URI重編程p53野生型肝癌脂質(zhì)代謝,減輕TKIs誘導(dǎo)的鐵死亡!

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2024-03-22
發(fā)現(xiàn)由非傳統(tǒng)的前折疊蛋白R(shí)PB5相互作用因子(URI)介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝重編程使晚期肝細(xì)胞癌對(duì)TKIs誘導(dǎo)的鐵死亡具有抗性......

       基于酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)的全身治療晚期肝細(xì)胞癌(HCC)的臨床獲益受到耐藥性的限制。在這里,作者發(fā)現(xiàn)由非傳統(tǒng)的前折疊蛋白R(shí)PB5相互作用因子(URI)介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝重編程使HCC對(duì)TKIs誘導(dǎo)的鐵死亡具有抗性。在機(jī)制上,URI直接與TRIM28相互作用,并以依賴TRIM28- MDM2的方式促進(jìn)p53泛素化和降解。重要的是,p53結(jié)合硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)啟動(dòng)子并抑制其轉(zhuǎn)錄。URI高表達(dá)與SCD1高表達(dá)相關(guān),二者協(xié)同表達(dá)預(yù)示HCC預(yù)后不良和TKIs耐藥。SCD1抑制劑aramchol與氘化索拉非尼衍生物多納非尼聯(lián)合在p53-野生型HCC患者來(lái)源的類器官和移植腫瘤中顯示出良好的抗腫瘤作用。這種聯(lián)合治療對(duì)于具有野生型p53和高水平URI/SCD1的晚期HCC患者具有潛在的臨床益處。本文于2023年10月發(fā)表于《Nature Communication》,IF:16.6,Q1。
技術(shù)路線


主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、URI促進(jìn)肝癌細(xì)胞對(duì)TKIs誘導(dǎo)的鐵死亡的抵抗
       首先,作者進(jìn)行了RNA測(cè)序(RNA-seq)分析,以確定激活URI依賴性轉(zhuǎn)錄組改變。作者發(fā)現(xiàn)在shRNA(Ctrl)和shURI HepG2細(xì)胞之間共有1676個(gè)基因差異表達(dá)。使用KEGG途徑進(jìn)行的功能富集分析顯示,鐵死亡是URI調(diào)控的最重要的改變途徑之一(圖1a)?;蚣患治觯℅SEA)顯示,與對(duì)照組相比,shURI細(xì)胞中鐵死亡而不是凋亡信號(hào)呈陽(yáng)性富集(圖1b)。這些結(jié)果提示URI可能在鐵死亡中起重要作用。同時(shí),包括EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、脂解調(diào)節(jié)、p53信號(hào)通路和癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等途徑也受到URI的調(diào)節(jié)(圖1a)。
       有許多臨床試驗(yàn)評(píng)估TKIs治療晚期HCC。與細(xì)胞毒性作用一致,這些TKIs在測(cè)試的各種癌細(xì)胞系中有效地降低了腫瘤活力(圖1c)。值得注意的是,以B-RAF為共同靶點(diǎn)的索拉非尼、瑞格拉非尼和多納非尼有利于鐵中毒樣細(xì)胞死亡,而其他測(cè)試藥物對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的影響很?。▓D1d)。
       然后,作者測(cè)試了URI是否調(diào)節(jié)TKIs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。增加索拉非尼濃度處理JHH1和HepG2細(xì)胞48小時(shí),觀察細(xì)胞增殖情況。URI的消耗顯著增加了JHH1和HepG2細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性,在JHH1細(xì)胞中,IC50(導(dǎo)致50%的活力抑制)從8.324 μM(Ctrl)降低到6.480 μM(shURI),在HepG2細(xì)胞中,分別從8.047 μM(Ctrl)降低到4.069 μM(shURI)(圖1e)。克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)了URI在索拉非尼耐藥中的作用(圖1f, g)。有趣的是,在JHH1和HepG2細(xì)胞中,URI敲低顯著增加了索拉非尼誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化(圖1h),這表明URI可能抑制TKIs誘導(dǎo)的鐵死亡。此外,索拉非尼誘導(dǎo)的URI敲低細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用可以通過(guò)抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)或鐵死亡抑制劑鐵抑素-1(fer1;脂質(zhì)過(guò)氧化清除劑),而細(xì)胞凋亡、壞死或自噬抑制劑作用不大(圖1i)??傊@些結(jié)果表明URI與肝癌細(xì)胞對(duì)TKIs誘導(dǎo)的鐵死亡的耐藥性有關(guān)。


圖1 URI耗竭促進(jìn)TKIs誘導(dǎo)的癌細(xì)胞鐵死亡


2、URI的異位表達(dá)重編程了癌細(xì)胞中SCD1相關(guān)的脂質(zhì)代謝
       癌細(xì)胞比正常細(xì)胞需要更高水平的脂質(zhì)代謝,這可以決定細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。為了檢測(cè)URI介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝和脂質(zhì)組學(xué)變化,在HepG2- shURI和HepG2- Ctrl細(xì)胞中進(jìn)行了基于質(zhì)譜的脂質(zhì)組學(xué)分析(圖2a)。在URI缺失的HepG2細(xì)胞中,主要含有單不飽和脂肪酸鏈的最豐富的脂類TGs的相對(duì)含量比對(duì)照組顯著降低,磷脂酰肌醇(PI(18:1/18:1))和雙甘油酯(DG(16:1/18:1/0:0))的相對(duì)含量降低(圖2a, b)。相反,磷脂酰甘油(PG(16:0/16:0))的相對(duì)含量在HepG2- shURI細(xì)胞中增加(圖2b)。這些結(jié)果表明,URI的消耗改變了肝癌細(xì)胞的脂質(zhì)組成。
       作者分析HepG2細(xì)胞的脂肪酸含量。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化是鐵死亡的一個(gè)主要事件,它是由MUFAs和多不飽和脂肪酸(PUFAs)的比例決定的。作者發(fā)現(xiàn),在HepG2- shURI細(xì)胞中,SFAs水平比對(duì)照組升高,SFAs衍生的代謝產(chǎn)物MUFAs水平,特別是16:1(n-7)和18:1(n-9)MUFAs水平顯著降低(圖2c)。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明,URI敲除導(dǎo)致從SFAs到MUFAs的約定受損。值得注意的是,作為SCD1活性替代物的16:1(n-7)/16:0和18:1(n-9)/18:0比值在HepG2-shURI細(xì)胞中比對(duì)照顯著降低(圖2d),表明URI表達(dá)與SCD1活性/表達(dá)之間存在強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)。
       PL-PUFAs易受ROS影響,其脂質(zhì)過(guò)氧化可引發(fā)鐵死亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。相反,MUFAs可以通過(guò)促進(jìn)PUFAs從血漿膜中位移膜磷脂來(lái)抑制這一過(guò)程。然后,作者分析HepG2-shURI和HepG2-Ctrl細(xì)胞之間磷脂的脂質(zhì)種類(如PC, PE, PI)。穩(wěn)態(tài)下,HepG2-shURI細(xì)胞的磷脂中MUFA比對(duì)照組有降低的趨勢(shì)(圖2e)。HepG2-shURI細(xì)胞中C16:0/C20:4 PL-PUFA含量比對(duì)照細(xì)胞增加,而HepG2-shURI細(xì)胞中PL-MUFA C16:0/C18:1含量降低(圖2f)。因此,雖然HepG2-shURI和對(duì)照細(xì)胞之間PUFAs沒(méi)有明顯變化,但PL-PUFA減少。
       從頭合成脂肪酸(FAS)涉及幾種酶的協(xié)調(diào)作用(圖2g)。接下來(lái),作者測(cè)量JHH1和HepG2細(xì)胞中FAS通路關(guān)鍵酶的mRNA水平,以及它們的URI耗盡酶(圖2h)。與親本細(xì)胞相比,JHH1-shURI和HepG2-shURI細(xì)胞中參與飽和脂肪酸合成或脂肪酸延伸的酶,包括SCD1、FASN、FADS2、ACACAELOVL6的轉(zhuǎn)錄本顯著減少(圖2h)??傊@些結(jié)果表明URI消耗重編程了肝癌細(xì)胞的脂質(zhì)代謝。


圖2 URI耗竭改變了癌細(xì)胞的脂質(zhì)代謝


3、URI通過(guò)SCD1促進(jìn)對(duì)TKIs誘導(dǎo)的鐵死亡的抗性
       脂質(zhì)代謝重編程與癌癥耐藥有關(guān)。為了探究URI缺失是否會(huì)改變脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的蛋白水平,作者分析不同細(xì)胞系在基礎(chǔ)狀態(tài)下的蛋白水平。雖然在URI敲低的細(xì)胞中觀察到ACACA、FASNFADS2的信使RNA轉(zhuǎn)錄顯著變化(圖2h),但它們的蛋白水平不受URI的影響(圖3a)。值得注意的是,作者發(fā)現(xiàn)shURI細(xì)胞中的SCD1蛋白水平低于對(duì)照組(圖3a),這與SCD1 mRNA水平的降低是一致的(圖2h),這表明URI可能通過(guò)影響SCD1的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)其活性。
       cystine-import-GSH-GPX4機(jī)制是調(diào)控鐵死亡的典型途徑。然而,URI缺失在RSL3處理或不處理的JHH1和HepG2細(xì)胞中誘導(dǎo)SLC7A11、GCLC、GCLM和GPX4蛋白水平輕度變化(圖3a)。此外,在shURI和對(duì)照細(xì)胞中,ferrostatin-1可以減少索拉非尼或聯(lián)合治療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖3b)。與這些結(jié)果一致, SCD1抑制劑與索拉非尼聯(lián)合在長(zhǎng)期克隆實(shí)驗(yàn)中顯示出對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制。抑制鐵死亡可以減輕這種聯(lián)合治療誘導(dǎo)的增殖抑制(圖3c, d)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明,索拉非尼和SCD1抑制劑聯(lián)合使用顯著提高了癌細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化,加入ferrostatin-1同樣減少了聯(lián)合治療誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化(圖3e)。為了證實(shí)這些發(fā)現(xiàn),作者將MOCK或Flag-SCD1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到癌細(xì)胞中。作者的研究結(jié)果表明,在URI敲除細(xì)胞中,F(xiàn)lag-SCD1的穩(wěn)定表達(dá)足以重新抵抗細(xì)胞的鐵死亡(圖3f)。同時(shí),補(bǔ)充外源性SCD1可降低索拉非尼誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化(圖3g)。總之,作者的研究結(jié)果表明,URI通過(guò)上調(diào)SCD1來(lái)促進(jìn)對(duì)TKIs誘導(dǎo)的鐵凋亡的抗性。


圖3 URI以SCD1依賴的方式減輕TKI誘導(dǎo)的鐵死亡


4、URI在肝癌細(xì)胞中通過(guò)野生型p53正向調(diào)節(jié)SCD1轉(zhuǎn)錄
       研究表明,SCD1在轉(zhuǎn)錄水平上受幾種轉(zhuǎn)錄因子(TFs)的調(diào)控,在翻譯后水平上受蛋白酶體的泛素化和隨后的降解的調(diào)控。用His-URI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染shURI細(xì)胞可恢復(fù)SCD1蛋白水平(圖4a)。為了研究URI如何上調(diào)癌細(xì)胞中SCD1的表達(dá),作者首先研究了URI對(duì)SCD1蛋白穩(wěn)定性的影響。這些結(jié)果表明,URI上調(diào)SCD1表達(dá)獨(dú)立于泛素蛋白酶體系統(tǒng)。因此,作者假設(shè)URI可能通過(guò)上調(diào)其轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)SCD1的表達(dá)。事實(shí)上,報(bào)告基因分析顯示,shURI細(xì)胞中的SCD1-luc值顯著低于Ctrl細(xì)胞(圖4b)。
       為了進(jìn)一步確定哪些轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)URI對(duì)SCD1的調(diào)控,作者將靶向SREBP、ChREBP或LXRα的siRNA轉(zhuǎn)染到癌細(xì)胞中,這是報(bào)道的調(diào)節(jié)SCD1的主要TFs。在干擾這些TFs后,URI介導(dǎo)的SCD1-luc強(qiáng)度差異并未消除(圖4c)。由于ChREBP和LXRα顯示以SREBP依賴的方式增加SCD1的轉(zhuǎn)錄,作者在HepG2- Ctrl和HepG2- shURI細(xì)胞中使用SREBP抗體進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析,發(fā)現(xiàn)SREBP在SCD1啟動(dòng)子區(qū)域有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(圖4d)。然而,SREBP與SCD1啟動(dòng)子的結(jié)合不受URI表達(dá)的影響,與熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)一致。作者的數(shù)據(jù)表明這些轉(zhuǎn)錄因子不參與URI調(diào)節(jié)SCD1。
       先前的研究表明SCD1基因是p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制的靶標(biāo)。與此一致的是,作者的CUT&Tag分析顯示p53的結(jié)合位點(diǎn)存在于SCD1的啟動(dòng)子區(qū)(圖4e)。GSEA發(fā)現(xiàn)URI缺失后p53轉(zhuǎn)錄基因網(wǎng)絡(luò)顯著陽(yáng)性富集(圖4f),RT-PCR進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)(圖4g)。為了驗(yàn)證p53介導(dǎo)的SCD1表達(dá)的作用,作者用多柔比星(一種著名的p53激活劑)處理JHH1和HepG2細(xì)胞(表達(dá)野生型p53)。結(jié)果顯示,Dox處理后SCD1蛋白和SCD1 mRNA表達(dá)降低(圖4h, i)。接下來(lái),作者將Mycp53、突變體p53- R273H或p53- R249S轉(zhuǎn)染到p53-null細(xì)胞(Hep3B)中,發(fā)現(xiàn)野生型p53顯著下調(diào)SCD1蛋白水平。相比之下,DNA接觸突變體(p53-R273H)和構(gòu)象突變體(p53-R249S)都不影響SCD1蛋白水平(圖4j)。事實(shí)上,SCD1基因的5 '側(cè)翼區(qū)域包含一個(gè)與p53結(jié)合序列一致的位點(diǎn)(圖4k)。ChIP分析進(jìn)一步表明,內(nèi)源性p53結(jié)合在SCD1基因的啟動(dòng)子區(qū)域(圖4l)。此外,Dox和nutlin-3都可以激活p53,但不能逆轉(zhuǎn)p53-敲低狀態(tài)下SCD1蛋白水平的升高(圖4m)。作者推測(cè)URI上調(diào)SCD1表達(dá)是由p53介導(dǎo)的。URI缺失增強(qiáng)了p53與SCD1啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合(圖4n)。接下來(lái),作者將p53的siRNA轉(zhuǎn)染到HepG2-Ctrl和HepG2-shURI細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)p53的敲低消除了shURI介導(dǎo)的SCD1抑制(圖4n)。作者的數(shù)據(jù)顯示,URI缺失顯著降低了野生型p53細(xì)胞(JHH1和HepG2)中SCD1的表達(dá)(圖3a和圖4p)。總之,這些數(shù)據(jù)表明URI通過(guò)抑制野生型p53促進(jìn)SCD1轉(zhuǎn)錄水平。


圖4 URI通過(guò)抑制p53促進(jìn)SCD1轉(zhuǎn)錄


5、URI促進(jìn)癌細(xì)胞中野生型p53的泛素化和降解
       接下來(lái),作者將His-URI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到JHH1和HepG2細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)這種處理導(dǎo)致p53蛋白顯著減少,即使在Dox存在的情況下也是如此(圖5a)。為了探究URI介導(dǎo)的p53表達(dá)降低的分子機(jī)制,作者首先檢測(cè)了Ctrl和shURI細(xì)胞中p53的mRNA水平。作者的數(shù)據(jù)顯示,URI缺失不會(huì)影響p53的轉(zhuǎn)錄水平(圖5b)。應(yīng)激誘導(dǎo)的p53激活主要通過(guò)蛋白穩(wěn)定發(fā)生。作者進(jìn)一步探討URI是否調(diào)控p53蛋白的穩(wěn)定性。事實(shí)上,與對(duì)照細(xì)胞相比,使用環(huán)己亞胺(CHX)可以延長(zhǎng)JHH1-shURI細(xì)胞中p53的半衰期(圖5c)。URI缺失顯著降低了HepG2細(xì)胞中野生型p53的泛素化(圖5d)。
       由于URI不是E3泛素連接酶,作者假設(shè)URI可能會(huì)招募E3泛素連接酶來(lái)介導(dǎo)p53的泛素化。作者進(jìn)一步進(jìn)行了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析,并確定了潛在的URI結(jié)合蛋白,包括TRIM28、USP5、USP7和USP14,這些蛋白被報(bào)道可以調(diào)節(jié)p53的泛素化(圖5e)。為了驗(yàn)證LC-MS/MS的結(jié)果,作者通過(guò)免疫沉淀法測(cè)試了候選蛋白與URI的結(jié)合。結(jié)果顯示URI和TRIM28之間存在相互作用(圖5f),這與之前的研究結(jié)果一致。兩種不同的靶向TRIM28的siRNAs增加了p53蛋白水平,特別是在shURI細(xì)胞中(圖5g)。此外,TRIM28的敲低導(dǎo)致MG132處理下p53的泛素化降低(圖5h)。由于TRIM28與MDM2的結(jié)合有助于p53蛋白的穩(wěn)定性,作者探索URI是否會(huì)影響TRIM28與MDM2的相互作用。免疫沉淀顯示URI的缺失抑制了TRIM28-MDM2的形成(圖5i)。相反,URI的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了MDM2和TRIM28的合作(圖5j)。此外,URI缺失降低了TRIM28- MDM2 -p53復(fù)合物(圖5i, j),表明URI可能募集E3泛素連接酶TRIM28,促進(jìn)TRIM28- MDM2對(duì)p53蛋白泛素化的作用。體外通過(guò)GST-pull down實(shí)驗(yàn)確定URI是否與TRIM28直接相互作用。純化后的GST-URI與His-TRIM28之間的相互作用以濃度依賴性的方式顯著增加(圖5k)??傊髡叩难芯拷Y(jié)果表明URI與TRIM28相互作用并促進(jìn)TRIM28- MDM2 -p53復(fù)合物的形成,隨后泛素化p53。接下來(lái),作者確定URI/TRIM28對(duì)p53蛋白水平的調(diào)節(jié)是否對(duì)鐵死亡有功能影響。TRIM28的敲低顯著促進(jìn)索拉非尼誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過(guò)氧化(圖5l-n)。


圖5 URI通過(guò)與TRIM28相互作用促進(jìn)p53泛素化和降解


6、SCD1抑制劑與多納非尼在肝癌中的協(xié)同作用
       作者的上述數(shù)據(jù)表明,抑制SCD1可顯著逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)TKIs的耐藥性。作者推測(cè)TKIs和SCD1抑制劑聯(lián)合使用可能對(duì)p53野生型癌癥有效。Aramchol是一種新型的SCD1部分抑制劑,在一項(xiàng)2b期臨床試驗(yàn)中,與其他SCD1抑制劑相比,Aramchol已被證明是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的一種有希望的治療方法,且未導(dǎo)致嚴(yán)重不良事件。為了評(píng)估aramchol在體內(nèi)的安全性和抗腫瘤活性,作者使用了嚙齒動(dòng)物的異種移植模型。結(jié)果表明aramchol在小鼠模型中的安全性。
       Aramchol在體外對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有明顯的抑制作用(圖6a),與異種移植模型的結(jié)果一致。值得注意的是,在長(zhǎng)期克隆實(shí)驗(yàn)中,aramchol增強(qiáng)了p53野生型癌細(xì)胞對(duì)多納非尼的敏感性,多納非尼是一種氘化的索拉非尼衍生物,比索拉非尼更有優(yōu)勢(shì)(圖6b, c)。作者接下來(lái)研究了aramchol是否可以在HCC患者衍生的類器官(PDOs)中與多納非尼協(xié)同作用。作者也確定了PDOs中p53的狀態(tài)(圖6d)。與癌細(xì)胞系的結(jié)果相似,URI缺失顯著提高了多納非尼在p53野生型PDOs中的敏感性。多納非尼和aramchol聯(lián)合使用確實(shí)比單獨(dú)使用多納非尼表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用(圖6e-g)。此外,與單一藥物相比,聯(lián)合治療刺激了更高水平的脂質(zhì)過(guò)氧化,這表明aramchol在臨床前模型中促進(jìn)了多納非尼誘導(dǎo)的鐵死亡(圖6h)。相比之下,p53突變的PDOs對(duì)多納非尼的耐藥性更強(qiáng)。


圖6 SCD1抑制劑芳烴可增強(qiáng)多納非尼在癌細(xì)胞和患者源性類器官中的療效

       
       作者進(jìn)一步探討了聯(lián)合治療在體內(nèi)的治療效果(圖7a)。在HepG2-Ctrl和HepG2-shURI細(xì)胞異種移植的小鼠中,aramchol和多納非尼聯(lián)合使用可完全抑制腫瘤生長(zhǎng),而多納非尼單藥治療HepG2-shURI細(xì)胞的異種移植具有有效的治療作用(圖7b-d)。腫瘤切片的免疫組織化學(xué)化學(xué)分析進(jìn)一步顯示,aramchol和多納非尼治療小鼠的腫瘤中Ki67降低。此外,研究發(fā)現(xiàn),aramchol和多納非尼聯(lián)合使用可促進(jìn)SCD1和p53的協(xié)同喪失(圖7e, f)。綜上所述,這些結(jié)果表明SCD1抑制劑aramchol與多納非尼對(duì)肝癌具有協(xié)同致死性。
       考慮到臨床上TKIs主要用于晚期HCC患者。作者延遲給藥,以使HepG2異種移植物的腫瘤生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)拇笮。▓D7g)。再一次,聯(lián)合治療引起了明顯的腫瘤控制(圖7h, i)。此外,聯(lián)合治療顯著提高了腫瘤中的脂質(zhì)過(guò)氧化水平(圖7j)。因此,多納非尼和aramchol聯(lián)合使用可能會(huì)獲得顯著的臨床益處,特別是對(duì)于野生型p53的HCC患者。


圖7 SCD1抑制劑芳烴可增強(qiáng)多納非尼的體內(nèi)療效


7、URI和SCD1的高表達(dá)與HCC預(yù)后惡化和索拉非尼耐藥相關(guān)
       在作者之前的研究中,作者發(fā)現(xiàn)URI在HCC中高表達(dá)與腫瘤惡性和患者生存率低相關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí)URI-SCD1軸與臨床癌癥治療之間的功能聯(lián)系,作者首先利用組織顯微陣列,包括134例晚期HCC樣本(隊(duì)列A)。作者在這些樣本中進(jìn)行多重免疫組織化學(xué)/免疫熒光(mIHC/IF)檢測(cè)URI和SCD1表達(dá)。采用H-score法定量表達(dá),見(jiàn)材料和方法(圖8a)。在隊(duì)列A樣本中,URI表達(dá)與SCD1表達(dá)呈正相關(guān)(圖8b, c)。此外,作者根據(jù)URI和SCD1的表達(dá)將患者分為四組。通過(guò)Kaplan-Meier曲線(p < 0.0001, log-rank檢驗(yàn))顯示不同亞類間OS的顯著差異(圖8d)。URI和SCD1協(xié)同表達(dá)較高的患者風(fēng)險(xiǎn)最高,5年OS率為4.3% (HR, 2.65;95% CI, 1.76-3.98)而低URI和SCD1的患者為18.8%。這些結(jié)果表明URI和SCD1的聯(lián)合表達(dá)是HCC預(yù)后不良的一個(gè)非常有效的預(yù)測(cè)因子。
       由于作者的隊(duì)列A中沒(méi)有p53狀態(tài)數(shù)據(jù),為了進(jìn)一步研究URI-SCD1在不同p53狀態(tài)HCC患者中的作用,作者采用了Gao等人招募的一個(gè)新的HCC隊(duì)列,作者將其命名為“Fudan_HCC_cohort”。通過(guò)分析該隊(duì)列的WES和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),作者發(fā)現(xiàn)在p53-WT狀態(tài)的HCC患者中,URIlow腫瘤中的SCD1表達(dá)低于URIhigh腫瘤,而其他與鐵死亡相關(guān)的分子,如ACSL4、ALOX12、GPX4、SLC7A11AIFM2沒(méi)有明顯改變(圖8e)。此外,p53- WT型HCC患者中URI或SCD1的高表達(dá)與較差的臨床預(yù)后相關(guān)(圖8f, g)。綜上所述,這些結(jié)果表明,在野生型p53患者中存在URI-SCD1與HCC患者臨床預(yù)后之間的潛在相關(guān)性,而在p53突變型HCC患者中則不存在。
       為了進(jìn)一步探討URI-SCD1在索拉非尼耐藥中的作用是否與臨床相關(guān),作者在接受索拉非尼輔助治療的HCC患者隊(duì)列(隊(duì)列B)中檢測(cè)了URI和SCD1的表達(dá)。作者的數(shù)據(jù)顯示URI表達(dá)與SCD1表達(dá)密切相關(guān),與隊(duì)列A的結(jié)果一致
       然后,作者使用之前的隊(duì)列(命名為C隊(duì)列),該隊(duì)列納入了復(fù)發(fā)性HCC患者,然后患者接受含有索拉非尼的全身治療。45例患者為p53- WT, 1例患者攜帶p53同義體突變,作者也將其分組為p53- WT。免疫組化法檢測(cè)SCD1、URI、p53蛋白表達(dá)水平。該隊(duì)列中p53-WT患者的總生存率高于p53突變患者(圖8h)。作者發(fā)現(xiàn)在p53-WT組中SCD1與URI之間存在顯著相關(guān)性,而在p53-突變組中則沒(méi)有(圖8i-k)。同時(shí),在接受索拉非尼治療的p53-WT HCC患者中,較高水平的SCD1或URI與預(yù)后惡化相關(guān)(圖8i - o)。因此,作者的研究結(jié)果證明了URI-SCD1軸在p53-WT HCC患者索拉非尼耐藥中的重要作用。


圖8 URI聯(lián)合SCD1與晚期HCC患者生存差和索拉非尼耐藥相關(guān)


結(jié)論
       綜上所述,URI以TRIM28-MDM2依賴的方式維持低水平的p53,維持SCD1活性和MUFAs的積累,從而促進(jìn)癌細(xì)胞對(duì)TKIs的耐藥性。URI-p53-SCD1軸介導(dǎo)TKIs的耐藥,這可能解釋了為什么p53野生型HCC仍然對(duì)TKIs表現(xiàn)出內(nèi)在耐藥。此外,本研究確定的聯(lián)合治療可能代表了約41%具有野生型p53和高水平URI/SCD1的晚期HCC患者的一種有希望的策略(圖9)。本研究為作者后續(xù)的臨床試驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。


圖9 URI-p53-SCD1軸介導(dǎo)TKIs耐藥和芳烴再敏化肝癌細(xì)胞對(duì)TKIs的模型


實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng);人肝細(xì)胞癌衍生類器官的培養(yǎng);實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析;脂質(zhì)過(guò)氧化實(shí)驗(yàn);細(xì)胞增殖、菌落形成和活力測(cè)定;流式細(xì)胞術(shù);WB、免疫共沉淀和抗體;熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn);染色質(zhì)免疫共沉淀;腫瘤異種移植實(shí)驗(yàn);免疫組織化學(xué)和評(píng)分;多路復(fù)用免疫組織化學(xué)和免疫熒光;RNA測(cè)序;CUT&Tag庫(kù)建設(shè);LC-MS;靶向中、長(zhǎng)鏈脂肪酸定量;蛋白LC-MS/MS分析;DNA電泳;重組Myc-URI和His-TRIM28的生產(chǎn)。
參考文獻(xiàn)
Ding Z, Pan Y, Shang T, Jiang T, Lin Y, Yang C, Pang S, Cui X, Wang Y, Feng XF, Xu M, Pei M, Chen Y, Li X, Ding J, Tan Y, Wang H, Dong L, Wang L. URI alleviates tyrosine kinase inhibitors-induced ferroptosis by reprogramming lipid metabolism in p53 wild-type liver cancers. Nat Commun. 2023 Oct 7;14(1):6269. doi: 10.1038/s41467-023-41852-z. PMID: 37805657; PMCID: PMC10560259.