D-丙氨酸）通路的代表性增加（圖3G）。

圖3：單獨(dú)手術(shù)后唾液微生物組學(xué)豐富度的顯著變化

3 唾液微生物群變化與放化療反應(yīng)的關(guān)系

         確定指示反應(yīng)的生物標(biāo)志物具有重要臨床意義。收集患者放化療前（n=50）和放化療后（n=33）的唾液樣本，用于鑒定與放化療反應(yīng)相關(guān)的潛在微生物生物標(biāo)志物。如果在隨訪期間（n=11）出現(xiàn)任何復(fù)發(fā)(局部或轉(zhuǎn)移)，則認(rèn)為患者無應(yīng)答，而應(yīng)答者在最長隨訪時間之前被認(rèn)為無疾?。ㄩL達(dá)5年，n=39）。

         在基線（0個月），細(xì)菌群落之間的θYC距離顯示出總體細(xì)菌特征的顯著差異（圖4A），但在應(yīng)答者和無應(yīng)答者之間的多樣性（圖4B）和豐富度（圖4C）沒有差異。應(yīng)答者和無應(yīng)答者在開始放化療之前，屬于不同門細(xì)菌的相對豐度相似（圖4D）。此外，無應(yīng)答者和應(yīng)答者之間，唾液中豐度大于0.1%的任何觀察到的細(xì)菌家族的相對豐度均無顯著差異（數(shù)據(jù)未顯示），包括先前與口腔癌癥相關(guān)的家族，如卟啉單胞菌科、普雷沃菌科、鏈球菌科，或梭桿菌科（圖4E）。盡管ALDEx2分析在基線時沒有預(yù)測到任何與治療反應(yīng)顯著相關(guān)的OTU，但基線唾液樣本的LEfSe分析顯示，無應(yīng)答者與普雷沃氏菌（OTU0029）之間存在顯著關(guān)聯(lián)（圖4F），而未分類的巴氏桿菌科（OTU0006），和勞特羅普氏菌屬（OTU0092）在應(yīng)答者中更為豐富（圖4G）。PICRUSt分析未揭示任何與反應(yīng)或復(fù)發(fā)相關(guān)的預(yù)測功能途徑（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖4：普雷沃氏菌與基線放化療無反應(yīng)相關(guān)

         在6個月完成治療后，當(dāng)比較無應(yīng)答者（n=8）和應(yīng)答者（n=25）之間的唾液微生物群落時，基于θYC距離的總體群落結(jié)構(gòu)存在更高的顯著差異（圖5A），但總體多樣性（圖5B）或豐富度（圖5C）沒有差異。治療后，應(yīng)答者和無應(yīng)答者在厚壁菌門、擬桿菌門和梭桿菌門中的細(xì)菌豐度也相似（圖5D），與治療前應(yīng)答者和無應(yīng)答者的唾液微生物群一樣，通常與口腔癌菌群失調(diào)相關(guān)的不同細(xì)菌家族的相對豐度沒有顯著差異，包括卟啉單胞菌科、普雷沃氏菌科或梭桿菌科。然而，觀察到鏈球菌科顯著減少（圖5E和數(shù)據(jù)未顯示）。治療后樣本的LEfSe分析顯示，應(yīng)答者與韋氏菌（OTU0001）、鏈球菌（OTU0004）、羅氏菌屬（OTU0015和OTU0016）、孿生球菌屬（OTU0014）、奇異菌屬（OTU0021）和放線酵母（OTU0023）的相對豐度之間存在顯著關(guān)聯(lián)（圖5F，G）。

         由于微生物代謝產(chǎn)物會影響對治療的反應(yīng)，因此進(jìn)行PICRUSt預(yù)測從16s rRNA序列推斷出的可能與反應(yīng)相關(guān)的功能通路。與治療前樣本不同，治療前樣本在應(yīng)答者和非應(yīng)答者之間的預(yù)測代謝途徑?jīng)]有差異（數(shù)據(jù)未顯示），治療后樣本顯示應(yīng)答者與氨基酸生物合成和代謝相關(guān)途徑的代表性增加（圖5H）。另一方面，無應(yīng)答者參與糖代謝、酪氨酸代謝和脂肪酸生物合成的多種途徑增加（圖5H）。

圖5：6個月時放化療應(yīng)答者和無應(yīng)答者之間的微生物組學(xué)差異

4 SCC下調(diào)唾液中的DMBT1

         作者之前證明，DMBT1是一種抗微生物蛋白，在SCC中下調(diào)，并與侵襲能力增加和預(yù)后不良有關(guān)。DMBT1在唾液腺中強(qiáng)烈表達(dá)，占唾液分泌蛋白的10%。為確定SCC患者唾液中DMBT1的表達(dá)是否隨治療而變化，對一組患者進(jìn)行免疫印跡分析（圖6A）。來自48個SCC患者唾液樣本的免疫印跡分析顯示，與體積標(biāo)準(zhǔn)化樣品的基線相比，治療前DMBT1表達(dá)低，治療后6個月（平均2.1倍）和12個月（1.9倍）水平顯著增加（圖6B，D）。ELISA （圖 6C，E） 對通過免疫印跡分析篩選的 48 名患者中一個子集 （n=28） 的唾液樣本觀察到類似的發(fā)現(xiàn)。無論治療方案如何，這些數(shù)據(jù)表明DMBT1表達(dá)在SCC治療后均增加。

圖6：未經(jīng)治療的SCC患者唾液中DMBT1分泌受到抑制

         為直接研究SCC調(diào)節(jié)唾液DMBT1分泌的程度，將UM-SCC-1細(xì)胞皮下注射到小鼠中，并在兩個時間點(diǎn)對成年小鼠唾液中的DMBT1進(jìn)行定量（圖7A）。將DMBT1標(biāo)準(zhǔn)化為唾液體積，以適應(yīng)小鼠之間分泌的變化。從注射后10天開始，測量腫瘤大小并計算腫瘤體積（圖7B）。蘇木精-伊紅染色和細(xì)胞角蛋白免疫組織化學(xué)證實(shí)了SCC的存在（圖7C）。患有腫瘤的成年小鼠的DMBT1分泌顯著減少，而對照小鼠的DMBT1分泌在兩個時間點(diǎn)之間沒有顯著差異（圖7D，E）。在本實(shí)驗(yàn)的線性混合模型中，組x時間的相互作用項(xiàng)趨于顯著性。人類和小鼠唾液研究共同表明，SCC抑制唾液中DMBT1的表達(dá)。

圖7：腫瘤發(fā)生后小鼠唾液DMBT1減少

5 唾液中DMBT1水平與特定細(xì)菌群相關(guān)

         在人類唾液樣本中（圖6），作者應(yīng)用Pearson相關(guān)模型研究DMBT1蛋白表達(dá)與治療前后唾液微生物組學(xué)組成之間的關(guān)系（圖8）。治療前，較低水平的DMBT1與較高的梭桿菌（OTU0065）、未分類的鉤體螺科（OTU0072）和未分類的糖念珠菌屬（OTU0205）的相對豐度以及較低的密螺旋體（OTU0153和OTU0980）、鏈球菌（OTU0284）和普雷沃氏菌（OTU496）的相對豐富度相關(guān)。治療后，高DMBT1水平與放線菌（OTU0023和OTU0143）、?？暇鷮伲?span>OTU0091）、嗜二氧化碳噬細(xì)胞菌（OTU0043和OTU2071）、乳酸桿菌（OTU0131）和鏈球菌（OTU0024和OTU4624）的豐度呈負(fù)相關(guān)，而DMBT1表達(dá)與未分類厚壁菌門成員（OTU0146），未分類叢毛單胞菌科（OTU0355）、未分類毛螺菌科（OTU0072）、普氏菌屬（OTU0087）和Stomatobaculum（OTU0080）的豐度呈正相關(guān)（圖8）。作者還分析了DMBT1表達(dá)隨時間變化與OTU豐度變化之間的相關(guān)性。有趣的是，治療后唾液中DMBT1表達(dá)的增加與孿生球菌屬（OTU0014），其在6個月放化療的應(yīng)答者中也富集（圖5G），未分類的巴氏桿菌科屬（OTU0006），其在0個月時的應(yīng)答者中富集，乳桿菌（OTU0025），巨球藻（OTU0012）和金桿菌（OTU4046）豐度的增加相關(guān)（圖8）。

         總之，這些發(fā)現(xiàn)表明SCC患者口腔微生物組學(xué)的變化與唾液抗微生物蛋白DMBT1的表達(dá)變化有關(guān)。

圖8：唾液中DMBT1的下調(diào)與微生物組學(xué)變化有關(guān)

結(jié)論：

         這是首項(xiàng)縱向研究，旨在調(diào)查SCC患者口腔微生物組學(xué)的治療相關(guān)差異，并將其與DMBT1表達(dá)的變化聯(lián)系起來。作者的研究結(jié)果支持SCC唾液生物標(biāo)志物和微生物組學(xué)生物標(biāo)志物的發(fā)展，以預(yù)測對治療的反應(yīng)。未來的研究應(yīng)針對與反應(yīng)相關(guān)的候選微生物物種，如孿生球菌屬spp.和纖毛菌屬spp.，包括其對SCC治療反應(yīng)的表征和潛在機(jī)制的鑒定。

實(shí)驗(yàn)方法：

         DNA提取與擴(kuò)增，16S rRNA測序，ELISA，WB

參考文獻(xiàn)：

         Medeiros MC, The S, Bellile E, Russo N, Schmitd L, Danella E, Singh P, Banerjee R, Bassis C, Murphy GR 3rd, Sartor MA, Lombaert I, Schmidt TM, Eisbruch A, Murdoch-Kinch CA, Rozek L, Wolf GT, Li G, Chen GY, D'Silva NJ. Salivary microbiome changes distinguish response to chemoradiotherapy in patients with oral cancer. Microbiome. 2023 Nov 30;11(1):268. doi: 10.1186/s40168-023-01677-w. PMID: 38037123; PMCID: PMC10687843.