膀胱癌中TRMT6 / 61A依賴的堿基甲基化調控基因沉默活性和未折疊蛋白反應

       RNA修飾是RNA功能的重要調控元件。然而，大多數RNA修飾的全基因組圖譜都集中在信使RNA和轉移RNA上，但缺乏小RNA的此類數據集。在這里，作者繪制了細胞小RNA空間中的N1 -甲基腺苷（m1 A）。以合成的m1 - A RNA為基準，作者的工作流程確定了含有m1 - A的小RNA的特定組，否則不成比例地代表性不足。特別是，22個核苷酸長的3 ' tRNA片段高度富集于位于種子區(qū)的trmt6 / 61a依賴性m1 A。TRMT6/ 61a依賴性m1 - A負性影響trf -3的基因沉默。在TRMT6/61A過表達的膀胱尿路上皮癌中，檢測到tRF上較高的m1 A修飾，與tRF靶組失調相關。最后，TRMT6/61A調節(jié)參與未折疊蛋白反應的tRF-3靶點?？傊?，作者的研究結果揭示了通過小RNA的堿基修飾調節(jié)基因表達的機制。這篇文章于2022年4月發(fā)表于《Nature Communication》IF：16.6。
技術路線

技術路線圖

主要研究結果
1. 小RNA空間中m1A位點的系統(tǒng)制圖
       已知m1A會中斷常規(guī)的沃森-克里克A:U堿基配對（圖1a），并在為HTS準備文庫時導致逆轉錄酶（RT）停滯。該特性可用于通過m1A位置的錯配（錯誤結合）來繪制m1A位點。為了系統(tǒng)地繪制小RNA（<50個核苷酸長）中潛在的m1A位點，作者結合了兩種獨立的方法（圖1b）: m1A抗體富集，然后進行小RNA測序（m1A- rip -seq）和m1A誘導的錯配測序。為了首先確定用于標準小RNA測序的m1A兼容RT，使用具有單個m1A位點的合成小RNA測試了三種候選RT （protoscriptii -一種常用的M-MuLV RT，tgir -模板切換組II逆轉錄酶和工程HIV RT-1306）。選擇TGIRT和RT-1306進行測試是基于它們之前在測序含有m1a的mRNA和tRNA方面的成功。實驗流程（圖1c，左下）如下:小RNA先與3′端接頭連接，然后與5′端接頭連接，然后引物啟動RT反應生成cDNA，然后用覆蓋兩個接頭序列的引物進行PCR擴增。作者的策略確保只有可讀取的產品將被克隆并用于下游的錯配分析，以進行m1A修改估計。通過在RT步驟之前包括5 '接頭連接，作者消除了由于與PCR擴增的5 '引物缺乏互補性而導致任何RT延遲產物被克隆為截斷產物的可能性。這種方法對于小RNA是首先考慮的，因為它們通常只有幾個堿基不同，特別是對于trf。例如，18-nt tRF-3和22-nt tRF-3已被證明通過不同的機制調節(jié)LTR功能。使用這一工作流程，合成m1A位點的錯配指數（由A到T/G/C突變計算）對于TGIRT和RT-1306來說，在不同的m1A化學計量中都顯示出很高的靈敏度和動態(tài)范圍（圖1c）。然而，當m1A存在于<=60%的合成短RNA中時，通常用于短RNA測序的逆轉錄酶ProtoScriptII產生的錯配率低于5%（圖1c）。與TGIRT和RT-1306相比，克隆頻率較低，當100%的RNA具有m1A時可以看出（圖1d）。最后，當與m1A抗體富集（m1A- rip）結合使用時，TGIRT和ProtoScriptII都能夠檢測到插入細胞小RNA的合成m1A RNA的富集（圖1e）?；谏鲜龇治觯髡哌x擇了TGIRT來進一步鑒定內源性m1A小RNA。

圖1小RNA空間中m1A位點的系統(tǒng)制圖

2. 特異性tRNA衍生片段高度富集于m1A
       為了鑒定內源性含有m1A的小RNA，將m1A RIP應用于細胞中純化的短RNA。HEK293T細胞中m1A修飾的tRNA通過m1A RIP富集并洗脫成功（圖2a）。對于有一個堿基錯配的tRF reads， m1A RIP的富集更為突出，可能是在m1A修飾的位點（圖2b）。在microRNAs或其他小RNA中，m1A RIP未觀察到這種錯配相關的富集（圖2b）。在m1A RIP后，大多數含有錯配的tRF讀取具有A到C/G/T不匹配（細胞質tRF為90%，線粒體tRF為95%）（圖2b），表明修飾的（容易錯配的）腺苷特異性富集，最有可能是m1A。
       根據起始和結束位置，tRNA片段可以分為三組（圖2c）22，30，34:（1）映射到成熟tRNA的極端3 ' CCA端的tRF-3s，（2）映射到成熟tRNA的極端5 '端的tRF-5s，以及（3）包含前體tRNA的尾鏈序列（通常以poly-U結尾）的tRF-1s。成熟tRNA的3′端trf優(yōu)先被m1A抗體富集，而5′端trf相對microRNA輕度富集，tRF-1s不富集（圖2d， e）。此外，與18-nt tRF-3a相比，22-nt tRF-3b被m1A抗體特異性富集（圖2f），這表明只有22-nt而不是18-nt tRF-3s含有m1A。值得注意的是，tRF-3b（圖2f）的富集程度與峰值控制的m1A RNA（圖1e）相似。輸入樣品的TGIRT誤摻入特征也得到了m1A在特定trf -3上的位置和化學計量。在所有22 nt的tRF-3b的第四個位置（A4）觀察到最高的錯配率（圖3b， c）。這種高錯配率具有高度特異性:在tRF-3b的其他位置（圖3c）或18 nt的tRF-3a上沒有觀察到。有趣的是，一些microRNA被m1A RIP顯著富集（圖2d），但未能顯示位點特異性錯配模式，因此作者在本報告中沒有將它們報道為真正的含有m1A的小RNA（在Discussion中進一步討論）。這些都表明tRF-3b是含有m1a的小RNA。
       由于確定的大多數m1A位點都處于高化學計量，因此作者跳過了m1A RIP，僅使用TGIRT錯配特征來量化特定位點的m1A，以便進行以下分析。

圖2特異性tRNA衍生片段高度富集于m1A

3. 22個核苷酸3 ' tRNA片段上的m1A依賴于TRMT6/61A
       22-nt tRF-3b上的A4位置與成熟tRNA上的A58位置相對應（圖3a）。胞質tRNAs上的m1A58由異源二聚體酶復合物TRMT6/TRMT61A（或酵母中的GCD10/GCD14）催化。為了測試tRF-3b上的m1A是否由TRMT6/61A引入的修飾（可能在親本tRNA上），在TRMT6/61A敲低后評估了錯誤合并特征（圖3b-e）。當TRMT6/61A被敲除（圖3d）時，除了tRNAiMet中的trf -3外，m1a依賴的trf -3錯結合在全球范圍內減少（圖3b， c）。在HeLa和U251細胞中也觀察到siTRMT6/61A或單獨使用siTRMT61A的較低的tRF-3b A4錯摻率（圖3f）。盡管TRMT6/61A敲除后，攜帶ProtoScriptII的tRF-3b的克隆頻率顯著增加，但Northern blots未檢測到tRF-3b和tRNA的穩(wěn)態(tài)水平有任何變化（圖3g）。這證實了攜帶m1a的小RNA在這種常用的ProtoScriptII RT中代表性不足。

圖3 22個核苷酸3 ' tRNA片段上的m1A依賴于TRMT6/61A

4. m1A減弱了trf -3的基因沉默
       m1A在tRF-3上特定位置的存在提出了一種有趣的可能性，即它可能調節(jié)tRF-3的功能，特別是如果它涉及堿基配對或蛋白質結合。已經在多種生物學途徑中發(fā)現了trf -3，特別是依賴于引導小RNA（trf -3）與靶RNA之間堿基配對的基因沉默途徑（圖4a）。這些依賴ago的基因沉默機制可能受到tRF-3s 4位m1A的影響，該位置位于與目標RNAs25，45堿基配對所必需的種子區(qū)。
       為了直接測試m1A對tRF-3b基因沉默活性的影響，作者生成了雙熒光素酶報告基因，在Renilla熒光素酶基因的3 ' UTR中有tRF-3靶位，可以歸一化為螢火蟲熒光素酶信號（圖4b）。只有未經a4修飾的tRF-3b觸發(fā)了基因沉默，而m1a4修飾的tRF-3b則消除了這種基因沉默（圖4c-f）。對來自不同氨基酸群的四個不同的tRF-3b序列（tRNALeu的tRF-3009b， tRNAAla的tRF-3021b， tRNATyr的tRF-3030b和tRNAGln的tRF-3004b）觀察到這種效應。
       為了確保tRF的抑制不是過度表達的產物，作者還通過LNA（鎖定的核酸）敲低了內源性tRF-3?？箃RF-3021特異性地抑制了tRF-3021報告因子的活性（圖4）。同樣，tRF-3009、tRF-3030和tRF-3004報告基因活性被相應的LNAs去抑制（圖4h-j）。
       總的來說，這表明由于種子退火到靶mRNA的問題，m1A減弱了tRF-3b的基因沉默。

圖4 m1A減弱了trf -3的基因沉默

5. TRMT6 / 61A依賴性m1A不降低tRF-3b的Argonaute相關性
       由于tRF-3b上的m1A阻止了tRF-3b的沉默（圖4），作者測試了這種修飾是否降低了內源性trf -3與Ago2的關聯(lián)。為此，作者創(chuàng)建了一個穩(wěn)定表達flag - ha標記的Ago2的細胞系（圖5a）。tgrt -seq在前100個與ago2相關的小RNA中鑒定出了trf -3（圖5b）。敲除TRMT6/61A后（圖5c），與m1A修飾相對應的讀段錯配百分比在與ago2相關的片段中（a）減少，但在與ago2相關的片段中（b）相對于輸入片段而言，沒有增加或減少（圖5d）。因此，TRMT6/61A對兩個片段中trf -3上的m1A的調節(jié)是相同的。m1A修飾不排除tRF-3b進入與Argonaute的復合物。在敲除TRMT6/61A后，ago2相關部分中有幾種trf -3的少量（1-3倍）增加，但沒有超過FDR <0.05的閾值（圖5e）。相對于輸入部分，Ago相關部分中tRF-3水平沒有任何變化，這表明trmt6 /61依賴的m1A對tRF-3種子區(qū)域的修飾不會顯著影響Ago的直接結合。有趣的是，盡管在輸入和Ago結合的部分中，TRMT6/61A調節(jié)了總tRF-3b錯配（m1A修飾）的百分比（圖5d）。綜合來看，m1A修飾的tRF-3s不會降低它們的Ago關聯(lián)，因此基因沉默的衰減很可能是因為與目標mRNA的堿基配對減少（圖4）。

圖5 TRMT6 / 61A依賴性m1A不降低tRF-3b的Argonaute相關性

6. tRF-3b介導的m1a依賴性基因沉默變化
       引導RNA 2-4位的堿基配對對于ago介導的基因沉默至關重要45。tRF-3b上的m1A特異性位于第4位（圖2和圖3）。由于m1A阻斷了典型的A:U堿基配對，作者假設，m1A在tRF-3種子區(qū)與靶RNA的堿基配對減弱，解釋了含有m1A的tRF-3中觀察到的基因沉默活性降低（圖4）。為了驗證這一假設，作者首先通過圖6a總結的策略確定了可能受m1A狀態(tài)調節(jié)的潛在tRF-3靶RNA。作者確定了頂部ago2相關的tRF-3b中的哪些種子（圖6b）也是TRMT6/61A敲除后m1A修飾減少最多的種子，以確定最有可能遭受生物學上顯著的靶標預測干擾的種子（圖6c）。作者根據3 ' UTR中的互補性預測這些種子的靶標。RNA-seq顯示，當TRMT6/61A被敲除，tRF-3b在第4位被m1A低修飾時，這些種子的靶標比非靶標明顯受到抑制（圖6d）。
       預測具有8-mer和7-mer匹配的靶標比種子中與6-mer匹配的靶標受到更顯著的抑制（圖6d， e）。在siTRMT6/61A之后，分別通過qPCR驗證了最顯著抑制的8/7-mer tRF-3靶標（TIMP3， CREB3L2， MBTPS1， CDK19， HIPK2， HERPUD1， RMND5A， ELMOD2和HLTF）的抑制（圖6f）。
       為了證實這種基因抑制是由靶向3 ' UTR的tRF-3介導的，作者將具有單個進化保守的tRF-3靶向8-mer位點的內源性MBTPS1 3 ' UTR序列克隆到雙熒光素酶報告基因中。MBTPS1 3 ' UTR報告基因確實被siTRMT6/61A抑制（圖6g）。另一個8-mer靶基因CREB3L2也得到了類似的結果（圖6g）。這兩個8-mer位點均由種子序列“TCAAATCT”預測，由tRNAGln中的tRF-3b代表（圖6b）。與預測一致，通過從tRNAGln中過表達未經修飾的tRF-3004b可以模擬sitrmt依賴性抑制，而TRMT6/61A的表達不會減少（圖6h），而m1a修飾的tRF-3004b對3 ' UTR報告基因的抑制能力明顯較弱（圖6i）。綜上所述，tRF-3可以通過種子與目標3 ' UTRs配對來調節(jié)基因的全局表達，而這一過程受到tRF-3種子區(qū)m1A修飾的干擾。

圖6 tRF-3b介導的m1a依賴性基因沉默變化

7. 膀胱癌中trf - 3m1a水平及tRF-3靶點的改變
       據報道，一些tRNA修飾酶，包括TRMT6/61A，在幾種癌癥類型中顯著上調47。TRMT6上調在膀胱尿路上皮癌（BLCA）中是顯著的（圖7a）。最重要的是，通過western blotting檢測到腫瘤樣品中TRMT6和TRMT61A蛋白水平的顯著上調（圖7b， c）。
       TRMT6表達水平與tRF-3b整體m1A錯配水平呈正相關，并且在BLCA腫瘤樣本中m1A錯配顯著增加，這與TRMT6/ 61a較高的表達水平一致（圖7d， e）。與較高水平的干擾m1A修飾相一致，在作者的實驗數據中，與正常相比，通過種子-mer匹配預測的tRF-3b靶RNA在BLCA腫瘤樣本中比非靶點上調（圖7f）。組合種子和補充圖7e:單個種子）。此外，在TCGA BLCA數據中，TRMT6水平高的腫瘤誘導了tRF-3b靶點（圖7g）。有趣的是，在被siTRMT6/61A抑制的9個trmt3靶點中，有8個（圖6e）在TCGA膀胱患者樣本中與TRMT6的表達呈顯著正相關（圖7h）。綜上所述，這些結果表明TRMT6/61A調節(jié)腫瘤中tRF-3上的m1A水平，并且BLCA中TRMT6/61A的升高與腫瘤中tRF-3靶點的預期誘導有關。

圖7膀胱癌中trf - 3m1a水平及tRF-3靶點的改變

8. TRMT6/61A修飾tRF-3b對于維持未折疊蛋白的反應至關重要
       為了探索m1a依賴性tRF-3靶點的潛在生物學功能，作者通過RNA-seq數據的基因集富集分析，重點研究了siTRMT6/61A顯著下調和高trmt6腫瘤樣本中顯著上調的生物學途徑。針對1532個Reactome通路的富集分析在細胞系和患者數據中發(fā)現了7個重疊通路。其中一種途徑是未折疊蛋白反應或UPR（圖8a， b）。
       m1a依賴的tRF-3靶點，特別是MBTPS1（也稱為1位點蛋白酶或S1P）和CREB3L2，先前與UPR和蛋白質分泌有關48，49，這表明TRMT6/61A可能通過去抑制這些tRF-3靶點來幫助維持生長細胞中的UPR。MBTPS1 （S1P）因其切割和激活高爾基體上不同蛋白質底物的作用而聞名，包括轉錄因子ATF6和creb3l250，51，52。為了直接測試TRMT6/61A是否在內質網應激下調節(jié)UPR，作者使用了一個由最小啟動子驅動的熒光素酶報告子，該啟動子帶有內質網應激反應元件2 （ERSE2），可被ATF6轉錄因子53激活。報告顯示，正如預期的那樣，熒光素酶活性增加依賴于內質網反應元件和內質網應激（tunicamycin， Tm）。在HEK293T和T24膀胱癌細胞系中，TRMT6/61A敲低可顯著抑制UPR誘導的應激反應（圖8c）。轉染未修飾的tRF-3004b，而不轉染m1A修飾的tRF-3004b，相對于NT1和NT2非靶向RNA，可以降低UPR報告基因的活性（圖8d），這表明tRF-3b上的m1A狀態(tài)可以直接調節(jié)未折疊蛋白的反應。為了確保內源性tRF-3004b抑制參與UPR的靶基因，作者通過LNA敲低了內源性tRF-3004b，這在ER應激后顯著增加了靶細胞基因CREB3L2、HERPUD1、MBTPS1和HLTF的水平（圖8e、f）。總之，這表明trmt6 / 61a介導的trf -3上的m1A修飾對維持UPR穩(wěn)態(tài)很重要。

圖8 TRMT6/61A修飾tRF-3b對于維持未折疊蛋白的反應至關重要

結論
       最后，快速增殖的癌細胞通過激活促存活UPR來維持蛋白穩(wěn)態(tài)以減輕內質網應激。因此，UPR與癌癥特征的許多方面密切相關，并已成為有希望的治療靶點。先前已經注意到，在包括膀胱癌在內的幾種癌癥類型中，uprr相關基因在全球范圍內上調68。在這里，作者發(fā)現TRMT6/61A最可能通過修飾tRF-3來促進UPR，并去抑制tRF-3在UPR通路的ATF6分支中的靶點MBTPS1和CREB3L2。有趣的是，MBTPS1和CREB3L2可以被tRNAGln中的tRF-3004b靶向，tRNAGln是一種被發(fā)現在酵母中調節(jié)UPR的tRNA 69。當然，作者不排除TRMT6/61A通過修飾tRNA和mRNA對UPR產生額外影響的可能性。作者如何利用本文描述的機制使腫瘤細胞對促凋亡UPR敏感將是未來另一個有趣的研究課題。

實驗方法
細胞培養(yǎng)，RNA凈化，合成m1A RNA寡核苷酸，RIP免疫沉淀反應，小RNA-seq文庫制備，小RNA-seq圖譜和錯配分析，敲低TRMT6/61 A，Northern blot，雙熒光素酶報告試驗，鎖定核酸（LNA）敲除內源性tRF，RT-qPCR，RNA-seq文庫的制備和分析，蛋白提取和Western Blot，未折疊蛋白反應報告試驗。
參考文獻：
Su Z, Monshaugen I, Wilson B, Wang F, Klungland A, Ougland R, Dutta A. TRMT6/61A-dependent base methylation of tRNA-derived fragments regulates gene-silencing activity and the unfolded protein response in bladder cancer. Nat Commun. 2022 Apr 20;13(1):2165. doi: 10.1038/s41467-022-29790-8. PMID: 35444240; PMCID: PMC9021294.

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