新發(fā)現(xiàn)！外泌體是這樣促進(jìn)血管生成作用的！

摘要
       小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在視網(wǎng)膜新生血管性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。因此，有必要揭示其病理生理和分子機(jī)制，以干預(yù)疾病的進(jìn)展。在這里，使用公開(kāi)可用的單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集來(lái)鑒定在視網(wǎng)膜血管生成模型中通過(guò)外泌體從M1小膠質(zhì)細(xì)胞向M0小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間通信增加。此外，在體外和體內(nèi)的結(jié)果表明，M1小膠質(zhì)細(xì)胞衍生的外泌體促進(jìn)活化和增強(qiáng)靜息小膠質(zhì)細(xì)胞的促血管生成能力?；谕饷隗w的miRNA測(cè)序結(jié)合基因干擾，進(jìn)一步的結(jié)果表明，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞衍生的外泌體通過(guò)miR-155-5p向M0小膠質(zhì)細(xì)胞傳遞極化信號(hào)來(lái)促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化。隨后，miR-155-5p抑制Socs1并激活NFκB通路，最終導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)并放大促血管生成作用。此外，上調(diào)的Irf1驅(qū)動(dòng)miR-155-5p在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，從而導(dǎo)致miR-155-5p被外泌體包裹的趨勢(shì)增加。因此，本研究闡明不同類(lèi)型的小膠質(zhì)細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊在復(fù)雜的視網(wǎng)膜微環(huán)境中血管生成過(guò)程中的關(guān)鍵作用，并有助于臨床視網(wǎng)膜新生血管的新的，有針對(duì)性的和潛在的治療策略。本文于2023年5月發(fā)表在《International journal of biological sciences》IF: 9.2期刊上。
技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、通過(guò)生物信息學(xué)分析，OIR模型中的外泌體增加從M1小膠質(zhì)細(xì)胞到M0小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間通訊
       OIR模型允許直接詢(xún)問(wèn)視網(wǎng)膜的血管生成反應(yīng)。為更好地了解小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜血管生成的潛在貢獻(xiàn)，作者分析從對(duì)照視網(wǎng)膜中提取的單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和出生后第17天的OIR小鼠，基于公開(kāi)的單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集（accession no. GSE152928）。在質(zhì)量控制過(guò)濾器后，分別從對(duì)照和OIR小鼠獲得9045和6140個(gè)視網(wǎng)膜細(xì)胞。然后對(duì)細(xì)胞譜進(jìn)行無(wú)偏聚類(lèi)，根據(jù)多個(gè)公認(rèn)的標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞相關(guān)基因主要分布在八個(gè)簇中，并且一個(gè)細(xì)胞簇表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的特征。使用已知的小膠質(zhì)細(xì)胞亞型特異性標(biāo)志物，進(jìn)一步將小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞相關(guān)簇分為兩大類(lèi)，包括M0小膠質(zhì)細(xì)胞簇和M1小膠質(zhì)細(xì)胞簇（圖1A-B）。Il1β和Tnfα是促炎M1極化的兩個(gè)特征基因，在OIR視網(wǎng)膜的M1小膠質(zhì)細(xì)胞簇中明顯增加（圖1C），表明M1小膠質(zhì)細(xì)胞簇在病理過(guò)程中具有更高水平的極化和更活躍的狀態(tài)。為進(jìn)一步解釋活性M1小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)各種細(xì)胞的影響，作者將受體配體對(duì)映射到細(xì)胞類(lèi)型上，以構(gòu)建假定的細(xì)胞通訊。觀察到與對(duì)照組小鼠相比，OIR小鼠的視網(wǎng)膜細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)中的M1小膠質(zhì)細(xì)胞活性增強(qiáng)（圖1D-E）。具體來(lái)說(shuō)，從M1小膠質(zhì)細(xì)胞到血管EC的細(xì)胞間通訊或M0小膠質(zhì)細(xì)胞增加。由于許多研究已報(bào)道活化小膠質(zhì)細(xì)胞與EC在血管生成中的關(guān)聯(lián)，因此作者重點(diǎn)關(guān)注M1極化小膠質(zhì)細(xì)胞與處于靜息穩(wěn)態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞之間的關(guān)系。然而，活化和靜息小膠質(zhì)細(xì)胞之間的通訊機(jī)制尚不清楚。
       既往研究表明，外泌體是細(xì)胞通訊的重要介質(zhì)，外泌體內(nèi)化可由配-受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用介導(dǎo)。因此，來(lái)源于M1小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體對(duì)于OIR中靜息小膠質(zhì)細(xì)胞至關(guān)重要。與預(yù)期一致，OIR視網(wǎng)膜的M63小膠質(zhì)細(xì)胞簇中的特異性外泌體標(biāo)志物Cd63和Sdcbp顯著增加（圖1F-G）。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明，在OIR誘導(dǎo)的血管生成中，從M1小膠質(zhì)細(xì)胞到M0小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間通訊增加，M1小膠質(zhì)細(xì)胞衍生的外泌體可能介導(dǎo)上述過(guò)程。

圖1 單細(xì)胞RNA-seq發(fā)現(xiàn)，在視網(wǎng)膜血管生成模型中從M1小膠質(zhì)細(xì)胞到M0小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間通訊增加

2、M1小膠質(zhì)外泌體促進(jìn)體外小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化
       為闡明M1極化小膠質(zhì)細(xì)胞衍生外泌體的作用，作者利用BV2細(xì)胞（一種小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞）進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。BV2細(xì)胞通過(guò)添加1ng/ml LPS極化為M100表型，這是激活小膠質(zhì)細(xì)胞的典型方法。如圖2A所示，LPS處理促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性S多假足的不規(guī)則形式。與添加PBS相比，對(duì)照組中活化小膠質(zhì)細(xì)胞的比例增加（圖2B）。此外，活化小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)均顯著增加，包括用于小膠質(zhì)細(xì)胞活化的CD68，以及用于M1表型的iNOS和Il1β（圖2C-E）。此外，基于使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CD11b和CD86陽(yáng)性（M1表型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的另一個(gè)標(biāo)志物）細(xì)胞的分析，作者發(fā)現(xiàn)LPS顯著誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞極化為M1表型（圖2F-G）。
       為更好地了解來(lái)源于M0型和M1型BV2細(xì)胞的外泌體的功能，首先通過(guò)超速離心分離外泌體進(jìn)行鑒定。在透射電子顯微鏡（TEM）下觀察到典型的杯形膜囊泡形態(tài)（圖2H）。納米顆粒示蹤分析（NTA）表明，M0和M1 BV2細(xì)胞外泌體的粒徑分布主要在30-150 nm范圍內(nèi)（圖2I）。蛋白質(zhì)印跡圖顯示，已知的外泌體特征標(biāo)志物（包括Cd63和Tsg101）在外泌體中含量很高。此外，細(xì)胞裂解物富含鈣連接蛋白（一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白），而在外泌體中未檢測(cè)到鈣連接蛋白，這表明分離的外泌體相對(duì)純凈，沒(méi)有污染其他細(xì)胞區(qū)室（圖2J）。

圖2 源自靜息和LPS激活的M1小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體的表征

       接下來(lái)，作者專(zhuān)注于外泌體對(duì)原代視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞（PMG）的影響。培養(yǎng)的PMG與PKH26標(biāo)記的外泌體（紅色）一起孵育，這些外泌體是從BV2衍生的條件培養(yǎng)基中收集的。在處理后24小時(shí)，用Iba1+（一種特定的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。數(shù)據(jù)顯示M0-EXO和M1-EXO（紅色）都位于Iba1陽(yáng)性PMG（綠色）的細(xì)胞質(zhì)中，表明外泌體被PMG吞噬（圖3A）。此外，在PMG中用M1-EXO處理24小時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)變化（白色箭頭）（圖3B）。與PBS組和M0-EXO處理組相比，M1-EXO處理組觀察到更多的變形蟲(chóng)和不規(guī)則形狀的Iba1陽(yáng)性細(xì)胞（圖3C）。為表征活化小膠質(zhì)細(xì)胞的極化表型，作者通過(guò)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步測(cè)量M1激活的標(biāo)記物iNOS和Il1β的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與PBS組和M0-EXO處理組相比，M1-EXO組iNOS和Il1β表達(dá)顯著增加（圖3D-E）。此外，如圖3F-G所示，流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，M1-EXO處理M1小膠質(zhì)細(xì)胞的百分比顯著增加。綜上所述，結(jié)果表明在體外M1外泌體治療后，PMGs向M1促炎狀態(tài)極化。

圖3 M1小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體在體外促進(jìn)原發(fā)性視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的M1極化

3、M1小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)體外外泌體增強(qiáng)M0小膠質(zhì)細(xì)胞的促血管生成潛力
       為評(píng)估用小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體處理后PMG的促血管生成能力，用下述條件培養(yǎng)基處理HUVEC。例如，用M0-EXO，M1-EXO和PBS作為對(duì)照處理PMG。然后，收集條件培養(yǎng)基作為PBS處理的PMG條件培養(yǎng)基（pPMG-CM），靜息外泌體處理的PMG條件培養(yǎng)基（rPMG-CM）和活化的外泌體處理的PMG條件培養(yǎng)基（aPMG-CM）。如圖4A所示，與用pPMG-CM或rPMG-CM處理的細(xì)胞相比，aPMG-CM顯著促進(jìn)HUVEC的增殖。同樣，與pPMG-CM或rPMG-CM處理相比，aPMG-CM處理增加毛細(xì)管樣管和液絡(luò)部的數(shù)量。定量后，rPMG-CM顯著加強(qiáng)血管的形成（圖4B）。CM對(duì)HUVECs遷移的影響通過(guò)遷移傷口愈合測(cè)定法進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，在用aPMG-CM治療后24小時(shí)和48小時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下觀察到明顯較小的剩余傷口面積（圖4C-D）。此外，在治療后24小時(shí)從HUVEC中提取整個(gè)蛋白質(zhì)，以評(píng)估血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)。ELISA顯示，與pPMG-CM或rPMG-CM組相比，aPMG-CM組的Sdf1表達(dá)顯著增加（圖4E）。此外，如圖4F-G所示，蛋白質(zhì)印跡測(cè)定表明，用aPMG-CM處理的HUVECs中Cxcr4、Hif1α和Vegf均顯著升高。
       總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明M1-EXO處理的小膠質(zhì)細(xì)胞在體外促進(jìn)血管生成；換句話說(shuō)，M1小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體激活M0小膠質(zhì)細(xì)胞，隨后放大其促血管生成活性，這表明血管生成與源自活化小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體之間存在間接聯(lián)系。

圖4 來(lái)源于M1小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體在體外提高小膠質(zhì)細(xì)胞的促血管生成能力

4、M1小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體促進(jìn)體內(nèi)M1視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的極化
       為在體外確認(rèn)結(jié)果，作者使用成年小鼠模型檢查玻璃體內(nèi)注射M0-EXO或M1-EXO后視網(wǎng)膜的變化，使用PBS和假組的陰性對(duì)照（圖5A）。如圖5B所示，玻璃體內(nèi)注射兩天后，通過(guò)小鼠視網(wǎng)膜中的3D共聚焦圖像檢測(cè)到PKH26標(biāo)記的外泌體（紅色），外泌體定位于Iba1+小膠質(zhì)細(xì)胞（綠色）的細(xì)胞質(zhì)。在注射后六周，將視網(wǎng)膜冷凍并切成切片或徑向切割并固定在載玻片上，然后用針對(duì)Iba1陽(yáng)性（紅色）的抗體染色（圖5C），發(fā)現(xiàn)在核層中用M1-EXO處理后，遷移的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加（圖5D），這是活化小膠質(zhì)細(xì)胞的典型細(xì)胞特征。此外，細(xì)胞密度的定量表明，M1-EXO處理顯著增加小膠質(zhì)細(xì)胞的極化水平，而其他組之間沒(méi)有顯著差異（圖5E-F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，來(lái)源于M1 BV2細(xì)胞的外泌體促進(jìn)視網(wǎng)膜駐留小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，這與體外結(jié)果一致。

圖5 M1小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體促進(jìn)體內(nèi)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化

5、M1小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體在體內(nèi)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化后誘導(dǎo)血管生成
       在成年小鼠模型中M1-EXO玻璃體內(nèi)注射后，免疫熒光分析顯示，在PBS、SHAM或M4-EXO治療后，血管生成的標(biāo)志物Cxcr4和Sdf1均顯示沿視網(wǎng)膜外緣和脈絡(luò)膜中微弱的非特異性染色。相比之下，Cxcr4和Sdf1在M1-EXO-注射小鼠的切片中強(qiáng)烈陽(yáng)性（圖6A）。此外，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖是參與病理性新生血管形成的生物學(xué)過(guò)程。因此，視網(wǎng)膜組織切片進(jìn)一步用針對(duì)Pecam1和Ki67的抗體進(jìn)行雙重染色，前者是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，后者是增殖細(xì)胞的標(biāo)志物。在對(duì)每節(jié)向前延伸至內(nèi)限膜的Ki67-和Pecam1-陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，與其他三組相比，僅在M1-EXO治療組中觀察到內(nèi)皮細(xì)胞增殖（圖6B）。與體外結(jié)果一致，M1小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體促進(jìn)體內(nèi)視網(wǎng)膜異常內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
       考慮到體內(nèi)視網(wǎng)膜微環(huán)境的復(fù)雜性，為進(jìn)一步證明M1-EXO可能激活靜息小膠質(zhì)細(xì)胞從而增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成的假設(shè)，作者使用米諾環(huán)素（一種典型的小膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制劑）建立干預(yù)組。如圖6C所示，米諾環(huán)素處理顯著減少活化小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量（圖6D）。此外，米諾環(huán)素顯著抑制Pecam1 +細(xì)胞突破M1-EXO誘導(dǎo)的內(nèi)部限制膜（圖6E）。這些結(jié)果表明，米諾環(huán)素通過(guò)抑制視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的活化來(lái)緩解M1-EXO的促血管生成作用，并提供大量證據(jù)表明M1小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體的促血管生成作用是由活化的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的。換句話說(shuō)，M1-EXO通過(guò)激活M0小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)放大小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的促血管生成作用。然而，確切的機(jī)制仍有待闡明。

圖6 來(lái)源于M1小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體促進(jìn)體內(nèi)血管生成，抑制視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的活化可逆轉(zhuǎn)這種作用

6、M1小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體通過(guò)外泌體miR-155-5p誘導(dǎo)靜息小膠質(zhì)細(xì)胞活化
       新出現(xiàn)的證據(jù)表明，外泌體富含miRNA，并進(jìn)一步遞送miRNA以調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的功能。為闡明M1-EXO激活小膠質(zhì)細(xì)胞的具體機(jī)制，作者對(duì)來(lái)自BV1細(xì)胞的外泌體在靜息和M2激活條件下進(jìn)行miRNA測(cè)序。如火山圖（圖7A）所示，發(fā)現(xiàn)與M103-EXO相比，M1-EXO中有103個(gè)差異表達(dá)的miRNA，包括16個(gè)上調(diào)和87個(gè)下調(diào)miRNA。使用熱圖進(jìn)一步可視化已鑒定的miRNA的組內(nèi)和組間差異（圖7B）。此外，通過(guò)使用qRT-PCR，作者發(fā)現(xiàn)M1 BV2細(xì)胞和M1-EXO中只有miR-155-5p的水平顯著高于各自的對(duì)照（圖7C）。然而，miR-146b-5p、miR-181d-3p和miR-5121的變化在細(xì)胞和外泌體之間并不一致。因此，miR-155-5p可能在外泌體中起關(guān)鍵作用，并進(jìn)一步測(cè)試。

圖7 來(lái)自M1小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體miR-155-5p在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)靜息小膠質(zhì)細(xì)胞活化

       為進(jìn)一步闡明miR-155-5p在BV2細(xì)胞來(lái)源的外泌體中的確切作用，調(diào)節(jié)miR-155-5p在外泌體中的表達(dá)模式，并觀察修飾的外泌體對(duì)PMG的作用。首先，作者通過(guò)agomir轉(zhuǎn)染在M0-EXO中過(guò)表達(dá)miR-155-5p，其最初在miR-155-5p表達(dá)中較低（ago-miR-155-5p組）。其次通過(guò)在最初高表達(dá)miR-155-5p的M1-EXO中antagomir轉(zhuǎn)染抑制miR-155-5p（antago-miR-155-5p組）。然后分別鑒定用改良EXO處理的PMG的M1活化曲線。利用三種M1表型標(biāo)志物（iNOS、IL1β、CD86）來(lái)鑒定M1活化譜。數(shù)據(jù)顯示，miR-155-5p在M0-EXO中的過(guò)表達(dá)顯著引起顯著的形態(tài)學(xué)變化（圖7F-G）和促進(jìn)靜息PMG的M1極化（圖7D-E、圖7H-I）。值得注意的是，當(dāng)miR-155-5p在M1-EXO中被antagomiR-155-5p下調(diào)時(shí)，M1-EXO促進(jìn)M1極化的能力被顯著抑制，這反映在減少的形態(tài)學(xué)異常（圖7F-G）和活化標(biāo)志物（圖7D-E）。
       接下來(lái)，為確認(rèn)miR-155-5p在體內(nèi)的生物活性，將轉(zhuǎn)染有agomiR或antiagomiR的外泌體注射到玻璃體室中。視網(wǎng)膜平片的結(jié)果表明，外源性miR-155-5p補(bǔ)充有助于M0-EXO誘導(dǎo)PMG活化，并且M1-EXO的miR-155-5p下調(diào)減輕小膠質(zhì)細(xì)胞活化（圖7J-K）。因此，外泌體miR-155-5p可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)，可能是外泌體介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)鍵分子。

7、外泌體miR-155-5p通過(guò)調(diào)節(jié)Socs1/NFκB途徑參與小膠質(zhì)細(xì)胞活化
       為探究miR-155-5p激活和炎癥轉(zhuǎn)換靜息小膠質(zhì)細(xì)胞的機(jī)制，作者利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-155-5p的潛在靶基因。利用五個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（miRanda，miRDB，PITA，TargetScan和PicTar）獲得32個(gè)交叉的mRNA（圖8A）。對(duì)重疊的候選mRNA進(jìn)行進(jìn)一步的功能富集分析，以確定與炎癥相關(guān)的途徑?；谝幌盗猩镄畔W(xué)分析，Socs1被認(rèn)為是miR-155-5p的關(guān)鍵靶標(biāo)，因?yàn)樗閷?dǎo)免疫和炎癥信號(hào)傳導(dǎo)。因此，為確認(rèn)生物信息學(xué)分析的結(jié)果，作者構(gòu)建含有Socs3 mRNA的1'-UTR的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒系統(tǒng)。熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和miR-155-5p模擬物或加擾模擬物共轉(zhuǎn)染到PMG中。熒光素酶活性分析表明，miR-155-5p直接與Socs1 3'-UTR相互作用并降低Socs1的表達(dá)（圖8B）；因此，Socs1的調(diào)節(jié)可能是破譯外泌體miR-155-5p與視網(wǎng)膜炎癥之間機(jī)制的關(guān)鍵。
       先前的研究表明，Socs1通過(guò)與NFκB亞基p65相互作用來(lái)限制NFκB信號(hào)傳導(dǎo)和核NFκB活性，而NFκB轉(zhuǎn)錄因子家族的激活是調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和促炎分子表達(dá)的關(guān)鍵步驟。因此，Socs1可能通過(guò)調(diào)節(jié)NFκB參與M1-EXO介導(dǎo)的細(xì)胞活化，這已被蛋白質(zhì)印跡測(cè)定證實(shí)。如圖8C-D所示，M1-EXO顯著抑制Socs1的表達(dá)，其次是磷酸化NFκB和兩個(gè)促炎標(biāo)志物（iNOS，Il1β）的上調(diào)。
       為進(jìn)一步證明M1-EXO的促炎作用是由Socs1和下游轉(zhuǎn)錄因子NFκB介導(dǎo)，作者進(jìn)行功能喪失實(shí)驗(yàn)（圖8E）。如圖8F所示，antagomiR-155-5p轉(zhuǎn)染的M1-EXO顯著促進(jìn)Socs1的表達(dá)，并下調(diào)PMG中磷酸化NFκB的表達(dá)。與空載體轉(zhuǎn)染相比，通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染敲低Socs1到PMGs也顯著減輕antagomiR-155-5p的抑制作用（圖8F-G）。因此，Socs1的敲低可以模擬外泌體miR-155-5p的類(lèi)似促炎作用。這些結(jié)果表明，miR-155-5p的靶標(biāo)Socs1在小膠質(zhì)細(xì)胞活化和視網(wǎng)膜炎癥中起著至關(guān)重要的作用。

圖8 外泌體miR-155-5p通過(guò)靶向Socs1調(diào)節(jié)NFκB通路促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化

8、轉(zhuǎn)錄因子Irf1促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞中的細(xì)胞和外泌體miR-155-5p
       基于上述結(jié)果，作者證實(shí)M155激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞miR-155-5p水平升高，從而導(dǎo)致外泌體中miRNA水平升高，最終在小膠質(zhì)細(xì)胞中傳播激活信號(hào)和炎癥反應(yīng)。然而，miR-155-5p在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中究竟如何增加仍然難以捉摸。越來(lái)越多的證據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄因子（TFs）可以直接或間接觸發(fā)miRNA的表達(dá)。為確定負(fù)責(zé)miR-155-5p上調(diào)的潛在TF，在靜息BV2細(xì)胞和活化的BV2細(xì)胞之間進(jìn)行mRNA測(cè)序以篩選差異表達(dá)的基因（圖9A）。此外，JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的差異表達(dá)基因和潛在轉(zhuǎn)錄因子的交叉分析表明，三個(gè)候選基因可能負(fù)責(zé)miR-155-5p的表達(dá)（圖9B）。在這些候選細(xì)胞的GSEA之后，作者發(fā)現(xiàn)與靜息細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)錄因子Irf1相關(guān)途徑在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中大大富集（圖9C）。此外，與靜息BV1小膠質(zhì)細(xì)胞相比，活化的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中Irf1的蛋白表達(dá)顯著增加（圖9D）。
       已知miR-155-5p是從miR155宿主基因（miR155HG）加工而來(lái)的。為證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子Irf1與miR155HG的啟動(dòng)子結(jié)合并隨后促進(jìn)miR-155-5p的表達(dá)（圖9E），構(gòu)建miR155HG啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒系統(tǒng)，并將其與Irf1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到BV2細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后檢測(cè)到熒光素酶活性。圖9F顯示Irf1可以激活miR155HG的啟動(dòng)子。此外，Irf1的過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)miR155HG和miR-155-5p在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)（圖9G）。所有這些結(jié)果表明，上調(diào)的Irf1直接結(jié)合miR155HG的特異性DNA序列，并促進(jìn)miR-155-5p在活化小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。

圖9 轉(zhuǎn)錄因子Irf1促進(jìn)M1激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中miR-155-5p的表達(dá)

       這是第一項(xiàng)揭示M1小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體介導(dǎo)的靜息小膠質(zhì)細(xì)胞活化和遷移，炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和視網(wǎng)膜血管生成的新機(jī)制的研究。具體機(jī)制包括：（1）上調(diào)的Irf1直接結(jié)合miR155HG的特異性DNA序列，促進(jìn)miR-155-5p在活化小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。（2）來(lái)自M155活化小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體miR-155-5p通過(guò)靜息小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)吞。（3）外泌體miR-155-5p通過(guò)選擇性抑制Socs1激活NFκB途徑和小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)。（4）增加和聚集的M1小膠質(zhì)細(xì)胞引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，（5）放大促血管生成作用，最終誘導(dǎo)視網(wǎng)膜異常內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

圖10 說(shuō)明M1小膠質(zhì)細(xì)胞中Irf1介導(dǎo)的外泌體miR-155-5p調(diào)節(jié)Socs1表達(dá)，以促進(jìn)靜息小膠質(zhì)細(xì)胞的活化并放大促血管生成作用的示意圖

實(shí)驗(yàn)方法
單細(xì)胞測(cè)序、細(xì)胞培養(yǎng)、外泌體分離、WB、流式細(xì)胞術(shù)、CCK8細(xì)胞活力測(cè)定、傷口愈合實(shí)驗(yàn)、血管形成測(cè)定、ELISA、免疫熒光、qRT-PCR、過(guò)表達(dá)與敲除、轉(zhuǎn)染、miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、miRNA-Seq、mRNA-Seq。
參考文獻(xiàn)
Chen X, Wang X, Cui Z, et al. M1 Microglia-derived Exosomes Promote Activation of Resting Microglia and Amplifies Proangiogenic Effects through Irf1/miR-155-5p/Socs1 Axis in the Retina. Int J Biol Sci. 2023;19（6）:1791-1812. Published 2023 Mar 21. doi:10.7150/ijbs.79784