m6A去甲基化酶FTO通過MCM3介導(dǎo)的細胞周期進展和HIF-1α激活穩(wěn)定LINK-A發(fā)揮致癌作用

       食管癌是一種高度惡性的腫瘤，2020年在全球范圍內(nèi)發(fā)病率排名第七，死亡率排名第六。食管鱗狀細胞癌（ESCC）是食管癌最常見的組織學亞型，預(yù)后較差。化療是食管癌的一線治療，尤其是對于無手術(shù)指征的局部晚期食管癌患者。然而由于化療耐藥，食管癌患者的5年生存率不足20%。因此，探索關(guān)鍵的致癌驅(qū)動基因和闡明潛在的相關(guān)分子機制，以確定食管鱗癌有前景的治療靶點是值得的。N6-甲基腺苷（m6A）修飾是真核生物中最豐富的內(nèi)部RNA修飾，主要發(fā)生于mRNA。非編碼RNA（ncRNA）的m6A修飾也在包括癌癥發(fā)生在內(nèi)的各種生理和病理生物過程中發(fā)揮重要作用。新證據(jù)表明，m6A修飾可在不同情況下發(fā)揮致癌或腫瘤抑制作用。然而，在癌癥進展過程中，m6A修飾調(diào)控ncRNA的確切機制仍然非常模糊。缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）是一種氧感知轉(zhuǎn)錄因子。氧反應(yīng)性HIF-1α亞基和組成性表達的HIF-1β亞基相互作用形成異二聚體HIF-1轉(zhuǎn)錄因子，在細胞對低氧的應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。HIF-1α的積累以及HIF-1α介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和葡萄糖代謝限速酶的激活降低了氧化磷酸化的效率，促進了糖酵解。雖然有報道稱HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活可導(dǎo)致癌癥代謝重編程和治療抵抗，但lncRNA在食管鱗癌中調(diào)節(jié)HIF-1α激活的機制仍不清楚。該研究發(fā)表在《Cell Reports》，IF：9.995。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. FTO穩(wěn)定LINK-A并與化療耐藥相關(guān)

       為了研究在食管鱗癌化療耐藥背景下關(guān)鍵lncRNA的m6A修飾，研究者收集了34例接受新輔助化療的食管鱗癌患者的基線樣本（17例化療耐藥和17例化療敏感），然后測定了兩種主要的m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5的mRNA表達水平。與化學敏感樣本相比，在化學耐藥樣本中顯著上調(diào)（圖1A，B）。此外，研究者測定了FTO在先前建立的親本和化療耐藥ESCC細胞系中的蛋白水平與相應(yīng)親本細胞相比，F(xiàn)TO蛋白表達在兩個化學耐藥細胞系中上調(diào)（圖1C）。與化療耐藥細胞中FTO表達上調(diào)一致，m6A斑點雜交實驗結(jié)果顯示，與親本細胞相比，化療耐藥細胞中m6A的總體水平降低（圖1D）。隨后，為了進一步識別FTO調(diào)控的lncRNA，研究者在兩個食管鱗癌細胞系中沉默和過表達FTO，然后測量了14個注釋的ncRNA的表達水平，這些ncRNA先前在化療耐藥的食管鱗癌細胞系中顯著高于相應(yīng)的親本細胞系4個ncRNA（TTLL3、LINC00663、PRSS30P、CETN4P）的表達低于實時熒光定量pcr的檢測限。在其余的10個ncRNA中，只有LINK-A在KYSE30和KYSE450細胞中在FTO敲低后顯著下調(diào)，在FTO過表達后顯著上調(diào)（圖1E，F(xiàn)）。

圖1 FTO穩(wěn)定LINK-A并與化療耐藥相關(guān)

       接下來，研究者進行了RNA穩(wěn)定性分析，發(fā)現(xiàn)FTO敲低顯著縮短了LINK-A的半衰期，而FTO過表達穩(wěn)定了LINK-A（圖1G，H）。隨后，研究者用FTO抑制劑FB23-2處理對照組和過表達FTO的KYSE30和KYSE450細胞。FTO過表達顯著增加了LINK-A的表達水平，而FB23-2處理則減弱了這一作用（圖1I）。此外，研究者還確定了FTO對LINK-A的穩(wěn)定是否依賴于其去甲基化酶活性。甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）-qPCR結(jié)果表明，F(xiàn)TO敲低和FB23-2處理均顯著增加，但FTO過表達降低了LINK-A的m6A水平（圖1J，K）。與這一發(fā)現(xiàn)一致，MeRIP-qPCR結(jié)果顯示，與親本細胞相比，化療耐藥細胞中LINK-A的m6A水平顯著降低（圖1L）。實時qPCR結(jié)果表明，在KYSE30和KYSE450細胞中，野生型但未突變的FTO逆轉(zhuǎn)了FTO敲低引起的LINK-A表達下降（圖1M）。此外，MeRIP-qPCR結(jié)果表明，在FTO沉默的KYSE30和KYSE450細胞中，野生型FTO轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致LINK-A甲基化水平顯著降低，而這種去甲基化在FTO突變體轉(zhuǎn)導(dǎo)后未發(fā)生（圖1N）。這些結(jié)果表明FTO以m6a依賴的方式穩(wěn)定LINK-A的表達。

2. LINK-A在食管鱗癌中具有致癌作用

       為了研究LINK-A在食管鱗癌中的作用，研究者通過原位雜交分析了LINK-A在食管鱗癌患者隊列中的表達。生存分析表明，高LINK-A表達與不良預(yù)后強相關(guān)（圖2A）。此外，LINK-A在癌組織中的表達顯著高于正常組織（圖2B）。此外，在GEO數(shù)據(jù)庫中驗證了LINK-A在癌組織中的顯著上調(diào)（圖2C）。為了進一步評估LINK-A作為食管鱗癌治療靶點的潛力，研究者使用了體外化療耐藥模型。研究者測定了長期誘導(dǎo)化療耐藥的食管鱗癌細胞（KYSE450/DDP和YES2/DDP）和相應(yīng)親本細胞（KYSE450和YES2）中的LINK-A表達水平，發(fā)現(xiàn)與親本細胞相比，化療耐藥細胞中的LINK-A表達顯著上調(diào)（2~5倍）（圖2D）。為了確定LINK-A在藥物短期暴露反應(yīng)中的變化，研究者用順鉑(DDP)處理ESCC細胞不同時間（0、6、12和24 h）。隨著DDP處理時間的增加，LINK-A的表達顯著增加，尤其是在處理24 h后（圖2E）。這些結(jié)果表明，LINK-A可能在化療耐藥的獲得和維持中起著至關(guān)重要的作用。

       最后，異種移植實驗表明，在KYSE450/DDP和KYSE450細胞中沉默LINK-A顯著延緩了腫瘤生長并誘導(dǎo)了化療敏感性，而在KYSE150細胞中過表達LINK-A顯著促進了腫瘤生長和對細胞毒性化療的耐藥性（圖2F-K）。綜上所述，這些結(jié)果表明，LINK-A在食管鱗癌中起著致癌作用。

圖2 LINK-A在食管鱗癌中發(fā)揮致癌作用

3. LINK-A通過促進MCM3與CDK1的相互作用促進MCM3磷酸化

       為了進一步闡明LINK-A致癌的下游調(diào)控機制，研究者通過質(zhì)譜分析鑒定了KYSE450和YES2細胞中LINK-A沉淀的蛋白質(zhì)。在KYSE450和YES2細胞中分別鑒定出43和14種LINK-A相互作用蛋白，并且在兩個細胞系中均鑒定出其中7種相互作用蛋白（圖3A）。在這7個重疊蛋白中，MCM3已被報道在細胞周期進程和DNA復(fù)制中發(fā)揮重要作用，但其在食管鱗癌中的詳細分子機制，特別是介導(dǎo)癌細胞增殖和化療耐藥的機制尚不清楚。接下來，研究者進行了RNA pull-down和蛋白質(zhì)印跡，以確認MCM3和LINK-A的義鏈而不是反義鏈之間的特異性相互作用（圖3B）。此外，研究者通過RIP-qPCR在KYSE30和KYSE450細胞中驗證了這種相互作用（圖3C）。接下來，研究者探究了LINK-A對其相互作用蛋白MCM3表達的影響。敲低或過表達LINK-A均不影響MCM3的mRNA或蛋白水平（圖3D，E）。值得注意的是，蛋白質(zhì)印跡分析表明，LINK-A顯著促進MCM3在Ser112的磷酸化（圖3D，E）。此外，在瞬時LINK-A過表達后，MCM3 Ser112的磷酸化水平以劑量依賴的方式增加（圖3F，G）。

圖3 LINK-A通過促進MCM3與CDK1的相互作用促進MCM3磷酸化

       先前的研究報道，CDK1在112位絲氨酸磷酸化MCM3，并介導(dǎo)MCM2-7復(fù)合物的組裝和染色質(zhì)裝載然后研究者確定了LINK-A是否通過作為CDK1和MCM3的支架來促進MCM3的磷酸化。RNA pull down和隨后的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果證實了KYSE30和KYSE450細胞中LINK-A和CDK1之間的相互作用（圖3H）。接下來，免疫共沉淀（coIP）實驗的結(jié)果表明，敲低LINK-A顯著抑制和過表達LINK-A增加了CDK1和MCM3之間的相互作用（圖3I，J）。鄰近連接實驗結(jié)果證實，在體內(nèi)，LINK-A促進了CDK1和MCM3之間的相互作用（圖3K，L）。此外，研究者使用純化的MCM3和CDK1蛋白在含有LINK-A有義或反義鏈的緩沖液中進行了體外pull-down實驗。結(jié)果表明，LINK-A有義鏈而非反義鏈的存在促進了MCM3和CDK1的體外相互作用（圖3M）。與此一致的是，與相應(yīng)的親本細胞系相比，MCM3在Ser112的磷酸化以及CDK1和MCM3之間的相互作用在兩種耐藥細胞系中都增加了（圖3N，O）。

4. 磷酸化MCM3介導(dǎo)了LINK-A的致癌作用

       為了確定LINK-A介導(dǎo)的MCM3磷酸化是否促進MCM復(fù)合物的組裝和隨后的染色質(zhì)加載，研究者進行了細胞分離，然后通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測染色質(zhì)結(jié)合蛋白。在ESCC細胞中，敲低LINK-A顯著降低MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6和MCM7蛋白的染色質(zhì)負荷，而過表達LINK-A促進MCM2-7復(fù)合體的染色質(zhì)負荷（圖4A，B）。接下來，研究者構(gòu)建了MCM3的Ser112位點突變體（MCM3S112A；Ser112突變?yōu)楸彼幔?，并將野生型MCM3和MCM3S112A轉(zhuǎn)染至去除內(nèi)源性MCM3的細胞中。由LINK-A介導(dǎo)的MCM2-7復(fù)合物的染色質(zhì)負荷增加被Ser112突變所消除，表明這一過程依賴于MCM3的磷酸化（圖4C）。為了確定MCM3是否介導(dǎo)了LINK-A對細胞周期進展的促進作用，研究者進行了挽救試驗，發(fā)現(xiàn)野生型MCM3的過表達完全挽救了LINK-A沉默介導(dǎo)的G0/G1期阻滯，而MCM3S112A沒有（圖4D）。相反，在LINK-A過表達的KYSE410細胞中沉默MCM3可抑制LINK-A介導(dǎo)的細胞周期進展（圖4E）。此外，IncuCyte活細胞成像分析表明，野生型MCM3而不是MCM3S112A介導(dǎo)了LINK-A對細胞增殖的促進作用（圖4F，G）。為了進一步證明體內(nèi)MCM3和LINK-A之間的功能關(guān)系，研究者使用KYSE150細胞進行了異種移植實驗。過表達LINK-A顯著促進細胞增殖和化療耐藥性，而沉默MCM3則消除了這些作用（圖4H，I）。綜上所述，這些結(jié)果表明，LINK-A通過增加MCM3磷酸化來促進MCM2-7復(fù)合體的組裝和隨后的染色質(zhì)加載，從而發(fā)揮致癌作用。

圖4 磷酸化的MCM3介導(dǎo)了LINK-A的致癌作用

5. LINK-A通過從MCM3中分離HIF-1α來誘導(dǎo)HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性

       為了進一步研究LINK-A/MCM3軸導(dǎo)致細胞毒性化療耐藥性的機制，研究者在LINK-A沉默的KYSE450細胞中進行了RNA測序分析。引人注目的是，基因集富集分析表明，與由兩個獨立的短發(fā)夾RNA序列中的任何一個介導(dǎo)的LINK-A敲低的細胞相比，糖酵解途徑在對照細胞中顯著富集（圖5A）。鑒于之前一項研究觀察到MCM3通過直接與HIF-1α相互作用負調(diào)控HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性，研究者試圖確定LINK-A是否激活HIF-1α以促進腫瘤糖酵解。首先，研究者在常氧條件下，通過在LINK-A沉默的KYSE450細胞和LINK-A過表達的KYSE410細胞中進行IP實驗，確定LINK-A是否影響MCM3和HIF-1α的相互作用。結(jié)果表明，沉默LINK-A顯著增加MCM3與HIF-1α的相互作用，而過表達LINK-A則抑制MCM3與HIF-1α的相互作用（圖5B）。此外，研究者通過GST pull-down純化了MCM3和HIF-1α蛋白，然后在含有LINK-A的有義或反義鏈的緩沖液中進行了體外coIP實驗。在體外，LINK-A有義鏈而非反義鏈的存在抑制了MCM3和HIF-1α之間的相互作用（圖5C）。沉默LINK-A顯著抑制了缺氧反應(yīng)元件驅(qū)動的熒光素酶活性，而過表達LINK-A增強了低氧反應(yīng)元件驅(qū)動的熒光素酶活性（圖5D，E）。此外，實時熒光定量PCR結(jié)果表明，在常氧和低氧條件下，LINK-A顯著促進了HIF-1α靶基因的表達，包括SLC2A1、PDK1、HK2、LDHA和血管內(nèi)皮生長因子（圖5F，G）。值得注意的是，與常氧條件相比，在低氧條件下，LINK-A和HIF-1α靶基因的表達顯著上調(diào)（圖5F，G），進一步證實了LINK-A和HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性之間的功能相關(guān)性。

圖5 LINK-A通過將HIF-1α從MCM3中分離來誘導(dǎo)HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活

       鑒于HIF-1α在癌癥代謝重編程中的重要作用，研究者進行了Seahorse實驗來確定LINK-A對腫瘤糖酵解的影響。敲低LINK-A顯著降低了細胞外酸化率（ECAR），但適度增加了氧消耗率（OCR）（圖5H，I）。同樣，LINK-A過表達增加了ECAR，但降低了OCR（圖5J，K）。進一步研究HIF-1α是否介導(dǎo)LINK-A在食管鱗癌化療耐藥中的作用。細胞活力測定結(jié)果表明，HIF-1α抑制劑lificiguat（YC-1）和Digoxin處理顯著抑制了KYSE410和KYSE150細胞中LINK-A的致癌作用（圖5L，M）。綜上所述，這些結(jié)果表明，LINK-A通過消除MCM3介導(dǎo)的HIF-1α轉(zhuǎn)錄抑制來激活HIF-1α，進而促進糖酵解和化療耐藥。Seahorse檢測的結(jié)果顯示，F(xiàn)TO敲低后糖酵解活性顯著降低，隨后在LINK-A過表達后觀察到這種降低的逆轉(zhuǎn)（圖5N，O）。與這一發(fā)現(xiàn)一致，在FTO沉默細胞中過表達LINK-A恢復(fù)了增殖減少和化療耐藥性降低的表型（圖5P）。

6. 靶向LINK-A可使食管鱗癌對細胞毒性化療增敏

       為了確定靶向LINK-A是否為食管鱗癌有前景的治療策略，研究者建立了3個PDX模型。腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的LINK-A沉默顯著增加了ESCC pdx對DDP的敏感性（圖6A-F）。最后，研究者在圖1A所示的相同基線樣本中測定了LINK-A的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，與化療敏感樣本相比，化療耐藥樣本中LINK-A的表達水平顯著上調(diào)（圖6G）。進一步的相關(guān)性分析顯示，在這些樣本中，LINK-A的表達與FTO的表達呈正相關(guān)（圖6H），進一步證實了在ESCC化療耐藥過程中FTO對LINK-A的調(diào)控作用。綜上所述，研究者的研究結(jié)果證實了LINK-A是食管鱗癌化療耐藥的罪魁禍首，揭示了LINK-A介導(dǎo)食管鱗癌化療耐藥的潛在機制以及LINK-A在食管鱗癌化療耐藥中的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)。

圖6 靶向LINK-A使食管鱗癌對細胞毒性化療增敏

結(jié)論

       該研究揭示了食管鱗癌細胞中LINK-A的m6A去甲基化的細節(jié)。m6A去甲基化酶FTO介導(dǎo)了LINK-A的穩(wěn)定并支持其致癌作用。LINK-A與MCM3之間的直接相互作用不僅增加了CDK1介導(dǎo)的MCM3 Ser112的磷酸化，從而促進MCM2-7復(fù)合體的組裝和染色質(zhì)負載，以及隨后的細胞周期進展和細胞增殖，而且還從MCM3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制中釋放HIF-1α，從而促進腫瘤代謝重編程和化療耐藥。綜上所述，該研究結(jié)果提示FTO/LINK-A/MCM3/HIF-1α軸在食管鱗癌的進展中起著至關(guān)重要的作用，這一發(fā)現(xiàn)為靶向LINK-A在食管鱗癌患者，尤其是LINK-A高表達患者中的治療提供了潛在的策略。

機制圖

實驗方法

慢病毒的產(chǎn)生和感染，細胞活力測定，活細胞成像，細胞周期分析，蛋白質(zhì)印跡，RT-qPCR，m6斑點印跡測定，RNA pull-down，RIP，mRNA穩(wěn)定性測定，雙熒光素酶報告基因檢測，F(xiàn)ISH，IF染色，海馬檢測，RNA-seq和數(shù)據(jù)分析，小鼠實驗

參考文獻

Nan Y, Liu S, Luo Q, Wu X, Zhao P, Chang W, Zhang R, Li Y, Liu Z. m6A demethylase FTO stabilizes LINK-A to exert oncogenic roles via MCM3-mediated cell-cycle progression and HIF-1α activation. Cell Rep. 2023 Oct 18;42(10):113273. doi: 10.1016/j.celrep.2023.113273.