一種與腫瘤相關(guān)的硫酸乙酰肝素相關(guān)糖胺聚糖促進(jìn)功能性Tregs細(xì)胞的產(chǎn)生

        功能性Tregs在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是抗癌免疫的主要障礙。 Tregs 在癌癥中的產(chǎn)生機(jī)制以及腫瘤微環(huán)境對(duì)這些過程的影響仍不完全清楚。在這里，作者通過使用核磁共振、化學(xué)酶結(jié)構(gòu)測(cè)定和大量的體外和體內(nèi)功能分析，證明腫瘤碳水化合物 A10 (Ca10) 是一種源自埃立克氏腫瘤 (ET) 細(xì)胞的細(xì)胞表面碳水化合物，是一種硫酸乙酰肝素相關(guān)蛋白多糖，可增強(qiáng)糖酵解并促進(jìn)人類樹突狀細(xì)胞（DCs）中耐受性特征的發(fā)展。Ca10 刺激的人類 DCs 通過部分依賴于代謝重編程、PD-L1、IL-10 和 IDO機(jī)制產(chǎn)生高度抑制性 Tregs。 Ca10 還可以將人類單核細(xì)胞重新編程為具有耐受性特征的DCs。在實(shí)體 ET 小鼠中，作者發(fā)現(xiàn) Ca10 血清水平、腫瘤大小和脾 Treg 數(shù)量之間呈正相關(guān)。給予分離的 Ca10 還可增加無腫瘤小鼠脾臟 Tregs 的比例。值得注意的是，作者提供的證據(jù)支持循環(huán)人類 Ca10 對(duì)應(yīng)物 (Ca10H) 的存在，并首次表明，與健康個(gè)體相比，患不同癌癥類型的患者血清 Ca10H 水平升高。值得注意的是，具有骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者的Ca10H水平高于沒有骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者?？偟膩碚f，該研究揭示了與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的硫酸乙酰肝素相關(guān)結(jié)構(gòu)促進(jìn)癌癥中功能性 Tregs 生成的新分子機(jī)制。這種新穎的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的發(fā)現(xiàn)可能開辟新的研究途徑，對(duì)癌癥治療具有重要的臨床意義。該研究于2023年11月發(fā)表在《Cellular & Molecular Immunology》，IF 24.1分。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1 血清Ca10水平與ET小鼠的腫瘤大小和脾臟Treg數(shù)量呈正相關(guān)

為評(píng)估循環(huán)Ca10水平、腫瘤大小和Treg生成之間的潛在關(guān)系，作者使用了攜帶固體ET的小鼠（圖1A）。在血清Ca10水平和腫瘤大小之間觀察到強(qiáng)烈的正相關(guān)性（圖1B）。脾臟FOXP3+ Tregs比例也與血清Ca10水平和腫瘤大小呈中度但顯著的正相關(guān)（圖1C）。由于不同攜帶ET的小鼠之間腫瘤大小的可變性，以246 mm3為臨界點(diǎn)（平均腫瘤大?。?，對(duì)攜帶大（>246 mm3）和小（<246 mm3）腫瘤的小鼠進(jìn)行分層。脾臟FOXP3+ Tregs的百分比在攜帶大腫瘤的小鼠中顯著高于攜帶小腫瘤的小鼠，無論腫瘤接種后經(jīng)過的時(shí)間如何，始終高于對(duì)照小鼠（圖1D）。在攜帶大腫瘤（>246 mm3）的小鼠中，在早期時(shí)間點(diǎn)（腫瘤接種后24天）發(fā)生的脾臟Tregs的百分比顯著高于在后期時(shí)間點(diǎn)（從接種ET細(xì)胞后48天起）達(dá)到該大小的大腫瘤（圖1E）。這些數(shù)據(jù)表明血清Ca10水平、脾臟Tregs的誘導(dǎo)和腫瘤進(jìn)展之間存在密切關(guān)系。為進(jìn)一步研究Ca10是否可能直接參與觀察到的Treg數(shù)量的增加，將分離的Ca10單獨(dú)或與mAb A10聯(lián)合給藥于C57BL/6J無腫瘤小鼠（圖1F）。值得注意的是，與對(duì)照小鼠相比，在給予Ca10的小鼠中脾臟FOXP3+ Tregs的百分比顯著更高，這是在Ca10給藥9天后觀察到的（圖1G）。值得注意的是，在這些實(shí)驗(yàn)中，觀察到血清Ca10水平與脾臟Tregs的百分比之間存在顯著的正相關(guān)性（圖1H）。Ca10與mAb A10聯(lián)合給藥以劑量依賴性方式顯著損害了由Ca10給藥誘導(dǎo)的脾臟Treg的產(chǎn)生，表明mAb A100完全阻斷了Ca10的Treg誘導(dǎo)能力（圖1I）。總之，這些結(jié)果表明，ET脫落的Ca10可能促進(jìn)Tregs的產(chǎn)生，而Tregs反過來可能有利于腫瘤的進(jìn)展。

圖1：攜帶埃立克氏腫瘤（ET）的小鼠中Tregs百分比增加

2 Ca10賦予人類DCs耐受性特征

        為進(jìn)一步探索Ca10促進(jìn)Treg生成的潛在能力的機(jī)制，作者首先研究了腫瘤相關(guān)碳水化合物調(diào)節(jié)人類DC表型和功能的能力。從健康供體的人血單核細(xì)胞分化的Ca10刺激DC（圖2A）顯著上調(diào)HLA-DR、CD86/CD83和耐受性標(biāo)志物PD-L1的表達(dá)（圖2B）。Ca10刺激的DC也比未刺激的細(xì)胞產(chǎn)生顯著更高水平的TNF-α、IL-6、IL-1β和抗炎細(xì)胞因子IL-10（圖2C）。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，Ca10以時(shí)間依賴性的方式快速增加促炎細(xì)胞因子的mRNA水平，在刺激24小時(shí)后降至幾乎基本水平（圖2D）。相反，IL-10的mRNA水平（圖2D）和致耐受分子PD-L1、IDO、SOCS1和SOCS3（圖2E）在刺激24小時(shí)后保持升高，表明Ca10可能賦予人DC耐受性特征。支持這些數(shù)據(jù)的是，阻斷IL-10顯著增強(qiáng)了促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生，而用IDO活性的選擇性抑制劑1-甲基色氨酸（1-MT）治療顯著降低了Ca10刺激的DC中IL-10的產(chǎn)生（圖2F）。阻斷IL-10或IDO也降低了Ca10刺激的DC中的PD-L1水平（圖2G），表明Ca10賦予的人類DC的耐受性特征部分依賴于IL-10和IDO誘導(dǎo)。

圖2：Ca10誘導(dǎo)耐受性人DC

3 Ca10激活免疫通路并增強(qiáng)人DCs的糖酵解

        為進(jìn)一步深入了解Ca10在人類DC中作用模式的分子機(jī)制，作者評(píng)估了其激活經(jīng)典免疫途徑和促進(jìn)代謝重組的能力。Ca10誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、p38和c-Jun N-末端激酶（JNK））和核因子-κB（NF-κB）的快速激活，這通過所測(cè)定的MAPKs和IκBα的磷酸化形式的增加來確定（圖3A）。ERK、p38和IκBα的總水平?jīng)]有變化，只觀察到JNK的總水平增加（圖3A）。支持這些數(shù)據(jù)的是，藥理學(xué)抑制劑U0126（對(duì)MEK 1/2特異性，ERK上游）、SB202190（對(duì)p38特異性）、SP600125（對(duì)JNK特異性）和BAY117082（對(duì)NF-κB特異性）顯著抑制了Ca10激活的人DC中IL-6和IL-10的產(chǎn)生（圖3B）。當(dāng)DC與EDTA（鈣的螯合劑）和piceatannol（脾臟酪氨酸激酶（Syk）抑制劑）預(yù)孵育時(shí)，由Ca10刺激誘導(dǎo)的IL-6和IL-10的產(chǎn)生顯著受損（圖3B）。這些抑制數(shù)據(jù)表明，盡管Ca10可能靶向人類DC中的其他受體，如Syk偶聯(lián)的C型凝集素受體（CLRs），但MAPKs和NF-κB的激活似乎是誘導(dǎo)細(xì)胞因子信號(hào)的主要驅(qū)動(dòng)因素。

        接下來，作者研究了Ca10促進(jìn)人類DC代謝重編程的能力。使用海馬生物分析儀進(jìn)行實(shí)時(shí)細(xì)胞外酸化率（ECAR）、線粒體耗氧率（OCR）和糖酵解質(zhì)子流出率（glycoPER）動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)。與未刺激的細(xì)胞相比，Ca10刺激的人DC中基礎(chǔ)糖酵解和補(bǔ)償糖酵解顯著增加（圖3C）。在Ca10刺激的DC和未刺激的DC之間，沒有觀察到基礎(chǔ)呼吸、最大呼吸、ATP產(chǎn)生耦合呼吸或備用呼吸能力的顯著變化。支持這些數(shù)據(jù)的是，與未刺激的細(xì)胞相比，Ca10顯著增加了培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗和DC的代謝率（圖3D）。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)上清中，Ca10激活的人DC顯示出比對(duì)照細(xì)胞顯著更高的瓦爾堡效應(yīng)和乳酸產(chǎn)生（圖3E和F）?？傊@些數(shù)據(jù)表明，Ca10在不影響人DC線粒體氧化磷酸化的情況下增強(qiáng)了糖酵解和乳酸發(fā)酵。為進(jìn)一步分析mTOR介導(dǎo)的信號(hào)通路和糖酵解對(duì)Ca10在人DC中發(fā)揮耐受特性的貢獻(xiàn)，作者進(jìn)行了抑制實(shí)驗(yàn)。在Ca10激活的DC中，雷帕霉素和2-脫氧葡萄糖（2-DG）對(duì)mTOR途徑的抑制顯著抑制了促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β以及IL-10的產(chǎn)生，而在2-DG存在的情況下，觀察到TNF-α的產(chǎn)生顯著增加（圖3G）。因此，mTOR和糖酵解的抑制顯著降低了Ca10誘導(dǎo)的人DC中PD-L1的表達(dá)水平（圖3H），表明mTOR介導(dǎo)的信號(hào)通路和糖酵代謝有助于Ca10賦予人DC的耐受特性。

圖3：Ca10在人DC中誘導(dǎo)MAPK和NF-κB信號(hào)通路和代謝重編程

4 Ca10刺激的耐受性人DCs通過部分依賴于代謝重編程、PD-L1、IL-10 和 IDO 機(jī)制產(chǎn)生功能性Tregs

        為確定Ca10是否真的可以產(chǎn)生具有極化功能性Treg能力的人類耐受性DC，作者用同種異體幼稚CD4+ T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（圖4A）。Ca10刺激的人DC產(chǎn)生的CD4+CD127-CD25highFOXP3+ Tregs的百分比顯著高于未刺激的對(duì)照DC（圖4B）。當(dāng)Ca10預(yù)先與阻斷mAb A10孵育時(shí)，由Ca10激活的DC誘導(dǎo)的Treg數(shù)量顯著減少（圖4C）。值得注意的是，Ca10刺激的DC誘導(dǎo)的Treg是具有功能性，因?yàn)榕c非Treg組相比，它們能夠以劑量依賴性的方式潛在地抑制自體外周血單核細(xì)胞（PBMCs）的增殖（圖4D，E）。支持這些發(fā)現(xiàn)的是，用Ca10刺激的含有漿細(xì)胞樣（pDC）和髓細(xì)胞樣（mDC）DC的人血液總DC的富集部分（圖4F）產(chǎn)生的CD4+CD127-CD25highFOXP3+ Tregs百分比也顯著高于未刺激的總DC（圖4G）。阻斷PD-L1、IL-10、IDO、mTOR和糖酵解顯著影響Ca10刺激的DC產(chǎn)生Tregs（圖4H），同時(shí)伴有IL-5和IL-10水平顯著降低（圖4I）。阻斷PD-L1、IL-10和IDO誘導(dǎo)了顯著更高水平的IFN-γ，特別是在PD-L1抑制后，其中mTOR和糖酵解的抑制顯著降低了IFN-γ的產(chǎn)生（圖4I）。

圖4：Ca10誘導(dǎo)的耐受性人樹突狀細(xì)胞促進(jìn)功能性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生

5 在Ca10存在下分化為DCs的人單核細(xì)胞產(chǎn)生具有促進(jìn)Tregs 能力的耐受性 DCs

        為分析Ca10是否可以重新編程單核細(xì)胞分化為DC，在存在或不存在Ca10的情況下，根據(jù)常規(guī)方案將從健康供體中純化的人單核細(xì)胞分化為DCs（圖5A）。與缺乏Ca10的傳統(tǒng)hmoDC相比，Ca10/hmoDC表達(dá)的HLA-DR、CD83、CD14以及耐受性標(biāo)志物PD-L1和ICOSL水平顯著更高（圖5B）。與傳統(tǒng)的hmoDC相比，Ca10/hmoDC顯示耐受基因PDL1、IDO、SOCS1和SOCS3的mRNA表達(dá)水平增加，表明存在耐受表型（圖5C）。LPS刺激后，Ca10/hmoDCs產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β以及抗炎細(xì)胞因子IL-10的濃度顯著降低（圖5D）。盡管Ca10/hmoDC產(chǎn)生的IL-10較低，但Ca10/hmo DC的TNF-α/IL-10、IL-6/IL-10和IL-1β/IL-10比率顯著低于hmo DC（圖5E）。這些結(jié)果表明，在分化過程中，Ca10可能賦予hmoDCs抗炎表型。使用海馬生物分析儀進(jìn)行的功能代謝實(shí)驗(yàn)顯示，與hmoDC相比，新分化的Ca10/hmoDC的基礎(chǔ)和最大呼吸、ATP產(chǎn)生耦合呼吸和備用呼吸能力顯著降低（圖5F），表明Ca10/hmo DC的線粒體OXPHOS活性較低。值得注意的是，Ca10/hmoDC產(chǎn)生的T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ濃度明顯低于傳統(tǒng)hmoDC引發(fā)的T細(xì)胞，而IL-5或IL-10的產(chǎn)生沒有差異（圖5G）。當(dāng)Ca10/hmoDCs產(chǎn)生T細(xì)胞時(shí)，IL-10/IFN-γ比率顯著高于傳統(tǒng)hmoDCs產(chǎn)生的T細(xì)胞，并且在IL-10/IL-5比率上沒有觀察到差異（圖5H）。Ca10/hmoDCs誘導(dǎo)的CD4+CD127-CD25highFOXP3+ Tregs的百分比明顯高于傳統(tǒng)的hmoDCs（圖5I）支持這些數(shù)據(jù)。總之，這些結(jié)果表明，Ca10還能夠重新編程單核細(xì)胞分化為具有抗炎和耐受特征的DC。

圖5：Ca10存在下分化為DC的單核細(xì)胞產(chǎn)生具有促進(jìn)Tregs能力的耐受性人DC

6 Ca10對(duì)人類Tregs的產(chǎn)生和擴(kuò)增沒有直接影響

        為評(píng)估Ca10通過直接作用T細(xì)胞來調(diào)節(jié)Treg產(chǎn)生的潛在能力，在存在或不存在Ca10的情況下，根據(jù)用于Treg生成的常規(guī)方案分化來自健康供體的純化幼稚CD4+ T細(xì)胞（圖6A）。在存在Ca10（Ca10/Tregs）的情況下，產(chǎn)生的CD4+CD127-CD25highFOXP3+ Tregs的百分比與根據(jù)Treg產(chǎn)生的常規(guī)分化方案在沒有Ca10的情況下獲得的百分比沒有顯示出顯著差異（圖6B）。當(dāng)比較兩種測(cè)定條件時(shí)，沒有觀察到細(xì)胞活力的差異（圖6B）。重要的是，這些生成的Ca10/Tregs和Tregs顯示出相似的功能抑制能力（圖6C）。接下來，為評(píng)估Ca10對(duì)已經(jīng)分化的Tregs擴(kuò)增的潛在直接影響，在先前產(chǎn)生的Tregs再擴(kuò)增過程中添加了Ca10（圖6D）。再擴(kuò)增7天后，CD4+CD127-CD25highFOXP3+ Tregs的百分比相似，細(xì)胞活力沒有差異（圖6E）。作者沒有觀察到在含有或不含有Ca10的擴(kuò)增Treg之間的功能抑制能力的顯著差異（圖6F）。總之，這些結(jié)果表明，在所測(cè)定的條件下，Ca10對(duì)Tregs的分化、活化和存活沒有直接影響。

圖6：Ca10對(duì)Treg生成和擴(kuò)增的直接影響

7 Ca10是一種硫酸乙酰肝素相關(guān)的糖胺聚糖，可誘導(dǎo)耐受性DCs和Tregs生成

        Ca10是一種高度糖基化的高分子量結(jié)構(gòu)，mAb A10識(shí)別的碳水化合物表位對(duì)NaIO4氧化敏感（圖7A），其特異性切割帶有未取代的羥基或氨基的相鄰碳之間的鍵。用NaIO4處理Ca10完全消除了mAb A10的反應(yīng)性，并導(dǎo)致碳水化合物組分的顯著降解，從而分子大小減小，如NMR擴(kuò)散有序光譜（DOSY）所觀察到的（圖7A）。為深入了解Ca10中所含的碳水化合物結(jié)構(gòu)，并考慮到Ca10糖類的NMR譜與糖胺聚糖（GAG）一致，作者使用了在不同位置切割聚糖的各種酶。外糖苷酶對(duì)Ca10沒有影響，也不影響PNGase-F或O-聚糖酶。在所有測(cè)試的酶中，Ca10僅被肝素酶類型的GAG裂解酶降解，表明Ca10的聚糖結(jié)構(gòu)是與硫酸乙酰肝素相關(guān)的GAG。用肝素酶II/III處理Ca10（HPSE處理）完全消除了mAb A10的反應(yīng)性（圖7B），并將碳水化合物組分水解成低分子量片段，如通過擴(kuò)散NMR觀察到的（圖7B）。同樣，所得到的二糖片段的主要成分在消化時(shí)的NMR圖譜與ΔUA-GlcNH2和ΔUA GlcHNHAc的圖譜相匹配，它們與形成硫酸乙酰肝素的二糖有關(guān)（圖7C），證實(shí)Ca10的主要碳水化合物部分是乙酰肝素型的GAG。支持這些數(shù)據(jù)的是，ET細(xì)胞在硫酸乙酰肝素生物合成的特異性抑制劑存在下的生長(zhǎng)顯示出比未處理的細(xì)胞顯著更低的Ca10表面表達(dá)和更低水平的可溶性Ca10（圖7D）。用NaIO4氧化Ca10（Ca10-OX）、肝素酶處理（HPSE處理）或肝素的存在消除了Ca10介導(dǎo)的IL-10的產(chǎn)生，并顯著損害了人DC中PD-L1的表達(dá)（圖7E，F）。類似地，當(dāng)DC先前用NaIO4氧化、用肝素酶處理或在肝素存在下時(shí)，Ca10刺激的DC產(chǎn)生的CD4+CD127-CD25highFOXP3+ Tregs顯著減少（圖7G）。總之，這些結(jié)果表明Tregs的產(chǎn)生是由位于Ca10的糖組分中的mAb A10識(shí)別表位的存在所介導(dǎo)。

圖7：Ca10碳水化合物結(jié)構(gòu)是硫酸乙酰肝素相關(guān)的糖胺聚糖，驅(qū)動(dòng)耐受性DC和Treg誘導(dǎo)

8 與健康對(duì)照組相比，不同腺癌患者的血清其人 Ca10 同源物 （Ca10H） 水平更高

        為評(píng)估癌癥患者和健康對(duì)照中血清人Ca10同源物（Ca10H）的水平，如材料和方法中所述，使用與用于測(cè)量小鼠Ca10水平相同的ELISA（圖8A）。對(duì)不同類型癌癥患者在疾病任何階段的血清進(jìn)行了檢測(cè)。如圖所示，與健康供體（n=131）相比，前列腺（n=248）、結(jié)直腸（n=66）或其他癌癥類型（n=71）患者的Ca10H水平顯著升高（圖8B）。為初步了解癌癥患者中Ca10H水平的潛在臨床相關(guān)性，測(cè)試了患有（n=42）或未患有（n=30）骨轉(zhuǎn)移的癌癥前列腺患者的不同血清樣本。如圖8C所示，有骨轉(zhuǎn)移的癌癥患者Ca10H水平高于無骨轉(zhuǎn)移的患者。支持這些數(shù)據(jù)的是，骨轉(zhuǎn)移患者的血清Ca10H水平與血清堿性磷酸酶水平相關(guān)，這是一種公認(rèn)的骨轉(zhuǎn)換生物標(biāo)志物（圖8D）。值得注意的是，用肝素酶處理前列腺癌癥患者的不同血清，但不使用唾液酸酶作為對(duì)照，完全消除了這些血清中的Ca10H水平（圖8E），驗(yàn)證了至少在前列腺癌癥患者血清中人Ca10H與鼠Ca10和硫酸乙酰肝素的關(guān)系。

圖8：癌癥患者血清中人Ca10同源物（Ca10H）的水平與健康對(duì)照組相比

結(jié)論：

         總之，本研究證明了腫瘤相關(guān)的硫酸乙酰肝素結(jié)構(gòu)參與了耐受性反應(yīng)的誘導(dǎo)，從而在腫瘤逃逸和進(jìn)展中發(fā)揮潛在作用。

實(shí)驗(yàn)方法：

         細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞遷移測(cè)定，細(xì)胞增殖測(cè)定，流式細(xì)胞術(shù)，RNA提取，RT-PCR，Western blot，Treg抑制試驗(yàn)，細(xì)胞因子定量，核磁共振實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)：

        Martín-Cruz L, Vi?uela M, Kalograiaki I, Angelina A, Oquist-Phillips P, Real-Arévalo I, Ca?ada FJ, Tudela JI, Moltó L, Moreno-Sierra J, Subiza JL, Palomares O. A tumor-associated heparan sulfate-related glycosaminoglycan promotes the generation of functional regulatory T cells. Cell Mol Immunol. 2023 Nov 22. doi: 10.1038/s41423-023-01096-9. Epub ahead of print. PMID: 37990034.