腫瘤相關(guān)纖維化損害非小細(xì)胞肺癌的免疫監(jiān)視和對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)

       非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。免疫檢查點(diǎn)阻斷改善了許多非小細(xì)胞肺癌患者的生存，但大多數(shù)患者無(wú)法獲得長(zhǎng)期益處。了解導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌免疫監(jiān)視降低的因素對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要。在這里，作者發(fā)現(xiàn)人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌含有大量的纖維化，這與T細(xì)胞浸潤(rùn)減少有關(guān)。在小鼠非小細(xì)胞肺癌模型中，纖維化的誘導(dǎo)導(dǎo)致肺癌進(jìn)展加快，T細(xì)胞免疫監(jiān)視功能受損，免疫檢查點(diǎn)阻斷效果失效。與這些變化相關(guān)，作者觀察到纖維化導(dǎo)致樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量和功能受損，巨噬細(xì)胞表型改變，這可能導(dǎo)致免疫抑制。在癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞中，col13a1表達(dá)群體中的明顯變化表明，這些細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子來(lái)招募巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，同時(shí)限制樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的招募。通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體信號(hào)傳導(dǎo)靶向纖維化克服了纖維化的影響，增強(qiáng)了T細(xì)胞反應(yīng)，提高了免疫檢查點(diǎn)阻斷的療效，但僅在化療的背景下。總之，這些數(shù)據(jù)表明，非小細(xì)胞肺癌的纖維化導(dǎo)致免疫監(jiān)視降低和對(duì)檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)性差，并突出了抗纖維化治療作為克服免疫治療耐藥性的候選策略。該文與2023年6月發(fā)布于《Science Translational Medicine》，IF=17.1。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌組織纖維化TME

       為了確定纖維化對(duì)非小細(xì)胞肺癌的影響，作者首先表征了人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌中反應(yīng)性基質(zhì)的定位和相對(duì)豐度。為了分析反應(yīng)性纖維化，作者首先對(duì)NSCLC TMAs進(jìn)行了膠原三色染色和α -平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的免疫組織化學(xué)(IHC)分析，α-SMA是活化成纖維細(xì)胞的標(biāo)志。作者確定，與正常對(duì)照肺組織相比，NSCLC的TME中纖維化量增加，這可以通過(guò)膠原沉積增加(圖1A和B)和活化的CAFs(圖1、C和D)來(lái)定義。此外，在腫瘤細(xì)胞巢周?chē)?jīng)?？梢?jiàn)成纖維細(xì)胞(圖1C)?？紤]到獲取TMA的抽樣偏差，作者接下來(lái)對(duì)作者機(jī)構(gòu)獲得的I期和II期非小細(xì)胞肺癌切除樣本的蘇木精和伊紅(H&E)染色切片進(jìn)行了自動(dòng)組織分析(圖1E和F)。作者確定，按面積計(jì)算，腫瘤相關(guān)間質(zhì)平均約占切除樣本的50%，范圍從14.1到82.9%(圖1G)。這些數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌存在大量的腫瘤相關(guān)纖維化和結(jié)締組織增生。為了更好地了解這種腫瘤結(jié)締組織增生與腫瘤免疫的關(guān)系，作者評(píng)估了T細(xì)胞浸潤(rùn)情況。作者進(jìn)行了CD8和CK7雙免疫組化染色，以確定CD8+ T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的接近程度，并將其與來(lái)自每個(gè)樣本的基質(zhì)數(shù)量進(jìn)行比較。作者發(fā)現(xiàn)基質(zhì)的數(shù)量，無(wú)論是以基質(zhì)面積還是膠原密度計(jì)算，都與CK7+腫瘤細(xì)胞50 μm內(nèi)CD8+ T細(xì)胞數(shù)量的減少相關(guān)(圖1,H至J)。這些數(shù)據(jù)表明，腫瘤相關(guān)纖維化的增加可能會(huì)影響非小細(xì)胞肺癌的T細(xì)胞數(shù)量。

圖1、人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌組織存在反應(yīng)性纖維化

2、反應(yīng)性纖維化驅(qū)動(dòng)肺腺癌進(jìn)展

       為了確定纖維化在腫瘤免疫監(jiān)測(cè)和腫瘤進(jìn)展中的作用，作者評(píng)估了幾種非小細(xì)胞肺癌小鼠模型的纖維化。其中包括常用的基因工程小鼠模型(GEMMs) KrasLSL-G12D;Trp53fl/fl (KPL)小鼠，它們被給予氣管內(nèi)單次腺病毒- Cre重組酶誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。作者還使用了Lewis肺癌(LLC)的原位模型，以及在氣管內(nèi)腺病毒- Cre重組酶(KPL86)治療9個(gè)月后，從Trp53雜合null (KPL GEMM)的肺中提取的細(xì)胞系。與人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌相比，在所有這些模型中，作者發(fā)現(xiàn)膠原沉積最少（圖2A-C）。為了模擬反應(yīng)性纖維化可能對(duì)腫瘤進(jìn)展和免疫的影響，作者使用了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。其中包括氣管內(nèi)給藥博來(lái)霉素(Bleo)或異硫氰酸熒光素(FITC)。Bleo誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致自由基和氧化應(yīng)激增加，最終在2 - 4周內(nèi)導(dǎo)致炎癥和反應(yīng)性纖維化。FITC導(dǎo)致肺泡和血管損傷加重，在2 ~ 3周內(nèi)導(dǎo)致纖維化。Bleo或FITC膠原蛋白增加,所評(píng)估的三色的染色,淀積瘤旁和肺實(shí)質(zhì),以及腫瘤相關(guān)αSMA +三個(gè)模型的成纖維細(xì)胞(圖2A-C)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，作者觀察到在纖維化環(huán)境中CD45 - EpCAM - CD31 - CAFs的數(shù)量增加。在所有評(píng)估的模型中，Bleo或FITC誘導(dǎo)反應(yīng)性纖維化導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展加快，包括KPL GEMMs和原位LLC和KPL86模型(圖2D-I)?？傊@些數(shù)據(jù)表明反應(yīng)性纖維化可能是腫瘤進(jìn)展的強(qiáng)大驅(qū)動(dòng)因素。

圖2、反應(yīng)性纖維化促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌小鼠模型的癌癥進(jìn)展

3、纖維化損害免疫監(jiān)視和T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤控制

       鑒于T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤控制的重要性，以及作者在人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌中觀察到纖維化與T細(xì)胞負(fù)相關(guān)，作者試圖確定纖維化是否會(huì)損害T細(xì)胞免疫。免疫組化對(duì)T細(xì)胞的分析顯示，來(lái)自KPL GEMMs以及LLC和KPL86原位模型的bleo誘導(dǎo)的纖維化腫瘤中CD8+ T細(xì)胞數(shù)量減少(圖3A-D)。同樣，FITC誘導(dǎo)的反應(yīng)性纖維化也減少了KPL GEMMs腫瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，纖維化小鼠的PD-1+ CD8+ T細(xì)胞和Foxp3+ CD4+ treg增加。為了評(píng)估纖維化對(duì)腫瘤控制的作用是否可能是T細(xì)胞介導(dǎo)的，在原位LLC模型中，無(wú)論是否存在Bleo, CD4+和CD8+ T細(xì)胞都被耗盡。在沒(méi)有Bleo的情況下，作者發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞的耗竭導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷的增加，這表明在該模型中T細(xì)胞能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)(圖3E)。相反，在Bleo存在的情況下，作者發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞的消耗并沒(méi)有進(jìn)一步增加腫瘤負(fù)荷(圖3E)。這些數(shù)據(jù)表明，纖維化至少在一定程度上通過(guò)損害T細(xì)胞來(lái)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。為了評(píng)估纖維化對(duì)免疫監(jiān)測(cè)的影響，作者使用了KPL GEMMs，這些GEMMs在Cre-recombinase的控制下，也表達(dá)與綠色熒光蛋白(GFP) (KPLOG)融合的卵清蛋白(OVA)(圖3F)。在由此產(chǎn)生的腫瘤中，作者觀察到與KPL小鼠相比，KPLOG小鼠的CD8+ T細(xì)胞顯著(P = 0.02)增加，這表明誘導(dǎo)了T細(xì)胞免疫(圖3G和H)。在該模型中，與免疫監(jiān)視在腫瘤控制中的作用一致，表達(dá)OG抗原的KPLOG小鼠衍生的腫瘤比OG?KPL小鼠的腫瘤小(圖3I和J)。OG新抗原表達(dá)對(duì)免疫介導(dǎo)的腫瘤控制的影響被取消，OG+和OG?KPL小鼠的腫瘤負(fù)荷同樣加速(圖3I和J)。這些數(shù)據(jù)表明，纖維化損害了新抗原驅(qū)動(dòng)的T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤控制。與作者之前的觀察結(jié)果一致，纖維化減少了KPLOG小鼠肺和腫瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量(圖3K和L)，同時(shí)增加了Foxp3+ Tregs。對(duì)ova特異性葡聚糖+ T細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)顯示，纖維化肺(圖3M)和KPLOG GEMMs的引流淋巴結(jié)中抗原特異性CD8+ T細(xì)胞減少(圖3N)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，在纖維化的情況下，T細(xì)胞啟動(dòng)受損。當(dāng)FITC誘導(dǎo)纖維化時(shí)，作者觀察到對(duì)腫瘤負(fù)荷和CD8+ T細(xì)胞定位的類(lèi)似影響，證實(shí)這是一種纖維化介導(dǎo)的對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤控制的損害，而不是對(duì)T細(xì)胞功能的bleo特異性影響(圖30-R)。

圖3、反應(yīng)性纖維化損害非小細(xì)胞肺癌模型的免疫監(jiān)視

4、在非小細(xì)胞肺癌模型中，纖維化損害檢查點(diǎn)阻斷療效

       鑒于作者觀察到抗原特異性T細(xì)胞減少和免疫監(jiān)視，作者下一步試圖確定纖維化是否會(huì)損害免疫檢查點(diǎn)抑制劑的功效。為了評(píng)估這一點(diǎn)，作者評(píng)估了不同治療環(huán)境下KPL86原位荷瘤小鼠的腫瘤負(fù)荷。如上所述,誘導(dǎo)纖維化導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷的增加(圖4A和B)。與標(biāo)準(zhǔn)化療治療非小細(xì)胞肺癌(卡鉑和培美曲塞)導(dǎo)致相當(dāng)于減少腫瘤負(fù)荷不管時(shí)間(圖4A和B)。然而,在纖維化后,檢查點(diǎn)阻斷與化療相比沒(méi)有額外的益處，這表明纖維化TME取消了檢查點(diǎn)阻斷的功效(圖4A和B)。這些數(shù)據(jù)表明，纖維化TME中T細(xì)胞免疫的改變限制了免疫檢查點(diǎn)阻斷的益處。

圖4、反應(yīng)性纖維化損害對(duì)免疫檢查點(diǎn)封鎖的反應(yīng)

5、肺纖維化導(dǎo)致骨髓反應(yīng)改變

       為了更好地理解纖維化如何導(dǎo)致免疫抑制性TME，作者首先分析了腫瘤浸潤(rùn)的骨髓細(xì)胞。在肺中，巨噬細(xì)胞和常規(guī)樹(shù)突狀細(xì)胞(cDC)是抗原呈遞的主要介質(zhì)，這些細(xì)胞的功能障礙導(dǎo)致免疫監(jiān)視改變。因此，作者對(duì)有無(wú)實(shí)驗(yàn)性纖維化的荷瘤小鼠的肺髓系室進(jìn)行了評(píng)估。在KPL GEMMs和LLC原位模型的肺腫瘤中，作者發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性纖維化增加了總巨噬細(xì)胞和CD206+巨噬細(xì)胞的數(shù)量，但沒(méi)有改變Ly6G+中性粒細(xì)胞的數(shù)量(圖5A和B)。為了更好地表征這些巨噬細(xì)胞的定位，作者對(duì)F4/80進(jìn)行了免疫組化染色，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)性纖維化誘導(dǎo)腫瘤巢和周?chē)螌?shí)質(zhì)中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加(圖5C)。作者接下來(lái)進(jìn)行了CyTOF分析。與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致，作者觀察到間質(zhì)和肺泡巨噬細(xì)胞中CD206的表達(dá)增加(圖5D-F)。作者還觀察到，纖維化肺TME的兩個(gè)巨噬細(xì)胞亞群表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合體II (MHC-II)減少，但MHC-I和PD-L1增加，這表明表型被激活但可能被抑制(圖5E-F)。這些數(shù)據(jù)表明，纖維化肺TME不僅導(dǎo)致巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，而且改變其表型。接下來(lái)，作者通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)評(píng)估肺巨噬細(xì)胞 (圖5G)。這些亞群中轉(zhuǎn)錄變化最明顯的是肺泡巨噬細(xì)胞(圖5G)。與先前的數(shù)據(jù)一致，纖維化肺的肺泡巨噬細(xì)胞高度表達(dá)Mrc1 (CD206)和Arg1(精氨酸酶1。接下來(lái)，作者鑒定了差異表達(dá)基因(DEGs)并進(jìn)行了基因集富集分析(GSEA)。與停留在纖維化TME一致，作者觀察到來(lái)自bleo啟動(dòng)肺的肺泡巨噬細(xì)胞中整合素和SMAD2/3信號(hào)的增加。作者還發(fā)現(xiàn)纖維化肺的肺泡巨噬細(xì)胞Ccl3、Ccl4和Cxcl9表達(dá)降低，但Ccl5、Ccl6、Ccl9和Ccl17表達(dá)升高(圖5H)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明纖維化導(dǎo)致巨噬細(xì)胞表型的改變，從而影響細(xì)胞毒性T細(xì)胞、Treg和cDC的浸潤(rùn)和功能。由于傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)、CyTOF和scRNA-seq方法分析了整個(gè)肺，包括腫瘤和非腫瘤區(qū)域，作者接下來(lái)尋求特異性地詢(xún)問(wèn)腫瘤相互作用的巨噬細(xì)胞。為了解決這個(gè)問(wèn)題，作者使用表達(dá)可溶性mCherry (mCher+)的KPL86腫瘤細(xì)胞。該系統(tǒng)允許表征存在于腫瘤巢內(nèi)的細(xì)胞，這些細(xì)胞將從周?chē)h(huán)境中吸收mCher，而那些不存在于腫瘤巢中的細(xì)胞將保持mCher陰性(mCher -)(圖5I)。使用該系統(tǒng)，作者發(fā)現(xiàn)來(lái)自纖維化肺的腫瘤相互作用肺泡巨噬細(xì)胞的MHC-I、PD-L1、PD-L2和T細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)域-3 (Tim3)的表達(dá)增加(圖5I)。在mCher -肺泡巨噬細(xì)胞中未觀察到這些變化。總之，這些數(shù)據(jù)表明腫瘤相互作用巨噬細(xì)胞可能有助于T細(xì)胞功能障礙。接下來(lái)，作者試圖確定巨噬細(xì)胞亞群在纖維化加速腫瘤進(jìn)展中的作用。為了消耗肺泡巨噬細(xì)胞，作者采用氣管內(nèi)氯膦酸鈉脂質(zhì)體;為了消耗間質(zhì)巨噬細(xì)胞，作者采用腹腔內(nèi)抗集落刺激因子1 (CSF1)抗體(IP αCSF1)。作者觀察到，在氯膦酸鹽處理的小鼠中，肺泡巨噬細(xì)胞顯著(P = 0.0001)減少，但間質(zhì)巨噬細(xì)胞沒(méi)有減少，而IP αCSF1對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞沒(méi)有影響，但顯著(P < 0.00001)減少了間質(zhì)巨噬細(xì)胞的數(shù)量。導(dǎo)致纖維化肺中腫瘤負(fù)荷顯著(P = 0.01)減少，但在沒(méi)有實(shí)驗(yàn)性纖維化的情況下不影響腫瘤進(jìn)展(圖5J)。與腫瘤進(jìn)展的變化類(lèi)似，肺泡巨噬細(xì)胞的消耗恢復(fù)了CD8+ T細(xì)胞和Clec9a+ cDC浸潤(rùn)，與非纖維化肺相當(dāng)(圖5K和L)。這些數(shù)據(jù)表明，纖維化誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞的變化在驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展和抑制腫瘤免疫方面特別重要。鑒于cDC在啟動(dòng)抗腫瘤免疫應(yīng)答中的作用，作者進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行了表征。在KPL GEMMs中，作者觀察到Bleo誘導(dǎo)小鼠肺TME中CD103+ cDC1s和CD11b+ cDC2s的表達(dá)減少(圖5M)。CyTOF表征顯示MHC-I和MHC-II以及cDC1s中的共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)減少(圖5N)。作者也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的cDC2s變化。scRNA-seq分析顯示，來(lái)自纖維化肺的cDC1s中的toll樣受體、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、IL-12和CD40信號(hào)通路特征減少，這些細(xì)胞也表現(xiàn)出同種異體移植排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)減少。接下來(lái)，作者使用可溶性mCher系統(tǒng)表征了腫瘤相互作用和非腫瘤相互作用的cdc。作者發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性纖維化導(dǎo)致mCher+ cDC1上MHC-II、CD80和CD86的表達(dá)降低，而mCher - cDC1s上這些表達(dá)沒(méi)有變化(圖50)。免疫檢查點(diǎn)Tim3的表達(dá)增加，而參與抗原攝取的Tim4在纖維化肺腫瘤的mCher+ cDC1s上表達(dá)減少(圖50)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明纖維化會(huì)損害cDC1向TME的浸潤(rùn)，并可能損害肺腫瘤內(nèi)cDC1的功能。

圖5、反應(yīng)性纖維化改變骨髓反應(yīng)

6、成纖維細(xì)胞表型的改變有助于非小細(xì)胞肺癌的免疫抑制TME

       作者之前觀察到，與健康組織相比，非小細(xì)胞肺癌中CAF的數(shù)量增加。為了進(jìn)一步表征這些細(xì)胞，作者用流式細(xì)胞術(shù)分析了PBS或Bleo處理的小鼠肺，再次發(fā)現(xiàn)纖維化肺中CD45 - EpCAM - CD31 - CAFs數(shù)量增加(圖6A)。當(dāng)作者分析特異性CAFs的標(biāo)志物時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞活化蛋白α (FAP+)和CD90+ (Thy-1) CAFs在纖維化肺中增加(圖6B和C)。CD90+和FAP+ CAFs與NSCLC患者的生存率降低有關(guān)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，在這些肺癌相關(guān)纖維化模型中，總CAF增加，但CAF表型有一些特異性改變。最近，使用scRNA-seq更好地闡明了NSCLC中CAFs的異質(zhì)性。為了更好地了解纖維化腫瘤模型中CAFs的分子和功能異質(zhì)性，作者從經(jīng)過(guò)和未經(jīng)過(guò)Bleo處理的KPL GEMM荷瘤小鼠中分離了CD45 - EpCAM - CD31 -細(xì)胞，并進(jìn)行了scRNA測(cè)序。對(duì)CAFs進(jìn)行UMAP分析，發(fā)現(xiàn)10個(gè)簇均表達(dá)關(guān)鍵識(shí)別基因，如Col1a1。作者分析了這些標(biāo)記的10個(gè)集群，將它們分為三個(gè)不同的集群。在肺間充質(zhì)細(xì)胞中鑒定出表達(dá)acta2的[肌成纖維細(xì)胞(Myofib)]、表達(dá)col14a1的(Col14)和表達(dá)col13a1的(Col13)成纖維細(xì)胞(圖6D)。將pbs處理與bleo處理的腫瘤肺進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Col13+成纖維細(xì)胞和Myofib相對(duì)增加，Col14+成纖維細(xì)胞減少(圖6E)， Col13+成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)移(圖6F)。特定的成纖維細(xì)胞亞群可能在TME內(nèi)促進(jìn)免疫抑制中發(fā)揮作用。鑒于在誘導(dǎo)纖維化后在Col13成纖維細(xì)胞群體中觀察到的改變，作者將重點(diǎn)放在這一群體上，并詢(xún)問(wèn)它們是否表現(xiàn)出可能影響TME免疫組成的改變的趨化因子或細(xì)胞因子譜。差異基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，Ccl6、Cxcl12和Cxcl16在成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而這些細(xì)胞先前被認(rèn)為與bleo誘導(dǎo)的肺纖維化有關(guān)(圖6G)。作者還發(fā)現(xiàn)了幾種趨化因子的變化，表明纖維化誘導(dǎo)了免疫抑制微環(huán)境。例如，與觀察到的巨噬細(xì)胞和Treg的變化一致，作者注意到與骨髓細(xì)胞組織浸潤(rùn)(Ccl4和Ccl9)和Treg募集(Cxcl12)相關(guān)的趨化因子增加(圖6G)。Ccl19，一種cDC浸潤(rùn)的化學(xué)引誘劑，在從纖維化肺分離的Col13成纖維細(xì)胞中減少。參與細(xì)胞毒性T細(xì)胞募集的趨化因子，如Cxcl10在纖維化模型中減少，表明CAF的變化可能導(dǎo)致免疫抑制(圖6G)。接下來(lái)，作者試圖測(cè)試來(lái)自bleo誘導(dǎo)的纖維化肺的成纖維細(xì)胞是否可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，作者使用Transwell系統(tǒng)將來(lái)自對(duì)照或暴露于藍(lán)光下的肺的原代成纖維細(xì)胞與骨髓源性巨噬細(xì)胞(bmdm)共培養(yǎng)。作者發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，來(lái)自纖維化肺的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)Arg1、Mrc1 (CD206)和Il6的表達(dá)更高。這些數(shù)據(jù)表明，來(lái)自纖維化肺的活化成纖維細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞來(lái)促進(jìn)免疫抑制。為了在體內(nèi)測(cè)試活化的成纖維細(xì)胞的影響，作者使用了血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α+ (PDGFRα+)細(xì)胞的遺傳耗損，因?yàn)?span>PDGFRα+在Col13+和Col14+成纖維細(xì)胞中表達(dá)，但在α sma +成纖維細(xì)胞中不表達(dá)。將Pdgfratm1.1(cre/ERT2)(PDGFRα- creert2)小鼠與lox-stop-lox (LSL) -白喉毒素受體(DTR)小鼠雜交，可誘導(dǎo)DTR在PDGFRα+細(xì)胞上表達(dá)。連續(xù)5天服用他莫昔芬，然后單劑量白破毒素導(dǎo)致PDGFRα細(xì)胞的有效耗竭，而αSMA細(xì)胞沒(méi)有觀察到變化(圖6H和I)。在耗竭PDGFRα+細(xì)胞(包括Col13+成纖維細(xì)胞)后，Bleo處理小鼠的腫瘤負(fù)荷明顯減輕(圖6J)。流式細(xì)胞術(shù)顯示肺泡巨噬細(xì)胞減少(圖6K)，瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞數(shù)量增加(圖6L)。這表明PDGFRα+成纖維細(xì)胞，包括Col13+成纖維細(xì)胞，在肺腫瘤纖維化的免疫浸潤(rùn)改變中發(fā)揮作用。與已知的bleo誘導(dǎo)的肺纖維化一致，過(guò)度代表分析發(fā)現(xiàn)，與pbs處理的Col13+成纖維細(xì)胞相比，bleo處理的TGFβ反應(yīng)途徑增加(圖5)。盡管幾乎所有的CAF亞群都有表達(dá)TGFβ應(yīng)答信號(hào)的細(xì)胞，但Col13+成纖維細(xì)胞有一個(gè)大的陽(yáng)性信號(hào)，這表明這是表達(dá)TGFβ的主要CAF亞群。作者通過(guò)免疫組化(IHC)證實(shí)bleo處理肺中tgf - β升高(圖5p)?？傊@些數(shù)據(jù)表明，除了推動(dòng)特定CAF亞群的增加外，纖維化還將其表型轉(zhuǎn)向更具免疫抑制性。

圖6、CAF的表型改變改變了纖維化TME中免疫細(xì)胞的募集，并增強(qiáng)了TGFβ的表達(dá)

7、靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體-1 (TGFβRI)信號(hào)僅在聯(lián)合化療時(shí)才能恢復(fù)免疫檢查點(diǎn)療效

       TGFβ在肺纖維化的發(fā)病機(jī)制中得到了很好的證實(shí)，作者證實(shí)，通過(guò)氣管內(nèi)遞送表達(dá)TGFβ1血清型6的腺相關(guān)病毒(AAV)， TGFβ在肺中的表達(dá)可以通過(guò)膠原沉積來(lái)誘導(dǎo)纖維化。此外，肺AAV-TGFβ1表達(dá)導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷和CD206巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，腫瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞減少與Bleo或fitc誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性纖維化模型相當(dāng)。接下來(lái)，作者試圖確定作者是否可以逆轉(zhuǎn)在作者的模型中觀察到的肺纖維化的致瘤表型。為此，作者評(píng)估了幾種目前用于治療人類(lèi)肺纖維化的藥物，包括尼達(dá)尼布和吡非尼酮。然而，在腫瘤相關(guān)纖維化建立后給予這些藥物，這些藥物未能改變膠原- 1沉積的數(shù)量(圖7A)。由于作者已經(jīng)觀察到Bleo暴露的成纖維細(xì)胞中TGFβ信號(hào)反應(yīng)增加，并且肺部TGFβ過(guò)表達(dá)重現(xiàn)了在Bleo或FITC治療的纖維化肺中觀察到的表型，因此作者試圖使用一種工具化合物TGFβRI抑制劑Ly364947靶向這一途徑。作者發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)纖維化后給予Ly364947，能夠大部分減少肺內(nèi)I型膠原的數(shù)量(圖7A)。此外，雖然纖維化顯著(P = 0.017)減少了CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量，但Ly364947治療使肺CD8+ T細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)到基線水平(圖7B)。相比之下，尼達(dá)尼布和吡非尼酮的CD8+ T細(xì)胞頻率與纖維化肺相似(圖7B)。與這一發(fā)現(xiàn)一致的是，與對(duì)照、尼達(dá)尼布或吡非尼酮處理的小鼠相比，Ly364947治療荷瘤小鼠對(duì)纖維化肺腫瘤負(fù)荷的影響不大(圖7C)。為了確定TGFβRI抑制劑Ly364947是否能夠與非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療協(xié)同作用，作者用以下治療方案治療纖維化、腫瘤肺小鼠:Ly364947單獨(dú)治療、Ly364947聯(lián)合抗PD-1免疫球蛋白G (IgG) (PD-1)、卡鉑+培美曲塞聯(lián)合PD-1 (Chemo/PD-1)或Chemo/PD-1 + Ly364947。單獨(dú)使用Ly364947治療可使腫瘤負(fù)荷略有下降(圖7D和E)。與對(duì)照相比，Ly364947與PD-1或Chemo聯(lián)合使用均未能改善腫瘤負(fù)荷(圖7D和E)。與對(duì)照組相比，Chemo/PD-1顯著(P = 0.0002)降低了腫瘤負(fù)荷(圖7D和E)。然而，將Chemo/PD-1與Ly364947聯(lián)合使用可將腫瘤負(fù)荷降低至接近基線(無(wú)纖維化)，并恢復(fù)腫瘤浸潤(rùn)的CD8+ T細(xì)胞，這表明添加Ly364947可增強(qiáng)Chemo/PD-1的療效(圖7D和E)，這是非小細(xì)胞肺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。作者只觀察到在實(shí)驗(yàn)性纖維化存在的情況下，將TGFβ r1抑制加入Chemo/PD-1對(duì)腫瘤負(fù)荷和CD8+ T細(xì)胞和cle9α + cDC1浸潤(rùn)的益處，這表明在沒(méi)有纖維化相關(guān)的TGFβ的情況下，信號(hào)傳導(dǎo)可能沒(méi)有達(dá)到臨界閾值(圖7F至H)。為了探索這些發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)樣本中的實(shí)用性，作者分析了POPLAR和OAK臨床試驗(yàn)中使用atezolizumab治療轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的數(shù)據(jù)。作者發(fā)現(xiàn)，在Col13+ CAFs中觀察到的TGFβ反應(yīng)特征與這些患者的總生存率提高相關(guān)(圖7I)。此外，來(lái)自Col13 CAFs的前50個(gè)基因的基因標(biāo)記與M2巨噬細(xì)胞增加(圖7J)、M1巨噬細(xì)胞減少(圖7K)、樹(shù)突狀細(xì)胞活化(圖7L)和CD8+ T細(xì)胞相關(guān)?？傊@些數(shù)據(jù)表明，這些TME元素在接受免疫檢查點(diǎn)阻斷的患者中可能是重要的。

圖7、靶向TGFβRI信號(hào)通路可提高化療聯(lián)合檢查點(diǎn)阻斷的療效。

結(jié)論

       總之，這些數(shù)據(jù)表明，在非小細(xì)胞肺癌中，纖維化通過(guò)降低抗腫瘤免疫導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。纖維化誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的改變，從而損害樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞反應(yīng)，最終降低了最佳檢查點(diǎn)治療效果所必需的抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，針對(duì)這種纖維化TME的治療策略可以改善人類(lèi)NSCLC對(duì)化療和免疫治療的反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)方法

       流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)、單細(xì)胞測(cè)序、IHC

參考文獻(xiàn)

       Herzog BH, Baer JM, Borcherding N, Kingston NL, Belle JI, Knolhoff BL, Hogg GD, Ahmad F, Kang LI, Petrone J, Lin CY, Govindan R, DeNardo DG. Tumor-associated fibrosis impairs immune surveillance and response to immune checkpoint blockade in non-small cell lung cancer. Sci Transl Med. 2023 Jun 7;15(699):eadh8005. doi: 10.1126/scitranslmed.adh8005. Epub 2023 Jun 7. PMID: 37285399.