細(xì)胞外囊泡蛋白質(zhì)組揭示組織蛋白酶B與阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的聯(lián)系

       阿爾茨海默病（AD）是癡呆最常見的病因，也是全球亟待解決的主要醫(yī)學(xué)問(wèn)題。該疾病的病理學(xué)特征是由淀粉樣-β肽（Aβ）在細(xì)胞外聚集構(gòu)成的淀粉樣斑塊和由磷酸化Tau蛋白（pTau）構(gòu)成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)在細(xì)胞內(nèi)沉積。近年來(lái)，有人提出，致病蛋白通過(guò)細(xì)胞外囊泡（EVs）在神經(jīng)元之間傳播參與了AD進(jìn)展。外泌體、微囊泡和凋亡囊泡等EVs是含有多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的分泌性膜囊。EVs可由多種細(xì)胞釋放，有報(bào)道稱來(lái)自CNS的EVs含有aβ、其分解代謝酶和Tau等分子，這些分子均在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。該研究發(fā)表在《Brain》，IF：14.5。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. ATN分類中腦脊液細(xì)胞外囊泡的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

       工作流程如圖1所示。首先，利用受試者工作特征（ROC）曲線分析腦脊液aβ42、pTau和Tau的截?cái)嘀担?span>cut-off值）（n=60；aβ42的cut-off值為677.9 pg/ml（AUC 0.80，靈敏度87%，特異度70%），pTau的cut-off值為73.0 pg/ml（AUC 0.74，靈敏度97%，特異度57%），tTau的cut-off值為597.7 pg/ml（AUC 0.80，靈敏度78%，特異度70%）。接下來(lái)，利用這些cut-off值設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)組學(xué)分析的發(fā)現(xiàn)集（表1）。

       為了鑒定與AD病理進(jìn)展相關(guān)的蛋白質(zhì)，研究者從16例參與者的腦脊液中分離出EVs，測(cè)量其粒徑并使用LC-MS/MS進(jìn)行分析。分離的EV平均粒徑約為120nm。從腦脊液EV中共鑒定和定量了1756個(gè)蛋白質(zhì)。鑒定的腦脊液EV蛋白質(zhì)與Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫(kù)中top100列表中的EV蛋白質(zhì)進(jìn)行了比較，在腦脊液EV蛋白質(zhì)組學(xué)列表中發(fā)現(xiàn)了top100列表中的87個(gè)蛋白質(zhì)。通過(guò)注釋、可視化和整合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析，進(jìn)一步對(duì)腦脊液EV蛋白進(jìn)行功能評(píng)估在生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分中富集的蛋白主要與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組成和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織相關(guān)。這些結(jié)果表明，樣品富含EVs。A?T?N?組、A+T-N?/A+T?N+組和A+T+N+組腦脊液EVs分別鑒定出1487、1592和1535個(gè)蛋白質(zhì)。在所有組中檢測(cè)到約95.2%的蛋白質(zhì)（1671個(gè)蛋白質(zhì)），A?T?N?、A+T?N?/A+T?N+和A+T+N+分別有1、30和15個(gè)蛋白質(zhì)（圖2A）。兩組共有的蛋白質(zhì)數(shù)量為：EV標(biāo)志蛋白Alix、CD9和CD63的豐度水平在三組間無(wú)差異，表明蛋白質(zhì)組學(xué)譜的差異很可能不是由于EV數(shù)量/組成的差異。

圖2 在ATN分類下對(duì)發(fā)現(xiàn)集中的腦脊液細(xì)胞外囊泡（EV）蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2. 淀粉樣蛋白發(fā)病期間腦脊液和血漿細(xì)胞外囊泡中CatB水平升高

       CatB是在A?T?N?和A+T?N?/A+T?N+之間發(fā)生顯著變化的蛋白之一，與AD腦內(nèi)的老年斑相關(guān)，也參與溶酶體蛋白酶介導(dǎo)的淀粉樣前體蛋白（APP）向Aβ的加工。因此，研究者選擇了CatB，在使用CSF和血漿EVs的更大規(guī)模隊(duì)列中驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果。從136份腦脊液樣本中分離出EV，分為7個(gè)ATN組（表3），采用ELISA法測(cè)定其CatB水平（CSF-EV-CatB）。從CSF和血漿中分離出的EV平均粒徑約為105 nm。與蛋白質(zhì)組學(xué)分析一致，CSF-EV-CatB水平顯著升高（A?，35.9±24.7 pg/ml；A+為95.4±23.9 pg/ml；P<0.0001)與淀粉樣蛋白陰性組相比（圖3A），并且A+和T+時(shí)的水平分別顯著高于A-和T-時(shí)的水平（圖3B）。CatB濃度與腦脊液aβ42濃度呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)（r=?065，P<0.0001），與pTau呈極弱相關(guān)（r=0.172，P=0.046），與tTau呈弱相關(guān)（r=0.261，P=0.019）（圖3C-E）。這些結(jié)果表明CSF-EV-CatB與CSF的Aβ狀態(tài)密切相關(guān)。

圖3 基于ELISA方法驗(yàn)證CatB在腦脊液細(xì)胞外囊泡中的表達(dá)

       EVs外周血中可用于監(jiān)測(cè)病變?cè)?span>CNS。因此，研究者測(cè)量總CatB和EV CatB使用由ELISA血漿樣本136例（表3），由于等離子體的濃度CatB ATN組之間沒(méi)有顯著差異。與自由等離子CatB plasma-EV-CatB水平顯著增加相比，A?T?N?（A?T?N?，143.3±40.4 pg/ml；A+T?N?，177.7±52.6 pg/ml；P=0.042），而在其他AD連續(xù)組中沒(méi)有（圖4A）。A+組的水平顯著高于A-組，但T+/T?組和N+/N?組之間沒(méi)有差異（圖4B）。血漿-EV-CatB與CSF aβ42濃度呈中度負(fù)相關(guān)，但與CSF pTau或tau無(wú)中度負(fù)相關(guān)（圖4C-F）。這些結(jié)果提示血漿EV-CatB與腦脊液Aβ狀態(tài)相關(guān)。

圖4 ELISA驗(yàn)證血漿細(xì)胞外囊泡中的CatB作為推定的血液生物標(biāo)志物使用ATN分類

結(jié)論：

       總之，該研究對(duì)ATN分類中的腦脊液EVs進(jìn)行的全蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，淀粉樣蛋白陽(yáng)性組和淀粉樣蛋白陰性組之間有6種蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著變化。此外，對(duì)136份樣本的ELISA分析證實(shí)，隨著淀粉樣蛋白進(jìn)展，CSF和血漿中EVs中的CatB水平升高，表明EVs中的CatB可能參與AD淀粉樣蛋白的發(fā)病機(jī)制。除了與淀粉樣蛋白病理相關(guān)的蛋白，EV蛋白質(zhì)組分析揭示了一些病理生理功能未知的蛋白，這些蛋白的表達(dá)在Tau蛋白病理/神經(jīng)變性中發(fā)生了改變，這可能有助于闡明AD的分子發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療藥物。

實(shí)驗(yàn)方法：

       質(zhì)譜分析，免疫測(cè)定，ELISA，蛋白質(zhì)組學(xué)分析

參考文獻(xiàn)：

       Yuyama K, Sun H, Fujii R, Hemmi I, Ueda K, Igeta Y. Extracellular vesicle proteome unveils cathepsin B connection to Alzheimer's disease pathogenesis. Brain. 2023 Dec 10:awad361. doi: 10.1093/brain/awad361.