ELF5通過(guò)穩(wěn)定腎細(xì)胞癌中的WDTC1來(lái)抑制血管生成

        膳食來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)素通過(guò)提供能量和生物合成構(gòu)件以及作為調(diào)節(jié)分子發(fā)揮作用，與人體生理有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。然而，人體循環(huán)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)影響特定生理過(guò)程的機(jī)制仍不清楚。在這里，作者使用基于血液營(yíng)養(yǎng)素化合物庫(kù)的篩選方法來(lái)證明膳食十八碳烯酸（TVA）在體內(nèi)直接促進(jìn)效應(yīng)CD8+T細(xì)胞功能和抗腫瘤免疫。TVA是母乳中富集的反式脂肪酸的主要形式，但人體不能內(nèi)源性產(chǎn)生TVA。人類(lèi)循環(huán)中的TVA主要來(lái)自反芻動(dòng)物來(lái)源的食物，包括牛肉、羊肉和牛奶、黃油等乳制品，但人類(lèi)或小鼠分別只有19%或12%的膳食TVA被轉(zhuǎn)化為魯美尼克酸。在機(jī)制上，TVA使細(xì)胞表面受體GPR43失活，GPR43是一種被其短鏈脂肪酸配體激活的免疫調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體。因此，TVA拮抗GPR43的短鏈脂肪酸激動(dòng)劑，導(dǎo)致cAMP-PKA-CREB軸的激活，從而增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞功能。這些發(fā)現(xiàn)表明，與宿主內(nèi)腸道微生物群來(lái)源的短鏈脂肪酸不同，飲食來(lái)源的TVA代表了一種宿主-外源性CD8+ T細(xì)胞重編程的機(jī)制。因此，TVA在腫瘤治療中具有轉(zhuǎn)化潛能。本文于2023年11月發(fā)表于《Nature》，IF: 64.8；Q1。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、增強(qiáng)T細(xì)胞功能的營(yíng)養(yǎng)素

        作者利用初始篩選（1a）確定了增強(qiáng)由CD3和CD28抗體（抗CD3/CD28）刺激的Jurkat T細(xì)胞活化的營(yíng)養(yǎng)素（圖1a，頂部）。使用Screen 1b篩選可挽救表達(dá)PD - L1的人H596肺癌細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)PD-1的Jurkat T細(xì)胞PD-L1-PD-1依賴性耗竭的營(yíng)養(yǎng)素（圖1a，底部）。TVA排在首位，并進(jìn)一步證實(shí)其可以增強(qiáng)小鼠和人類(lèi)原代T細(xì)胞的IL-2產(chǎn)生，并挽救共培養(yǎng)表達(dá)PD - L1的人類(lèi)癌細(xì)胞誘導(dǎo)的Jurkat T細(xì)胞的PD - L1 - PD -1依賴性耗竭。

2、膳食TVA增強(qiáng)抗腫瘤免疫

作者發(fā)現(xiàn)TVA通過(guò)T細(xì)胞發(fā)揮作用。此外，與喂食對(duì)照飲食的小鼠相比，在喂食富含TVA飲食的同系小鼠中，免疫原性B16F10細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)潛力顯著減弱（圖1b，頂部）。相比之下，喂食富含CVA的飼料或?qū)φ诊暳系膶?duì)照組B16F10細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)潛力沒(méi)有差異（圖1b，底部）。數(shù)據(jù)表明TVA通過(guò)調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞來(lái)促進(jìn)抗腫瘤免疫。

3、TVA增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞功能

        流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，TVA飲食導(dǎo)致腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）中的CD8+T細(xì)胞群增加，而對(duì)照CVA飲食沒(méi)有這一結(jié)果。相比之下，TILs中的CD4+ T細(xì)胞群未發(fā)生改變（圖1d）。

        TVA飲食導(dǎo)致B16F10腫瘤和dLNs中浸潤(rùn)的CD45+白細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞的百分比較高，但脾臟中未出現(xiàn)這一情況（圖1e）。耗竭標(biāo)志物PD-1（圖1f）的表達(dá)水平降低，膳食TVA減少了腫瘤和脾臟中CD8+T細(xì)胞的耗竭，但在dLNs中無(wú)此作用。對(duì)具有其他代表性標(biāo)記的腫瘤浸潤(rùn)CD8+ T細(xì)胞的進(jìn)一步分析表明，膳食TVA促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞功能，增加細(xì)胞因子水平，包括TNF（圖1g），增殖標(biāo)志物Ki-67，共刺激受體ICOS和細(xì)胞溶解分子GZMB（圖1h），以及莖樣CD8+T細(xì)胞存活標(biāo)記TCF1（圖1i）?？傊?，這些結(jié)果表明，膳食TVA促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞的聚集和功能。

圖1 膳食TVA通過(guò)效應(yīng)物CD8+T細(xì)胞增強(qiáng)抗腫瘤免疫

4、TVA信號(hào)通過(guò)GPCR-CREB軸

        接下來(lái)，作者確定TVA是在細(xì)胞外還是細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。作者使用整合的時(shí)間機(jī)制研究來(lái)研究TVA對(duì)人類(lèi)或小鼠原代CD8+T細(xì)胞的影響，包括:（1）酮乙氧基輔助的單鏈DNA測(cè)序（KAS-seq）方法，通過(guò)捕獲全局轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)來(lái)確定TVA對(duì)細(xì)胞的初始（20分鐘- 2小時(shí)）效應(yīng);（2）磷酸化抗體芯片識(shí)別早期（40 min-24 h）細(xì)胞信號(hào)通路的變化;（3）RNA測(cè)序（RNA-seq）方法（24 h），用于全轉(zhuǎn)錄組分析。通過(guò)對(duì)基因組水平的KAS-seq結(jié)果進(jìn)行功能富集，發(fā)現(xiàn)TVA處理的CD8+T細(xì)胞中富集程度最高的基因體具有GPCR活性（圖2a）。與這一發(fā)現(xiàn)一致的是，早在TVA處理后40分鐘，作者就觀察到跨轉(zhuǎn)錄因子CREB（GPCRs的共同下游效應(yīng)因子）的磷酸化增加（圖2b）。

        值得注意的是，TVA處理增強(qiáng)了在效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞功能中富集的基因E2F（圖2c）的表達(dá)，與增強(qiáng)的CD8+T細(xì)胞功能和增殖相關(guān)。TVA處理還上調(diào)了Creb1（編碼CREB）以及Prkacb和Prkaca（分別編碼cAMP依賴性蛋白激酶A （PKA）的催化亞基α和β）的表達(dá)（圖2d）。綜上所述，這些結(jié)果表明TVA增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞功能是通過(guò)GPCR-CREB途徑介導(dǎo)的，正反饋增強(qiáng)PKA和CREB在基因水平的表達(dá)。

圖2 TVA通過(guò)GPCR-CREB軸具有調(diào)節(jié)功能

5、TVA的作用需要CREB

        作者使用CD8+T細(xì)胞和Creb1敲低對(duì)照細(xì)胞，在TVA存在或不存在的情況下，用非靶向?qū)φ眨?span>siNTC）短抑制RNA（siRNA）處理。主成分分析表明，在TVA存在和不存在的情況下，使用靶向Creb（siCreb1）的siRNA處理的細(xì)胞可被分組在一起，并與siNTC對(duì)照細(xì)胞組或使用TVA處理的對(duì)照細(xì)胞組分離（圖3a）。GSEA分析顯示，敲低CREB逆轉(zhuǎn)了與效應(yīng)性CD8+ T細(xì)胞功能和細(xì)胞增殖相關(guān)的TVA依賴的基因集上調(diào)，包括E2F（圖3b）。

        為了進(jìn)一步確定TVA - CREB的下游靶點(diǎn)，作者表征了僅在siNTC + TVA組與其他三個(gè)組相比上調(diào)或下調(diào)的基因（圖3c，左側(cè)）。共312個(gè)上調(diào)基因富集在11個(gè)GO類(lèi)別，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂、T細(xì)胞聚集、T細(xì)胞活化、T細(xì)胞差異分化和細(xì)胞因子產(chǎn)生（圖3c，右上）。相比之下，共有139個(gè)下調(diào)基因被富集在8個(gè)GO類(lèi)別中，包括凋亡和染色質(zhì)組織（圖3c，右下）。為了進(jìn)行功能驗(yàn)證，作者選擇了4個(gè)在細(xì)胞增殖和T細(xì)胞功能中至關(guān)重要的上調(diào)基因。這些基因包括Il18（與細(xì)胞增殖、T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生相關(guān)）、Ebi3（與細(xì)胞增殖和T細(xì)胞活化相關(guān)）、Tbx21（與T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生相關(guān)）和Ilf2（與細(xì)胞增殖、T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生相關(guān)）。作者還測(cè)試了Foxo4和Bcl6，它們是與凋亡相關(guān)的GO分類(lèi)中的關(guān)鍵基因。

        如圖3d所示，與siNTC處理的對(duì)照細(xì)胞相比，通過(guò)siCreb1敲低Creb1的表達(dá)有效地逆轉(zhuǎn)了TVA依賴的細(xì)胞數(shù)量和凋亡，以及CD8+T細(xì)胞中Ki-67、IL-2、TNF和IFNγ水平的變化。敲低Il18、Ebi3、Tbx21、Ilf2、Foxo4或Bcl6部分逆轉(zhuǎn)了TVA依賴性細(xì)胞數(shù)量的變化（圖3d，左）。Bcl6、Foxo4或Ebi3的敲低部分逆轉(zhuǎn)了CD8+T細(xì)胞凋亡群中的TVA依賴性變化，而Il18、Tbx21或Ilf2的敲低沒(méi)有這種作用（圖3d，中）。敲低Il18、Tbx21、Ilf2或Ebi3部分逆轉(zhuǎn)了Ki-67水平的TVA依賴性變化，而敲低Bcl6或Foxo4沒(méi)有這種作用（圖3d，右）?？傊@些結(jié)果確立了不同的CREB靶基因?qū)?span>CD8+T細(xì)胞中不同的TVA依賴變化的功能貢獻(xiàn)。

圖3 TVA對(duì)CD8+ T細(xì)胞的作用主要通過(guò)CREB及其靶基因集介導(dǎo)

6、TVA使結(jié)合SCFA的GPR43失活

        為了確定TVA的GPCR靶點(diǎn)，作者通過(guò)siRNA介導(dǎo)的敲低篩選了6個(gè)已知的脂肪酸結(jié)合GPCRs，其中，只有敲低GPR43才能消除原代小鼠CD8+T細(xì)胞中TVA增強(qiáng)的TNF水平（圖4a）。使用siRNA介導(dǎo)的GPR43敲低的OT-I T細(xì)胞和使用CRISPR-Cas9敲低GPR43的OT-I T細(xì)胞（圖4b）獲得了類(lèi)似結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，GPR43在CD8+T細(xì)胞活化中具有抑制作用，TVA可能減弱GPR43的功能。這可能部分解釋了活化的CD8+T細(xì)胞對(duì)TVA治療敏感的原因。

        接下來(lái)，作者對(duì)TVA進(jìn)行了構(gòu)效關(guān)系（SAR）研究。SAR研究的結(jié)果表明，雙鍵（1），酸基（2）和長(zhǎng)度至少16個(gè)碳（3,4,13,15和16）是維持TVA生物活性的關(guān)鍵。此外，將雙鍵的位置從C11-C12轉(zhuǎn)移到C9-C10（6），或添加一個(gè)C9-C10雙鍵（7），都會(huì)增強(qiáng)TVA的生物活性，表明C9-C10雙鍵可能是最適合TVA生物活性的雙鍵。對(duì)9、10、14和17的SAR結(jié)果也表明，末端鏈可以進(jìn)行修飾，得到的TVA衍生物保留了70-80%的生物活性。接下來(lái)，作者使用經(jīng)TVA探針3處理的小鼠CD8+T細(xì)胞進(jìn)行了光親和標(biāo)記研究。重氮嘧啶使之能夠共價(jià)光交聯(lián)到接觸蛋白殘基并且炔基使之能夠連接報(bào)告子（生物素）并探測(cè)TVA結(jié)合蛋白靶點(diǎn)。使用鏈親和素珠下拉的生物素標(biāo)記蛋白的蛋白質(zhì)印跡顯示TVA探針與GPR43之間的結(jié)合（圖4c）。

        作者接著發(fā)現(xiàn)，通過(guò)降低TNF（圖4d）水平評(píng)估，將醋酸SCFA濃度增加至20 mM可減弱CD8+T細(xì)胞活化。20 μM TVA有效地逆轉(zhuǎn)了這一讀數(shù)。相比之下，2 μM TVA足以逆轉(zhuǎn)20 mM醋酸鹽對(duì)CD8+T細(xì)胞的抑制（圖4e）。相反，20 μM TVA預(yù)處理增強(qiáng)的CD8+ T細(xì)胞活化不能被20 mM醋酸鹽逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，TVA可能通過(guò)拮抗GPR43的SCFA激動(dòng)劑結(jié)合并失活GPR43。

圖4 TVA使SCFA結(jié)合的GPR43失活

7、TVA活性的GPR43要求

        作者首先使用表達(dá)cas9的小鼠OT-I T細(xì)胞檢測(cè)過(guò)繼性細(xì)胞治療（ACT）小鼠模型。作者使用接種了表達(dá)同源抗原（B16-OVA）的小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞的同系小鼠作為OT-I T細(xì)胞的受體，以確定抗腫瘤免疫（圖4f，左）。使用對(duì)照單向?qū)?span>RNA（sgRNA）過(guò)繼轉(zhuǎn)移OT-I細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)降低，使用富含TVA的飲食進(jìn)一步降低了腫瘤生長(zhǎng)（圖4f，右）。相比之下，使用CRISPR - Cas9介導(dǎo)的Gpr43敲除過(guò)繼轉(zhuǎn)移OT-I細(xì)胞顯著降低了腫瘤生長(zhǎng)，而TVA飲食無(wú)法進(jìn)一步抑制腫瘤生長(zhǎng)（圖4f，右）。與這些發(fā)現(xiàn)一致，與對(duì)照OT-I細(xì)胞相比，采用CRISPR - Cas9介導(dǎo)的Creb1敲除的OT-I細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移導(dǎo)致小鼠的抗腫瘤效應(yīng)減弱，并且對(duì)TVA飲食無(wú)應(yīng)答（圖4f，右）。

        接下來(lái)，作者使用接種小鼠B16F10細(xì)胞的全身Gpr43敲除（Gpr43 - / -）小鼠進(jìn)行同系小鼠模型實(shí)驗(yàn)。作者發(fā)現(xiàn)Gpr43 - / -小鼠的GPR43缺乏（通過(guò)Gpr43 mRNA水平在CD8+和CD4+T細(xì)胞以及B細(xì)胞中得到證實(shí)）消除了在同窩對(duì)照小鼠中觀察到的TVA飲食依賴性腫瘤生長(zhǎng)減少（圖4g）。

        CD8+T細(xì)胞中Gpr43的條件性敲除消除了在同窩對(duì)照小鼠中觀察到的TVA飲食依賴性腫瘤生長(zhǎng)的減少。綜上所述，這些結(jié)果表明TVA需要CD8+T細(xì)胞中的GPR43來(lái)增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的功能，從而在體內(nèi)產(chǎn)生抗腫瘤免疫。

8、TVA拮抗SCFAs對(duì)cAMP的作用

        培養(yǎng)液中的SCFAs激活CD8+ T細(xì)胞中的GPR43，并使其易于發(fā)生TVA介導(dǎo)的失活。因此，作者比較了TVA和SCFAs對(duì)CD8+T細(xì)胞cAMP信號(hào)傳導(dǎo)的相反作用。作者首先研究了SCFAs是否通過(guò)GPR41和GPR43以及pH感應(yīng)器GPR65抑制CD8+ T細(xì)胞活性，因?yàn)榕cTVA等長(zhǎng)鏈脂肪酸不同，SCFAs可溶于水并降低管腔pH。GPR65可被低pH激活，并通過(guò)Gαs發(fā)出信號(hào)，增加cAMP的產(chǎn)生以及隨后CREB的磷酸化和激活。CD8+ T細(xì)胞活性的增加可被SCFA部分抑制。相比之下，敲低GPR65導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞活性下降，而SCFA進(jìn)一步降低，而敲低GPR41, GPR43和GPR65則完全消除了SCFA對(duì)CD8+T細(xì)胞的作用。相比之下，TVA在兩種檢測(cè)中均顯示出最小的影響?？傊?span>SCFAs抑制總體CD8+ T細(xì)胞活性，即GPR41和GPR43介導(dǎo)的cAMP負(fù)性調(diào)節(jié)可拮抗GPR65對(duì)cAMP水平的積極作用。

        相比之下，作者發(fā)現(xiàn)TVA飲食不會(huì)改變來(lái)自對(duì)照或TVA飲食喂養(yǎng)的小鼠的血清和TIF樣本中的pH，并且在來(lái)自具有不同TVA血清水平的一組淋巴瘤患者的人類(lèi)初級(jí)血清樣本中沒(méi)有檢測(cè)到pH的顯著差異（詳細(xì)描述見(jiàn)圖5d）。最后，在使用表達(dá)Cas9的OT-I T細(xì)胞的ACT小鼠模型中，CRISPR - Cas9介導(dǎo)的Gpr65敲除導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)下降，然而，TVA飲食進(jìn)一步降低了腫瘤生長(zhǎng)（注意到前4個(gè)對(duì)照組來(lái)自圖4f中描述的相同實(shí)驗(yàn)）。這些結(jié)果表明，在體外和體內(nèi)，TVA不會(huì)降低pH值，也不會(huì)通過(guò)GPR65發(fā)出信號(hào)來(lái)增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞功能，這支持作者的假設(shè)，即TVA使GPR43失活，并拮抗SCFAs對(duì)cAMP的總體負(fù)面影響。

9、TVA可增強(qiáng)基于T細(xì)胞的療法

        膳食TVA聯(lián)合抗PD -1抗體（免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的代表）顯示出對(duì)B16F10腫瘤生長(zhǎng)的協(xié)同抑制作用（圖5a）。作者接下來(lái)測(cè)試了TVA對(duì)博納吐單抗（blinatumomab）療效的影響，博納吐單抗是一種靶向B細(xì)胞上的CD19和T細(xì)胞上的CD3的雙特異性T細(xì)胞銜接器。在博納吐單抗存在的情況下，TVA以劑量依賴性方式顯著增強(qiáng)了人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）對(duì)人B-ALL RS4;11細(xì)胞的體外殺傷效率（圖5b）。此外，TVA增加了來(lái)自3例42 ~ 47歲淋巴瘤患者原代T細(xì)胞的嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞的體外擴(kuò)增（圖5c）。值得注意的是，在一項(xiàng)回顧性臨床研究中，作者發(fā)現(xiàn)，對(duì)CAR-T細(xì)胞療法有應(yīng)答的淋巴瘤淋巴瘤患者組的血清TVA水平高于對(duì)CAR-T細(xì)胞療法無(wú)應(yīng)答的患者組（圖5d）。這些發(fā)現(xiàn)與以下觀點(diǎn)一致:通過(guò)膳食攝入TVA可能提高對(duì)T細(xì)胞免疫療法的臨床應(yīng)答。

圖5 TVA增強(qiáng)了多種基于T細(xì)胞的抗癌療法的有效性

結(jié)論：

        作者的研究結(jié)果揭示了人類(lèi)飲食進(jìn)化過(guò)程中的一種機(jī)制，即生物體外的TVA通過(guò)外源性調(diào)節(jié)重新編程CD8+T細(xì)胞，從而使GPR43失活，這與作為GPR43激動(dòng)劑的腸道微生物群來(lái)源的生物體內(nèi)SCFAs不同。TVA具有很高的轉(zhuǎn)化潛力，可以作為一種膳食元素，改善多種抗腫瘤療法的臨床療效，如免疫檢查點(diǎn)抑制劑，T細(xì)胞銜接器，CAR-T和T細(xì)胞受體T細(xì)胞療法。作者的研究支持補(bǔ)充TVA是一種比改變飲食更有針對(duì)性和有效的方式，有利于抗腫瘤免疫。GPR43-CREB機(jī)制可能對(duì)CD8+T細(xì)胞具有細(xì)胞類(lèi)型特異性。最后，由于TVA與SCFAs相比體積較大，可能結(jié)合到一個(gè)不同的位點(diǎn)并作為負(fù)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用。需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明TVA使GPR43失活的潛在結(jié)構(gòu)和分子機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)方法：

        PD-1+ Jurkat T細(xì)胞系構(gòu)建；循環(huán)營(yíng)養(yǎng)庫(kù)篩選；小鼠腫瘤模型；飲食方案；抗體介導(dǎo)的T細(xì)胞耗竭；分泌細(xì)胞因子水平；Pmel-1殺傷實(shí)驗(yàn)；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)；核磁共振法提取和定量TVA水平；CD45+腫瘤浸潤(rùn)性白細(xì)胞分離；小鼠TIL分離；小鼠脾淋巴細(xì)胞分離；小鼠dLNs淋巴細(xì)胞分離；主要CD8+或CD4+T細(xì)胞分離和激活；流式細(xì)胞術(shù)；抗體；微生物組16S測(cè)序；[13C1]氣相色譜-質(zhì)譜法分析TVA代謝通量；細(xì)胞培養(yǎng)處理；KAS-seq和數(shù)據(jù)分析；實(shí)時(shí)定量PCR；RNA介導(dǎo)的細(xì)胞siRNA干擾；RNA測(cè)序；[13C]脂肪酸的體外示蹤；海馬脂肪酸氧化試驗(yàn)；小鼠OT-I細(xì)胞的CRISPR編輯；Pull-down試驗(yàn)鑒定交聯(lián)蛋白-TVA復(fù)合物；與Blinatumomab共培養(yǎng)試驗(yàn)；CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增試驗(yàn)。

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