在帕金森病小鼠模型中敲除或抑制USP30 可保護多巴胺能神經(jīng)元

        編碼α-突觸核蛋白（αSyn）的基因SNCA突變可導(dǎo)致家族性帕金森?。?span>PD），而αSyn異常是特發(fā)性帕金森病的關(guān)鍵病理標志。α-突觸核蛋白病變可導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)變性。PARKIN和PINK1在常染色體隱性PD中突變，通過誘導(dǎo)線粒體蛋白泛素化來調(diào)節(jié)功能失調(diào)線粒體的優(yōu)先自噬清除（“線粒體自噬”），這一過程通過USP30被去泛素化抵消。本研究表明，USP30基因敲除小鼠的USP30缺失可以保護行為缺陷，并導(dǎo)致有絲分裂增加，磷酸化-s129 αSyn減少，αSyn誘導(dǎo)的SN多巴胺能神經(jīng)元損失減弱。這些觀察結(jié)果用一種有效的、選擇性的、腦滲透的USP30抑制劑MTX115325進行了概括，該抑制劑具有良好的藥物樣特性。這些數(shù)據(jù)有力地支持了USP30抑制作為PD潛在的疾病改善療法的進一步研究。

        USP30被提出調(diào)節(jié)線粒體自噬，這是帕金森病的一個相關(guān)機制。在這里，作者表明USP30基因敲除小鼠和USP30抑制劑如MTX115325在帕金森病的αSyn小鼠模型中表現(xiàn)出神經(jīng)保護反應(yīng)。該文章與2023年11月發(fā)表在《Nature Communications》，IF：16.6。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. USP30KO小鼠存活，無明顯病理

        為了在小鼠中產(chǎn)生USP30 KO，作者將USP30必需外顯子4與loxP位點（條件準備等位基因）連接，然后使用CRE重組酶（構(gòu)成等位基因）將其刪除，以產(chǎn)生USP30 KO小鼠（圖1a）。在腦、腎、心臟、骨骼肌、脾臟、肝臟、胰腺和睪丸中缺失USP30 mRNA證實了USP30基因的成功缺失（圖1b）。此外，USP30 KO小鼠的皮質(zhì)中未檢測到USP30蛋白（圖1c）。正如先前報道的那樣，USP30 KO小鼠以預(yù)期的孟德爾頻率出生（圖1d）。為了了解USP30的丟失是否會導(dǎo)致隨年齡增長的病理，作者建立了一個衰老隊列，并表明與野生型（WT）同儕對照相比，USP30的丟失沒有可檢測到的有害影響（圖1e）。綜合來看，這些數(shù)據(jù)顯示USP30缺失對小鼠沒有不利影響。

        為了驗證USP30缺失會影響多巴胺能神經(jīng)元線粒體自噬的假設(shè)，作者將USP30 KO小鼠與mito-QC報告小鼠雜交，后者具有GFP-mCherry串聯(lián)融合到源自蛋白FIS146的線粒體定位信號。這使得在體內(nèi)測量有絲分裂成為可能，因為在有絲分裂過程中，GFP信號在溶酶體的酸性環(huán)境中被淬滅。因此，沒有綠色GFP信號的紅色mCherry斑點反映了線粒體在有絲分裂降解過程中與溶酶體融合（圖1f）。為了了解USP30缺失是否會影響線粒體清除，作者在16周齡時量化了mitto - qc / USP30 KO小鼠多巴胺能神經(jīng)元中的線粒體自噬信號，并與mitto - qc WT幼崽進行了比較。在這種情況下，在單個SN多巴胺能神經(jīng)元（圖1g），作者量化了與溶酶體標記（LAMP1，綠色；圖1f中左面板）代表有絲分裂體與溶酶體融合。作者發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，USP30 KO小鼠多巴胺能神經(jīng)元中的mCherry斑點顯著特異性增加（圖1 h）綜上所述，作者的結(jié)果表明，虧損USP30老鼠增加基底的mitophagy SNpc DA神經(jīng)元，大腦皮層神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元，而不是肌肉。

圖1 Usp30 KO小鼠的產(chǎn)生與表征

2. USP30 KO可減輕AAV-A53T-SNCA小鼠模型中的多巴胺能神經(jīng)元損失

        為了驗證USP30 KO小鼠DA神經(jīng)元的自噬增強是否與DA神經(jīng)元免受αSyn毒性的保護有關(guān)，作者使用了經(jīng)過驗證的AAV1/2-A53T-SNCA αSyn過表達PD小鼠模型，該模型在大鼠、小鼠和非人靈長類動物模型中顯示多巴胺能神經(jīng)變性和運動障礙。首先，為了確定αSyn的誘導(dǎo)是否影響線粒體自噬，作者測量了同側(cè)（注射AAV-A53T-SNCA）SNpc內(nèi)的線粒體自噬情況，并與對側(cè)（未注射；NI），分娩后28周。USP30 KO小鼠對側(cè)和同側(cè)SNpc DA神經(jīng)元的線粒體自噬點均顯著增加。為了確定USP30缺失是否能保護USP30 KO小鼠免受αSyn誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元缺失，作者在注射后28周對同側(cè)（注射AAV-A53T-SNCA）SNpc內(nèi)與對側(cè)（NI）部位進行了TH+神經(jīng)元計數(shù)（圖2a）。上述結(jié)果表明，USP30缺失可顯著減輕αSyn過表達引起的DA神經(jīng)元缺失（圖2b）與WT對照組相比（圖2b）或mito-QC小鼠（圖2 b）。因此，USP30缺失可防止αSyn誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元損失。

圖2 在α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的PD小鼠模型中，Usp30 KO可改善DN神經(jīng)元的存活，降低病理性αSyn，并防止運動缺陷

3. USP30 KO抑制αSyn病理和相關(guān)運動缺陷的發(fā)展

        為了確定注射AAV-A53T-SNCA的USP30 KO小鼠的線粒體自噬上調(diào)是否與αSyn病理降低有關(guān)，作者用抗磷S129-αSyn對SNpc進行了免疫染色，這是一種在Lewy小體中發(fā)現(xiàn)的αSyn的病理形式。相比之下，注射AAV-A53T-SNCA的WT小鼠同側(cè)SNpc有較強的磷酸化-s129-αSyn熒光免疫染色（圖2c，d）與注射AAV-Ev小鼠相比，mito-QC AAV-A53T-SNCA小鼠（圖2c，d）。值得注意的是，注射AAV-A53T-SNCA的小鼠多巴胺能神經(jīng)元中磷酸化- s129 αSyn的強度在mito-QC/USP30 KO小鼠中顯著降低（圖2c， d）。

4. USP30 KO對α syn誘導(dǎo)的運動缺陷有保護作用

        為了評估注射AAV-A53T-SNCA后28周多巴胺能神經(jīng)元的損失是否與運動缺陷有關(guān)，并評估USP30 KO對運動功能的影響，作者在圓柱試驗中測量了前肢的不對稱使用，這對不對稱多巴胺缺陷很敏感。單側(cè)注射AAV-Ev不影響所有三個實驗組（WT、mito-QC和mito-QC/USP30 KO）的雌雄小鼠的運動功能；圖2f），從而排除了來自病毒或立體定向注射劑本身的任何非特異性作用。相反，在WT和mito-QC小鼠中單側(cè)注射AAV-A53T-SNCA誘導(dǎo)運動功能障礙，表現(xiàn)為注射對側(cè)前肢較少使用（與使用同側(cè)前肢相比）（圖2e）。值得注意的是，USP30 KO對雌性和雄性mitto - qc /USP30 KO小鼠α syn誘導(dǎo)的運動缺陷均有顯著保護作用（圖2e）。這些結(jié)果表明，USP30 KO可以緩解α syn誘導(dǎo)的運動缺陷。

圖3 在α-突觸核蛋白為基礎(chǔ)的小鼠模型中，Usp30 KO可防止紋狀體TH+多巴胺能纖維的丟失，并保留多巴胺及其代謝物

5. USP30 KO可防止α syn誘導(dǎo)的紋狀體多巴胺和TH+終端的丟失

        為了測試USP30 KO對α syn誘導(dǎo)的DA神經(jīng)突向紋狀體的損失的影響，作者測量了腦切片紋狀體中TH+終端的密度（圖3a）。兩種WT小鼠TH+纖維的相對光密度均顯著降低（圖3b）和mito-QC小鼠，但在USP30 KO小鼠注射AAV-A53T-SNCA后沒有顯著變化（圖3b）。

        通過TH染色，作者還觀察到紋狀體和SNpc的TH強度與WT和USP30 KO不同，即使在未注射側(cè)也是如此。為了理解其中的原因，作者量化了注射AAV-A53T-SNCA或在同側(cè)注射aav -空載體（Ev）的小鼠TH光密度與NI對側(cè)的關(guān)系。這些數(shù)據(jù)表明，在注射AAV-A53T-SNCA的小鼠中，TH染色強度不僅在同側(cè)受到影響，而且在對側(cè)也受到影響（圖3a，b）。在大鼠PD模型中，單側(cè)注射AAV載體在SN中過表達αSyn后，雙側(cè)紋狀體TH+末端受到影響。因此，USP30 KO小鼠的TH染色可能不會直接升高，相反，USP30 KO可以防止發(fā)生在同側(cè)和對側(cè)的異步誘導(dǎo)的TH損失。這一觀察結(jié)果并沒有改變作者的整體數(shù)據(jù)解釋，因為在作者的分析中，作者比較了小鼠內(nèi)效應(yīng)（同側(cè)與對側(cè)）。

        作者進一步分析了雌性和雄性小鼠同側(cè)紋狀體中多巴胺及其代謝產(chǎn)物的分子水平。在注射AAV-Ev的小鼠中，多巴胺及其代謝物，包括3，4-二羥基苯基乙酸（DOPAC）、3-甲氧基酪胺（3- mt）和同型香草酸（HVA）的水平在不同基因型中是相似的（圖3 c-f）。注射AAV-A53T-SNCA引起WT和mito-QC小鼠多巴胺消耗（圖3c），但在USP30 KO小鼠中沒有（圖3c）。此外，USP30 KO可以阻止多巴胺代謝物HVA （圖3e）和3-MT （圖3f）的下降，而DOPAC的下降趨勢不顯著（圖3d）。這些結(jié)果表明，USP30 KO在以αSyn為基礎(chǔ)的PD小鼠模型中可保護TH+紋狀體終末的喪失和紋狀體多巴胺的喪失。

6. 腦滲透USP30抑制劑MTX115325的驗證

        MTX115325是Mission Therapeutics公司開發(fā)的USP30抑制劑（USP30i），具有良好的口服生物利用度和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）穿透性（圖4）。MTX115325（圖4a）在生化熒光偏振分析中抑制USP30，IC50為12 nM，并在細胞中阻斷泛素樣探針進入酶活性位點，IC50為25 nM。在過表達PARKIN并受到線粒體毒素antiycin a和oligomycin a（A/O）攻擊的人HeLa細胞系中，MTX115325增加了線粒體外膜蛋白TOM20（USP30底物）的泛素化，具有代表性的TOM20-UB濃度響應(yīng)曲線如圖4b所示。為了進一步研究MTX115325在體外對人多巴胺能神經(jīng)元的藥理作用，作者檢測了IPSC衍生的多巴胺能神經(jīng)元在10 nM、100 nM或1μM無任何外源刺激的情況下，在不存在或存在MTX115325的情況下，TOM20和TOM20泛素化的差異。為了評估對DUB和其他半胱氨酸蛋白酶的選擇性，USP30i MTX115325在生化試驗中對54種DUB和5種組織蛋白酶進行了篩選。作者證實，USP30i MTX115325抑制小鼠USP30的IC50為13 nM，顯示出人和小鼠酶之間的等效效力。USP30i MTX115325在單次10 mg/kg劑量后的全血和前額皮質(zhì)透析液中的時間濃度曲線，顯示了兩種組織曲線的緊密關(guān)系（圖4c），以及前額皮質(zhì)游離CMax為528 nM（在60分鐘時間點）。小鼠探索性毒理學(xué)研究表明，MTX115325耐受性良好，在劑量水平高達300 mg/kg/天的兩周后，無不良臨床觀察或病理發(fā)現(xiàn)。在穩(wěn)定表達mito-QC的SH-SY5Y細胞中，MTX115325與ETC復(fù)合物III和V的亞最大抑制（0.1 mM a /O）聯(lián)合孵育72小時，產(chǎn)生了濃度依賴性的線粒體自噬增加（圖4e）。MTX115325在37 nM時使線粒體自噬增加22%，在1μM時與基線相比最大增加54%（圖4f）。這些數(shù)據(jù)表明，MTX115325對USP30的抑制具有高度選擇性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)滲透性和良好的耐受性，并且MTX115325在體外驅(qū)動成神經(jīng)細胞瘤細胞系和IPSC來源的神經(jīng)元的線粒體質(zhì)量控制過程中，在存在和不存在外源刺激的情況下具有濃度依賴效應(yīng)。

7. 在AAV-A53T-SNCA小鼠模型中，USP30抑制劑MTX115325可防止多巴胺能神經(jīng)元丟失并保留紋狀體多巴胺

        為了測試USP30催化活性的抑制是否能再現(xiàn)USP30 KO小鼠對黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的保護作用，作者在與USP30 KO研究密切相關(guān)的AAV-A53T-SNCA PD小鼠模型中測試了USP30i MTX115325 （WO 2021/249909 A1）。小鼠單側(cè)立體定向注射編碼AAV-A53T-SNCA的AAV1/2，未對側(cè)注射（NI）后，每天兩次口服15 mg/kg或50 mg/kg MTX115325，治療10周后，取同側(cè)和對側(cè)紋狀體測定多巴胺和代代物，取SN測定TH+神經(jīng)元（僅50 mg/kg組）。例TH染色圖像如圖5a所示。與上述USP30 KO的作用一致，MTX115325抑制USP30可防止A53T αSyn誘導(dǎo)的TH+神經(jīng)元損失（圖5b）。以每只動物的對側(cè)NI半球為對照，MTX115325 （50 mg/kg BID）處理動物的同側(cè)TH+神經(jīng)元比例為61.7%，而MTX115325 （50 mg/kg BID）處理動物的同側(cè)TH+神經(jīng)元比例為89.08%，表明USP30的藥理抑制對αSyn誘導(dǎo)的神經(jīng)元損失有顯著保護作用。與這些對TH+神經(jīng)元的影響一致的是，與對側(cè)半球相比，MTX115325在50和15 mg/kg BID下，消除了同側(cè)半球多巴胺和多巴胺代謝物HVA和DOPAC的損失，也消除了處理組之間同側(cè)半球多巴胺和多巴胺代謝物HVA和DOPAC的損失（圖5c-e）。當使用標準化數(shù)據(jù)比較治療組間同側(cè)半球的水平時，盡管平均多巴胺/HVA/DOPC估計表明，與50 mg/kg BID相比，15 mg/kg BID的療效略弱，但它們不足以在該模型中明確建立MTX115325治療的劑量反應(yīng)效應(yīng)。

圖4 小分子USP30抑制劑MTX115325對USP30的抑制作用及藥代動力學(xué)驗證

        為了確認化合物暴露與研究中目標接觸的穩(wěn)定水平一致，在首次給藥后0.5、1、2、4和6小時，即研究結(jié)束前7天，測量了血液樣本中的MTX115325水平。MTX115325在15 mg/kg和50 mg/kg劑量下的血液Cmax分別為7546.9 ng/mL和16374.3 ng/mL，不同劑量下的暴露分別為13606 ng*h/mL和42959 ng*h/mL（圖4d）。在給藥方案持續(xù)時間內(nèi)，估計的腦游離藥物濃度將遠高于TOM20泛素化（TOM20- UB）測定的EC50，劑量為50 mg /kg。

        綜上所述，這些結(jié)果表明，MTX115325對USP30的抑制作用再現(xiàn)了USP30 KO在αSyn - PD小鼠模型中保護TH+神經(jīng)元丟失和紋狀體多巴胺丟失的作用。

圖5 在α-突觸核蛋白為基礎(chǔ)的PD小鼠模型中，MTX115325對USP30的藥理抑制可防止多巴胺能神經(jīng)元丟失和多巴胺耗損

結(jié)論：

        總之，作者使用了一種通過USP30缺失來上調(diào)線粒體自噬的策略，使用藥理學(xué)USP30抑制劑獲得了類似的結(jié)果。這些減少USP30的策略導(dǎo)致線粒體自噬增強和對αSyn毒性的有效保護。這項工作驗證了抑制USP30作為進一步測試PD潛在疾病改善作用的有希望的策略。

實驗方法：

        細胞培養(yǎng)、多巴胺能神經(jīng)元培養(yǎng)、腺相關(guān)載體（AAV） 1/2立體定向注射、MTX115325劑量和在生活中的血液采樣的化合物水平測量、行為評估、免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色、線粒體自噬點與共定位分析、Western blot分析、多巴胺和多巴胺代謝物的測定、USP30生化熒光偏振測定、細胞USP30泛素探針結(jié)合試驗、細胞TOM20泛素化試驗、小鼠藥代動力學(xué)及腦CETSA分析

參考文獻：

        Fang TZ, Sun Y, Pearce AC, Eleuteri S, Kemp M, Luckhurst CA, Williams R, Mills R, Almond S, Burzynski L, Márkus NM, Lelliott CJ, Karp NA, Adams DJ, Jackson SP, Zhao JF, Ganley IG, Thompson PW, Balmus G, Simon DK. Knockout or inhibition of USP30 protects dopaminergic neurons in a Parkinson's disease mouse model. Nat Commun. 2023 Nov 13;14(1):7295. doi: 10.1038/s41467-023-42876-1. PMID: 37957154; PMCID: PMC10643470.