新發(fā)現(xiàn)！GAP43依賴性線粒體轉(zhuǎn)移增強(qiáng)GBM致瘤性！

       完整線粒體在異質(zhì)細(xì)胞類型之間的轉(zhuǎn)移已在包括癌癥在內(nèi)的各種環(huán)境中得到證實(shí)。然而，線粒體轉(zhuǎn)移對(duì)腫瘤生物學(xué)的功能意義知之甚少。在這里，作者表明線粒體轉(zhuǎn)移是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）中普遍存在的現(xiàn)象，這是最常見(jiàn)和惡性的原發(fā)性腦腫瘤。該研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的水平線粒體轉(zhuǎn)移是增強(qiáng)GBM腫瘤發(fā)生的機(jī)制。這是由參與神經(jīng)元軸突再生和星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性的蛋白質(zhì)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（GAP43）促進(jìn)的。星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的獲得推動(dòng)線粒體呼吸的增加與增殖和與致瘤性相關(guān)的代謝途徑的上調(diào)。在功能上，星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的攝取促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展到增殖性G2/M期，并增強(qiáng)GBM的自我更新和致瘤性?？偟膩?lái)說(shuō)，研究結(jié)果揭示宿主-腫瘤相互作用，推動(dòng)癌細(xì)胞的增殖和自我更新，為治療開(kāi)發(fā)提供機(jī)會(huì)。本文于2023年5月發(fā)表在《Nature cancer》IF：22.7期刊上。
技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、GBM從微環(huán)境中獲取線粒體
       為評(píng)估非惡性宿主細(xì)胞是否可以在體內(nèi)將線粒體轉(zhuǎn)移到GBM中，該研究將表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的同基因小鼠GBM模型（SB28和GL261）原位植入表達(dá)與定位肽融合的線粒體定位的mKate2熒光基團(tuán)的轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠8（mito::mkate2小鼠;圖1a）。來(lái)自mito::mKate2小鼠的GBM腫瘤的共聚焦顯微鏡顯示在15-60%的GFP GBM細(xì)胞內(nèi)的mKate2⁺斑點(diǎn)（圖1b-f），表明宿主細(xì)胞線粒體是通過(guò)原位GBM腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)獲得的。為確定線粒體轉(zhuǎn)移是否發(fā)生在人體內(nèi)GBM的情況下，作者首先將高滴度mitoDsRed慢病毒注射到裸鼠的大腦中，以用線粒體熒光標(biāo)簽轉(zhuǎn)導(dǎo)正常腦細(xì)胞。7天后，在同一位置注射P3 GFP⁺人源性GBM干細(xì)胞（GSCs）（圖1g）。高分辨率共聚焦圖像證實(shí)線粒體從基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞，支持小鼠體內(nèi)數(shù)據(jù)（圖1g）。當(dāng)三維重建時(shí)，在GFP陽(yáng)性的受體細(xì)胞中存在mitoDsRed信號(hào)。

圖1 GBM細(xì)胞從TME獲得宿主線粒體

       為進(jìn)一步闡明主要線粒體供體細(xì)胞群的身份，作者將流行的腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞類型與GFP⁺ GBM細(xì)胞以1：2的供體：受體比例共培養(yǎng)。2小時(shí)后評(píng)估m(xù)Kate2⁺細(xì)胞作為線粒體轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的百分比（圖2a）。與體內(nèi)觀察一致，作者發(fā)現(xiàn)腦駐留的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞）在每個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上貢獻(xiàn)的線粒體明顯多于骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞具有更高的轉(zhuǎn)移率（圖2b）。雖然巨噬細(xì)胞進(jìn)一步極化為M2或M1表型可能有利于增加線粒體轉(zhuǎn)移，但平均而言，轉(zhuǎn)移程度比體外腦駐留神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞觀察到的程度低五到十倍。
       鑒于以前的觀察，星形膠質(zhì)細(xì)胞顯示出高速率的線粒體轉(zhuǎn)移到GBM小鼠模型，以及它們先前描述的在體內(nèi)與GBM的相關(guān)性，作者將后續(xù)研究重點(diǎn)放在該神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞群上。首先將mito-mCherry或mitoDsRed永生化的人星形膠質(zhì)細(xì)胞與六種不同的人源性GSC（L1，DI318，3832，GG16，P3和BG5）共培養(yǎng)3-4天，以探究其發(fā)現(xiàn)在人類疾病模型中的適用性。與小鼠GBM模型一樣，作者發(fā)現(xiàn)人類來(lái)源的GSC從星形膠質(zhì)細(xì)胞中獲得線粒體，流式細(xì)胞術(shù)顯示轉(zhuǎn)移率為5-40%（圖2c，d）。接著通過(guò)GSC的共聚焦顯微鏡證實(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的內(nèi)化，其中熒光蛋白標(biāo)記的線粒體完全在GSCs內(nèi)可視化，細(xì)胞質(zhì)預(yù)先用CellTrace染料標(biāo)記或表達(dá)GFP。使用圖1g得出的人原位GBM模型（P3）確認(rèn)星形膠質(zhì)細(xì)胞到人GBM的線粒體轉(zhuǎn)移在體內(nèi)是相關(guān)的。作者通過(guò)鑒定mitoDsRed⁺星形膠質(zhì)細(xì)胞（神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP⁺）和GFP^–）周圍GFP GBM細(xì)胞與轉(zhuǎn)移的mitoDsRed⁺線粒體（圖2e）。最后，通過(guò)共定位分析證實(shí)，用mito-mCherry標(biāo)記的轉(zhuǎn)移線粒體表達(dá)線粒體外膜20（TOMM20）的線粒體蛋白易位子，并且該蛋白分布在接收GBM細(xì)胞的線粒體網(wǎng)絡(luò)中?？傊?，作者觀察到線粒體在體內(nèi)和體外從TME轉(zhuǎn)移到GBM，并確定星形膠質(zhì)細(xì)胞是主要的線粒體供體。

圖2 GBM細(xì)胞從星形膠質(zhì)細(xì)胞中獲取線粒體

2、GAP43⁺ MTs促進(jìn)線粒體轉(zhuǎn)移
       作者認(rèn)為線粒體轉(zhuǎn)移可以通過(guò)分泌和/或細(xì)胞接觸進(jìn)行。為區(qū)分這兩種機(jī)制，將共培養(yǎng)物的線粒體轉(zhuǎn)移率與轉(zhuǎn)移的供體條件培養(yǎng)基的線粒體轉(zhuǎn)移率進(jìn)行比較（小鼠模型）或由5 μm多孔Transwell插入物隔開(kāi)的細(xì)胞（人體模型；圖3a）。無(wú)論采用何種分離方法，轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在供體和受體細(xì)胞物理接觸時(shí)，并且只有低水平的分泌物轉(zhuǎn)移接近測(cè)定的檢測(cè)限。表明這是一個(gè)主動(dòng)的、依賴于能量的過(guò)程，而不是一個(gè)被動(dòng)的事件。綜上所述，這些結(jié)果表明，有效線粒體轉(zhuǎn)移需要腫瘤和供體細(xì)胞的主動(dòng)物理相互作用，這與體內(nèi)腦腫瘤模型的成像一致（圖1和2）。
       MTs是GBM中細(xì)胞間通訊和網(wǎng)絡(luò)形成的既定渠道，因此也是線粒體轉(zhuǎn)移的潛在介質(zhì)。為可視化GBM細(xì)胞界面內(nèi)的線粒體，作者對(duì)TOMM20和肌動(dòng)蛋白的共培養(yǎng)免疫染色進(jìn)行共聚焦顯微鏡檢查。除核周定位外，在腫瘤細(xì)胞之間的MT連接中還發(fā)現(xiàn)線粒體（P3模型；圖3b），與先前的研究報(bào)告一致，即線粒體成分在體外定位在星形膠質(zhì)細(xì)胞和GBM細(xì)胞連接之間。它們的管內(nèi)位置由z堆棧確認(rèn)。重要的是，用肌動(dòng)蛋白免疫染色的mitoDsRed⁺星形膠質(zhì)細(xì)胞和GFP⁺ P3共培養(yǎng)物的共聚焦顯微鏡顯示MTs與mitoDsRed⁺線粒體連接兩種細(xì)胞類型。這些存在于轉(zhuǎn)移的線粒體附近（圖3c）。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞mitoDsRed⁺供體線粒體在連接的腫瘤受體細(xì)胞之間穿梭，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體可以在腫瘤-腫瘤連接的完整網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)一步交換（圖3c）。在可視化線粒體沿著含有肌動(dòng)蛋白絲的細(xì)胞間連接運(yùn)輸后，作者假設(shè)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架在促進(jìn)線粒體轉(zhuǎn)移方面至關(guān)重要。事實(shí)上，細(xì)胞松弛素B抑制肌動(dòng)蛋白聚合導(dǎo)致轉(zhuǎn)移速率顯著降低，而不影響細(xì)胞活力。相比之下，用長(zhǎng)春新堿抑制微管蛋白聚合對(duì)線粒體轉(zhuǎn)移沒(méi)有影響（圖3d）。

圖3 星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)基于肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞間連接將線粒體轉(zhuǎn)移到GBM

       先前的工作表明，GAP43促進(jìn)GBM細(xì)胞在體內(nèi)相互連接網(wǎng)絡(luò)的形成，這使得連接蛋白43介導(dǎo)的鈣波傳播成為可能。GAP43是一種肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白，可通過(guò)生長(zhǎng)錐促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)。作者設(shè)想GAP43也定位于共培養(yǎng)中GBM細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞投影（圖4a）。當(dāng)敲低GAP43在人源性GSC中的表達(dá)時(shí)，觀察到細(xì)胞投影的數(shù)量減少（圖4b，c）。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)GAP43在單獨(dú)的GSC中或同時(shí)在GSC和星形膠質(zhì)細(xì)胞中被敲低時(shí)，來(lái)自星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體轉(zhuǎn)移顯著減少（圖4d，e）。這些數(shù)據(jù)表明GAP43在促進(jìn)線粒體從星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到GBM中起作用。

圖4 GAP43通過(guò)腫瘤-星形膠質(zhì)細(xì)胞MTs促進(jìn)線粒體轉(zhuǎn)移

3、星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體代謝重編程GBM細(xì)胞
       假設(shè)從星形膠質(zhì)細(xì)胞接收整個(gè)細(xì)胞器將在受體GBM細(xì)胞中具有生物學(xué)上重要的下游功能后遺癥。作者通過(guò)對(duì)從共培養(yǎng)物中獲得（mKate2⁺）或沒(méi)有（mKate2^?）星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的分選小鼠GBM細(xì)胞進(jìn)行批量RNA測(cè)序（RNA-seq），探究線粒體轉(zhuǎn)移如何在轉(zhuǎn)錄上影響細(xì)胞。RNA-seq顯示共培養(yǎng)細(xì)胞中上調(diào)基因在與線粒體生物學(xué)相關(guān)的電子傳輸和線粒體組織途徑中富集。
       鑒于線粒體在ATP產(chǎn)生中的核心作用以及RNA-seq分析結(jié)果，作者探究功能性線粒體通過(guò)轉(zhuǎn)移的增加是否會(huì)導(dǎo)致代謝參數(shù)的可測(cè)量變化，特別是耗氧率。接著對(duì)GFP⁺受體細(xì)胞（P3模型）進(jìn)行線粒體應(yīng)激測(cè)試，與使用海馬系統(tǒng)的相同共培養(yǎng)物的對(duì)照細(xì)胞相比，來(lái)自mitoDsRed⁺星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體高和低轉(zhuǎn)移。測(cè)量基礎(chǔ)呼吸速率后，作者依次添加電子傳遞鏈抑制劑以評(píng)估最大呼吸能力的變化。有趣的是，基礎(chǔ)呼吸和最大呼吸速率均根據(jù)線粒體轉(zhuǎn)移而增加（圖5a-c）。當(dāng)根據(jù)基礎(chǔ)呼吸和糖酵解速率將細(xì)胞分成代謝亞組時(shí)，線粒體轉(zhuǎn)移量最高的細(xì)胞比轉(zhuǎn)移量較低的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞更有氧、更有活力（圖5d）。通過(guò)調(diào)整先前報(bào)道的代謝流式細(xì)胞術(shù)組合，作者進(jìn)一步表征一組GSCs在與人星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后的代謝譜。線粒體ATP合酶亞基ATP5A是受體GSCs中最一致的上調(diào)代謝蛋白之一（圖5e）和GBM的小鼠模型。接下來(lái)評(píng)估這些具有較高呼吸能力和ATP合酶水平的細(xì)胞是否產(chǎn)生更多的ATP。在多個(gè)人類來(lái)源的GBM模型中，作者通過(guò)發(fā)光報(bào)告測(cè)定法測(cè)量得到從星形膠質(zhì)細(xì)胞獲得線粒體的GBM細(xì)胞也具有更高水平的ATP（圖5f，g）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)移的星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體具有生物活性，并導(dǎo)致受體GBM細(xì)胞中線粒體呼吸和ATP產(chǎn)生增強(qiáng)。

圖5 星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的獲得通過(guò)受體GBM細(xì)胞中的線粒體呼吸增強(qiáng)ATP的產(chǎn)生

       線粒體可以通過(guò)調(diào)節(jié)不同的代謝途徑進(jìn)一步影響細(xì)胞生物學(xué)，并且越來(lái)越多的證據(jù)表明它們會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)磷酸化信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，作者對(duì)來(lái)自與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的分選GBM細(xì)胞進(jìn)行代謝物質(zhì)譜測(cè)定和584位點(diǎn)蛋白質(zhì)磷酸化陣列，以詢問(wèn)線粒體攝取的功能后果。代謝物富集分析顯示，GL2和SB261小鼠模型共享的mKate2⁺ GBM細(xì)胞中存在多種上調(diào)的代謝途徑（圖6a）。這些途徑包括氨基酸和核苷酸代謝，以前與GBM的增殖，自我更新和致瘤性有關(guān)。對(duì)分選的人源性L1細(xì)胞的代謝組學(xué)分析表明，mCherry⁺細(xì)胞的谷氨酸、α-酮戊二酸、谷胱甘肽和必需氨基酸的含量高于mCherry^?細(xì)胞（圖6b）。谷氨酸是谷胱甘肽中的三種氨基酸之一，谷胱甘肽是一種主要的細(xì)胞抗氧化劑，谷氨酸代謝是新生核苷酸合成中氮同化的主要途徑，可促進(jìn)膠質(zhì)瘤中的許多致癌過(guò)程。這表明線粒體的轉(zhuǎn)移可能有助于GBM細(xì)胞支持增殖并防止氧化應(yīng)激。磷蛋白陣列揭示接受星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的人源GSCs中許多信號(hào)蛋白和效應(yīng)蛋白磷酸化水平的變化，其中許多映射到增殖和細(xì)胞周期途徑（圖6c）。這些發(fā)現(xiàn)與受體細(xì)胞在線粒體呼吸增加之外的代謝重編程以及對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和其他過(guò)程具有潛在影響的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)一致。

圖6 星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體轉(zhuǎn)移重新編程GBM代謝

4、線粒體轉(zhuǎn)移增加GBM致瘤性
       為確定在獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的GBM細(xì)胞中觀察到的代謝和信號(hào)變化是否導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的改變，作者通過(guò)DNA染色和流式細(xì)胞術(shù)在多種人源GSC模型中對(duì)線粒體轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行細(xì)胞周期分析，觀察到在獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體后，細(xì)胞周期增殖G2/M期的細(xì)胞比例持續(xù)增加（圖7a，b）。當(dāng)分析mytho:: mKate2小鼠原位腫瘤的小鼠GBM模型時(shí)，這一觀察結(jié)果在體內(nèi)是一致的（圖7c，d）。此外，源自獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的分選細(xì)胞的原位小鼠GBM腫瘤具有更高的有絲分裂指數(shù)，表明增加的增殖表型在體內(nèi)保留。先前的報(bào)道表明，GSC可以吸收添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中的分離的無(wú)細(xì)胞線粒體。將星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生的線粒體添加到人衍生的GSC中足以概括細(xì)胞周期G2/M期細(xì)胞比例增加的情況（圖7e–g）。這些數(shù)據(jù)表明星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的轉(zhuǎn)移影響人類GBM模型中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。
       為進(jìn)一步評(píng)估線粒體獲取對(duì)自我更新的影響，作者使用含有和不含有星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的分選GBM細(xì)胞進(jìn)行限制性稀釋球體形成測(cè)定。發(fā)現(xiàn)在人類和小鼠GBM模型中，獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的細(xì)胞具有顯著更高的自我更新能力，表現(xiàn)為更高的估計(jì)干細(xì)胞頻率（圖7h）。雖然人類來(lái)源的GSC模型表達(dá)高水平的多能性轉(zhuǎn)錄因子SOX2，但隨后發(fā)現(xiàn)獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的GSC進(jìn)一步上調(diào)另一種自我更新的轉(zhuǎn)錄因子OCT4。這些發(fā)現(xiàn)表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體轉(zhuǎn)移由先前未描述的TME相互作用組成，該相互作用促進(jìn)GBM自我更新。
       增殖能力和自我更新的增加是癌癥的核心標(biāo)志；因此，作者假設(shè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體轉(zhuǎn)移促進(jìn)GBM的致瘤性。通過(guò)評(píng)估人源性GBM細(xì)胞的致死率（死亡時(shí)間或人道終點(diǎn)）和腫瘤起始能力來(lái)測(cè)試這一假設(shè)，這些細(xì)胞有或沒(méi)有通過(guò)原位植入免疫功能低下的小鼠獲得人星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體。這些研究表明，當(dāng)起源于從星形膠質(zhì)細(xì)胞獲得線粒體并且體內(nèi)腫瘤起始能力顯著更高的GSCs時(shí)，腫瘤導(dǎo)致癥狀或致命疾病的速度要快得多（圖7i，j）。這一觀察結(jié)果在小鼠GBM模型中相似。因此，除在體外改變GBM細(xì)胞的表型外，星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體轉(zhuǎn)移增加動(dòng)物模型中這些細(xì)胞的體內(nèi)致瘤性。
       綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體可以以GAP43依賴性方式水平轉(zhuǎn)移到膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，導(dǎo)致線粒體呼吸和代謝的變化，從而促進(jìn)增殖和腫瘤生長(zhǎng)。確定TME的線粒體轉(zhuǎn)移是GBM的基本促腫瘤生成機(jī)制。研究核心發(fā)現(xiàn)是從TME的非惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)移線粒體促進(jìn)了高度致瘤的細(xì)胞表型，其特征是增殖能力增加和自我更新（圖7k）。這表現(xiàn)為原位腫瘤在體內(nèi)具有更高的外顯率和更快的致死率。研究結(jié)果表明，顱內(nèi)腫瘤植入前星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體獲得驅(qū)動(dòng)的增殖和自我更新增加的表型足以導(dǎo)致致瘤性增加，而在實(shí)驗(yàn)性腫瘤起始時(shí)缺乏這種表型會(huì)導(dǎo)致GBM細(xì)胞增殖降低。因此，線粒體轉(zhuǎn)移和向氧化代謝的轉(zhuǎn)變包括GBM與其微環(huán)境的基本促腫瘤相互作用。研究為這一研究不足的過(guò)程增加了機(jī)制上的理解，為未來(lái)的研究奠定了基礎(chǔ)，這也可能廣泛適用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的腫瘤和其他病理背景。

圖7 星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體轉(zhuǎn)移驅(qū)動(dòng)GBM細(xì)胞增殖，自我更新和致瘤性

實(shí)驗(yàn)方法
慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，流式細(xì)胞術(shù)，裸鼠原位異種移植物模型，免疫熒光，體外小鼠線粒體轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，小鼠巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生和體外線粒體攝取測(cè)定，WB，ATP定量，代謝組學(xué)分析，磷蛋白陣列，RNA-seq，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和網(wǎng)絡(luò)可視化，線粒體分離
參考文獻(xiàn)
Watson D C, Bayik D, Storevik S, et al. GAP43-dependent mitochondria transfer from astrocytes enhances glioblastoma tumorigenicity. Nat Cancer. 2023; 4(5): 648-664. doi: 10.1038/s43018-023-00556-5