單細(xì)胞分析顯示與肺癌的分子和免疫亞型有關(guān)的預(yù)后成纖維細(xì)胞亞群

       成纖維細(xì)胞是一類未充分表征且在腫瘤進(jìn)展中具有多樣影響的細(xì)胞。本研究利用單細(xì)胞RNA測(cè)序、多重免疫組織化學(xué)和數(shù)字細(xì)胞學(xué)（CIBERSORTx）技術(shù)，在人類非小細(xì)胞肺癌中鑒定和表征了三個(gè)主要的成纖維細(xì)胞亞群：外膜、泡狀和肌成纖維細(xì)胞。泡狀和外膜成纖維細(xì)胞。肺泡和外膜成纖維細(xì)胞(在對(duì)照組織樣本中豐富)定位于組織學(xué)正常肺組織中離散空間小生境，并在肺腺癌（LUAD）中存在時(shí)表明改善了總體生存率。軌跡推斷確定了控制組織成纖維細(xì)胞激活的三個(gè)階段，導(dǎo)致腫瘤樣本中肌成纖維細(xì)胞的富集：首先炎性細(xì)胞因子的上調(diào)，然后應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)的激活，最終導(dǎo)致纖維蛋白原膠原的表達(dá)增加。肌成纖維細(xì)胞與LUAD的較差總體生存率相關(guān)，與上皮分化喪失、TP53突變、近端分子亞型和髓系細(xì)胞募集有關(guān)。在鱗癌中，肌成纖維細(xì)胞盡管在轉(zhuǎn)錄水平上是相同的，但并無(wú)預(yù)后價(jià)值。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)開(kāi)發(fā)成纖維細(xì)胞靶向癌癥治療策略具有重要意義。
       該研究于2023年1月發(fā)表在《Nature communications》，IF：17.694。

技術(shù)路線：

1、scRNA-seq數(shù)據(jù)計(jì)算鑒定成纖維細(xì)胞
       我們對(duì)人類肺組織樣本進(jìn)行了scRNA-seq（n = 18；六個(gè)對(duì)照組、七個(gè)鱗狀細(xì)胞癌[LUSC]和五個(gè)腺癌[LUAD]；圖1a），在組織解聚過(guò)程中富集成纖維細(xì)胞。鑒于樣本是從手術(shù)切除中獲取的，并非同時(shí)處理，我們?cè)u(píng)估了這是否在scRNA-seq數(shù)據(jù)中產(chǎn)生批次效應(yīng)，通過(guò)對(duì)來(lái)自各個(gè)患者收集的細(xì)胞之間的k最近鄰重疊進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)明顯增加的重疊，因此會(huì)影響聚類結(jié)果。為了減輕這個(gè)問(wèn)題，我們應(yīng)用了基于互補(bǔ)PCA（reciprocal PCA, rPCA）的數(shù)據(jù)整合方法。然后進(jìn)行聚類和差異基因表達(dá)分析。這識(shí)別出多個(gè)不同的間質(zhì)、免疫和上皮細(xì)胞群體（圖1c）。間質(zhì)細(xì)胞包括兩個(gè)單獨(dú)的簇：內(nèi)皮細(xì)胞（通過(guò)VWF等經(jīng)典標(biāo)記物標(biāo)記）和基質(zhì)細(xì)胞（通過(guò)DCN和DPT標(biāo)記）（圖1c）。
       為了研究成纖維細(xì)胞，我們檢查了基質(zhì)細(xì)胞簇。鑒于壁細(xì)胞是肺組織中突出的基質(zhì)細(xì)胞類型，并且在我們最初的聚類中沒(méi)有被鑒定出來(lái)，我們嘗試確定基質(zhì)細(xì)胞簇是否包含了成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞。這是很重要的，因?yàn)榧〕衫w維細(xì)胞通常通過(guò)表達(dá)參與細(xì)胞收縮的蛋白編碼基因（例如ACTA2 [編碼αSMA的基因]）來(lái)鑒定，這些基因在壁細(xì)胞中高度表達(dá)。為了區(qū)分這些細(xì)胞，我們使用人類肺細(xì)胞圖譜（HLCA）的scRNA-seq數(shù)據(jù)，識(shí)別在人類肺組織中成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞之間差異表達(dá)的基因（圖1e）。我們將這些標(biāo)記限制為先前描述的在多個(gè)小鼠器官中界定成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞的基因的人類同源基因，生成了成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞的一致基因標(biāo)記（圖1e）。為了確定這些基因標(biāo)記是否能夠有效區(qū)分壁細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，我們計(jì)算了它們?cè)贖LCA數(shù)據(jù)集中每個(gè)細(xì)胞的平均表達(dá)，顯示出99%的準(zhǔn)確性來(lái)識(shí)別這兩種細(xì)胞類型（圖1f、g）。然后，我們檢查了這些基因標(biāo)記在我們的數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況（圖1h-j），證明在基質(zhì)細(xì)胞簇中檢測(cè)到了壁細(xì)胞（n = 69）和成纖維細(xì)胞（n = 885）。為了進(jìn)一步測(cè)試在分析整個(gè)組織均質(zhì)化的腫瘤樣本時(shí)，成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞是否常常聚集在一起，我們?cè)诙鄠€(gè)公開(kāi)可用的數(shù)據(jù)集上重復(fù)了這個(gè)分析，始終觀察到類似的結(jié)果。
       總之，我們已經(jīng)確定了一種廣泛適用的方法，可以在scRNA-seq數(shù)據(jù)集中區(qū)分成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞，這是表征腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞（或壁細(xì)胞）異質(zhì)性的關(guān)鍵步驟。

2、NSCLC中存在三種成纖維細(xì)胞亞群
       由于成本、樣本可用性以及從組織中分離這些細(xì)胞的困難導(dǎo)致在scRNA-seq數(shù)據(jù)集中獲得足夠的樣本以實(shí)現(xiàn)成纖維細(xì)胞亞群的人群水平（跨多個(gè)患者）表征具有挑戰(zhàn)性，導(dǎo)致不同組織中的比例不一致。為了克服這個(gè)挑戰(zhàn)并全面研究非小細(xì)胞肺癌中成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性，我們?cè)趤?lái)自人類非小細(xì)胞肺癌和對(duì)照組織樣本的另外六個(gè)scRNA-seq數(shù)據(jù)集上重復(fù)了體外成纖維細(xì)胞分選的過(guò)程（排除壁細(xì)胞）。這產(chǎn)生了一個(gè)包含9673個(gè)成纖維細(xì)胞的數(shù)據(jù)集（圖2a；其中5183來(lái)自39個(gè)對(duì)照組織；3440來(lái)自46個(gè)LUAD樣本和654來(lái)自16個(gè)LUSC樣本）。為了整合和校正數(shù)據(jù)集之間的批次效應(yīng)，我們使用了經(jīng)典相關(guān)分析。然后，我們使用共享最近鄰模塊化優(yōu)化算法進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督聚類。為了確定最具生物學(xué)信息的聚類解決方案，我們?cè)诓粩嘧兓姆直媛蕝?shù)下運(yùn)行了這個(gè)分析，以逐步增加確定的聚類數(shù)，并檢查了每個(gè)聚類中識(shí)別的標(biāo)記基因的數(shù)量（樣本水平的平均對(duì)數(shù)折疊變化 > 1，調(diào)整p值 < 0.01，并由至少50%的樣本表達(dá)）。結(jié)果顯示出三個(gè)主要聚類一致地被確定，而更高分辨率的聚類則導(dǎo)致識(shí)別到不符合這些標(biāo)準(zhǔn)的聚類或只有極少數(shù)標(biāo)記基因（圖2b）。
       所確定的三個(gè)聚類與先前在對(duì)照肺組織中描述的成纖維細(xì)胞亞群一致（外膜、肺泡和肌成纖維細(xì)胞）。為了全面表征這些成纖維細(xì)胞亞群的人群水平特征，我們首先計(jì)算了每個(gè)亞群的樣本級(jí)基因表達(dá)譜，然后進(jìn)行差異基因表達(dá)分析（圖2c）；使用REACTOME通路進(jìn)行基因集變異分析（GSVA）（圖2d）以及使用先前描述的成纖維細(xì)胞亞群的基因標(biāo)記進(jìn)行GSVA。
       使用單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)了622個(gè)被肌成纖維細(xì)胞上調(diào)的基因，其中188個(gè)在樣本級(jí)別分析中仍具有顯著性（adj.P < 0.01）。從單細(xì)胞分析到樣本級(jí)別分析中標(biāo)記物識(shí)別的 減少表明，在樣本數(shù)量方面，確保scRNA-seq數(shù)據(jù)集具有足夠的能力來(lái)檢測(cè)人群水平的差異是非常重要的。肌成纖維細(xì)胞亞群的關(guān)鍵標(biāo)記物包括MMP11、POSTN、CTHRC1、COL1A1、ACTA2和COL3A1。GSVA顯示這些細(xì)胞在多個(gè)與生成膠原基質(zhì)相關(guān)的通路中顯著上調(diào)（圖2d），這與肌成纖維細(xì)胞在纖維化和腫瘤中的重要作用一致。除了涉及基質(zhì)生物合成的通路外，還有多個(gè)涉及細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的通路上調(diào)，包括整合素細(xì)胞表面相互作用和突觸蛋白相互作用（圖2d）。這些細(xì)胞還上調(diào)了多個(gè)先前描述的肌成纖維細(xì)胞和myoCAF基因標(biāo)記。
       差異表達(dá)分析使用單細(xì)胞數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了481個(gè)在外膜成纖維細(xì)胞中上調(diào)的基因，與其他亞群相比，其中73個(gè)基因在跨樣本的差異表達(dá)分析中仍然顯著——包括PI16、IGFBP6、MFAP5、APOD、PLA2G2A和GSN。GSVA確定了涉及前列腺素I2合酶（PTGIS）的多個(gè)通路的表達(dá)上調(diào)，包括前列腺素和膽酸/鹽的合成（圖2d），這對(duì)于從肺吞噬細(xì)胞中釋放膽固醇至關(guān)重要。另外，替代補(bǔ)體激活通路也顯著上調(diào)，涉及C3和CFD（圖2d）。周邊成纖維細(xì)胞還上調(diào)了與COL14A1 + 基質(zhì)成纖維細(xì)胞、PI16 + 'universal'成纖維細(xì)胞群以及胰腺癌和乳腺癌中描述的iCAF亞群相關(guān)的基因標(biāo)記物。
       對(duì)于肺泡成纖維細(xì)胞，單細(xì)胞差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)了672個(gè)上調(diào)基因，其中78個(gè)在樣本級(jí)別分析中仍具有顯著性，包括MACF1、RGCC、INMT、LIMCH1、A2M和GPC3。GSVA確定了TRP通道的上調(diào)（圖2d），這些通道可以檢測(cè)和傳導(dǎo)感覺(jué)信號(hào)（如氧化應(yīng)激、pH和熱量），將其轉(zhuǎn)化為化學(xué)或電信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)。涉及SLIT和ROBO基因家族成員的通路也上調(diào)（圖2d），這些通路在調(diào)節(jié)縱向軸突路徑選擇中發(fā)揮了重要作用，但也已被證明在關(guān)節(jié)炎中調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞遷移。肺泡成纖維細(xì)胞還上調(diào)了與COL13A1+基質(zhì)成纖維細(xì)胞群和肺特異性NPNT+成纖維細(xì)胞群相關(guān)的基因標(biāo)記。
       細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的生成和重塑是所有組織中成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵功能。與此一致的是，差異表達(dá)的基因在ECM成分中顯著富集（Fisher精確檢驗(yàn)p = 1.34e-62），其中31%的差異表達(dá)基因與基質(zhì)組分相關(guān)。因此，我們檢查了每個(gè)成纖維細(xì)胞亞群是否上調(diào)了與特定基質(zhì)組分相關(guān)的基因（基底膜、間質(zhì)膠原、ECM糖蛋白和蛋白聚糖；圖2e）。結(jié)果顯示，肌成纖維細(xì)胞在每個(gè)基質(zhì)組分中上調(diào)了多個(gè)基因，包括大部分上調(diào)的間質(zhì)膠原基因（圖2e）；肺泡成纖維細(xì)胞上調(diào)了與基底膜和ECM糖蛋白相關(guān)的多個(gè)基因；周邊成纖維細(xì)胞上調(diào)了多個(gè)ECM糖蛋白和蛋白聚糖（圖2e）。為了進(jìn)一步研究這些差異，我們計(jì)算了每個(gè)基質(zhì)組分的模塊分?jǐn)?shù)，并比較了它們?cè)诓煌衫w維細(xì)胞亞群中的整體表達(dá)水平（圖2）。結(jié)果顯示，與周邊和肺泡成纖維細(xì)胞相比，肌成纖維細(xì)胞顯著上調(diào)了間質(zhì)膠原的表達(dá)（圖2f）；而肺泡和肌成纖維細(xì)胞相比，周邊成纖維細(xì)胞顯示出基底膜基因的顯著增加表達(dá)（圖2g）。眾所周知，過(guò)度的膠原沉積是肌成纖維細(xì)胞的主要功能。為了確定這是否是這些細(xì)胞的病理特異性功能，我們檢查了從對(duì)照組織或腫瘤組織中分離的成纖維細(xì)胞亞群中特定基質(zhì)組分的表達(dá)是否存在差異。結(jié)果顯示，間質(zhì)膠原的表達(dá)在腫瘤樣本中的三個(gè)亞群中均顯著增加（圖2h）。
       這些結(jié)果表明，不同病理?xiàng)l件可能會(huì)導(dǎo)致成纖維細(xì)胞亞群內(nèi)的變異，這可能反映了它們的活化水平。為了進(jìn)一步研究這一點(diǎn)，我們?cè)诿總€(gè)亞群中對(duì)對(duì)照樣本和腫瘤樣本之間進(jìn)行了差異表達(dá)分析。這一分析確定了在與腫瘤相關(guān)的外膜成纖維細(xì)胞中下調(diào)的多個(gè)基因，包括IGFBP6、FABP4和DCN。相反，與對(duì)照組相比，與腫瘤相關(guān)的肌成纖維細(xì)胞中上調(diào)了多個(gè)基因，包括SULF1、COL11A1和LRRC15。我們還檢查了之前描述的CAF亞群的基因標(biāo)記是否在來(lái)自對(duì)照或腫瘤樣本的成纖維細(xì)胞中差異表達(dá)。預(yù)期的是，無(wú)論腫瘤亞型如何，腫瘤樣本中的myoCAF基因標(biāo)記都顯著上調(diào)（圖2i）。然而，與此相反，與腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞中iCAF基因標(biāo)記顯著下調(diào)，與對(duì)照組織相比（圖2j）。
       總而言之，這些數(shù)據(jù)顯示，在非癌性肺組織中識(shí)別出的三個(gè)主要亞群與NSCLC中的成纖維細(xì)胞一致，并且可能對(duì)ECM的維持/重塑具有不同的調(diào)控作用。這些數(shù)據(jù)還表明，與NSCLC腫瘤的相互作用導(dǎo)致了每個(gè)亞群內(nèi)基因表達(dá)的顯著變化，其中除了亞群特異性的表型變化外，還始終涉及間質(zhì)膠原的上調(diào)。此外，我們還表明，在NSCLC中，myoCAF基因標(biāo)記在肺成纖維細(xì)胞中上調(diào)，而iCAF基因標(biāo)記在對(duì)照肺組織中上調(diào)。

3、查看不同亞型的空間分布和豐度
       為了對(duì)通過(guò)scRNA-seq鑒定的三個(gè)成纖維細(xì)胞亞群進(jìn)行正交驗(yàn)證，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)多重免疫組織化學(xué)（mxIHC）面板。在這項(xiàng)分析中，我們使用人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Protein Atlas）來(lái)確定每個(gè)亞群的標(biāo)記基因，這些基因具有“增強(qiáng)型”抗體驗(yàn)證，表示在免疫組織化學(xué)或RNA測(cè)序中測(cè)量時(shí)具有一致的表達(dá)水平；并且已有文獻(xiàn)證明該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)（圖3a）。通過(guò)人類蛋白質(zhì)圖譜的圖像，經(jīng)咨詢病理學(xué)家篩選通過(guò)這些標(biāo)準(zhǔn)的基因在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況，選擇CD34、AOC3和POSTN或ACTA2（α-SMA）作為外膜、肺泡和肌成纖維細(xì)胞的最佳免疫組織化學(xué)標(biāo)記（圖3a）。此外，排除標(biāo)記物Pan-CK、CD31和MCAM（分別為上皮、內(nèi)皮和腔內(nèi)細(xì)胞標(biāo)記物）也被納入到mxIHC面板中。
       與先前定義的肺成纖維細(xì)胞表型命名一致，我們的mxIHC顯示肺泡和外膜亞群存在于對(duì)照（組織學(xué)正常）肺組織的這些區(qū)域（圖3b）。值得注意的是，AOC3+（肺泡）成纖維細(xì)胞也觀察到存在于間質(zhì)性肺組織中（圖3b），而CD34+（外膜）成纖維細(xì)胞也觀察到存在于周圍支氣管區(qū)域（圖3b）。然后，我們將該mxIHC面板應(yīng)用于NSCLC組織的整塊切片（15個(gè)LUAD和10個(gè)LUSC，包括我們的scRNA-seq隊(duì)列中的十個(gè)樣本）。如預(yù)期的一樣，我們鑒定出的三個(gè)成纖維細(xì)胞亞群顯示出離散的成纖維細(xì)胞亞群，并且每個(gè)亞群在分析的三種組織類型中均存在（對(duì)照、LUAD和LUSC；圖3c、d）。
       隨后，我們將該mxIHC面板應(yīng)用于NSCLC組織的整塊切片（15個(gè)LUAD和10個(gè)LUSC，包括來(lái)自我們的scRNA-seq隊(duì)列的十個(gè)樣本）。如預(yù)期的一樣，我們鑒定出的三個(gè)成纖維細(xì)胞亞群顯示出離散的成纖維細(xì)胞亞群，并且每個(gè)亞群在分析的三種組織類型中均存在（對(duì)照、LUAD和LUSC；圖3c、d）。
       為了在更大的隊(duì)列中研究這些成纖維細(xì)胞表型，使用CIBERSORTx介導(dǎo)的數(shù)字細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行分析，使用scRNA-seq數(shù)據(jù)生成了一個(gè)簽名矩陣，包括每個(gè)成纖維細(xì)胞亞群、內(nèi)皮細(xì)胞、腔內(nèi)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞。使用組合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組生成的偽批量數(shù)據(jù)集測(cè)試了該方法的準(zhǔn)確性，為每個(gè)偽批量樣本提供了基準(zhǔn)真值。這證實(shí)了對(duì)所有細(xì)胞類型的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，包括三個(gè)成纖維細(xì)胞亞群（R2 = 0.81 [外膜]，0.91 [肺泡]和0.92 [肌]；p < 3.53e-76）。
       我們檢查了對(duì)照、LUAD和LUSC組織樣本中每個(gè)亞群的相對(duì)豐度。在scRNA-seq數(shù)據(jù)集中，與LUAD和LUSC相比，外膜成纖維細(xì)胞在對(duì)照組織樣本中顯著更豐富（圖3e）。肺泡成纖維細(xì)胞在對(duì)照組織中同樣最豐富，但在一些LUAD樣本中也檢測(cè)到高水平，并且在LUSC中很少存在（圖3e）。相反，肌成纖維細(xì)胞在LUAD和LUSC中豐度增加，但在LUSC中相對(duì)于LUAD顯著更豐富（圖3e）。通過(guò)使用CIBERSORTx分析TCGA RNA-seq數(shù)據(jù)集（圖3g）來(lái)確認(rèn)這些成纖維細(xì)胞亞群與組織類型之間的關(guān)聯(lián)。然后通過(guò)mxIHC進(jìn)一步驗(yàn)證（圖3f），在分析中排除了組織塊中被困的非腫瘤組織（如圖3c所示）
       考慮到LUSC腫瘤中肌成纖維細(xì)胞的水平高于LUAD腫瘤，我們假設(shè)腫瘤亞型可能也會(huì)對(duì)相鄰組織產(chǎn)生不同的影響。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們使用mxIHC數(shù)據(jù)集比較了LUSC和LUAD病例的腫瘤鄰近組織區(qū)域。結(jié)果顯示，類似于腫瘤內(nèi)區(qū)域，與LUSC相鄰的肺部區(qū)域中的肌成纖維細(xì)胞增多，肺泡成纖維細(xì)胞減少，相比之下與LUAD相鄰的肺組織。然后，病理學(xué)家評(píng)估了這些腫瘤鄰近區(qū)域，以確定是否存在炎癥和/或纖維化的證據(jù)，發(fā)現(xiàn)55%的LUSC病例存在炎癥和/或纖維化，而LUAD中則不存在。當(dāng)按炎癥和/或纖維化的存在將這些對(duì)照組織區(qū)域分組時(shí)，肺泡和肌成纖維細(xì)胞的豐度也存在顯著差異。然而，在任何比較中，外膜成纖維細(xì)胞的豐度均沒(méi)有顯著差異。
       總之，對(duì)照肺組織富集了外膜和肺泡成纖維細(xì)胞亞群，而這些亞群在NSCLC中被肌成纖維細(xì)胞取代。此外，成纖維細(xì)胞亞群的豐度在NSCLC亞型之間也存在差異，LUAD腫瘤在這三個(gè)亞群之間的異質(zhì)性更大，而LUSC腫瘤的肌成纖維細(xì)胞水平始終較高。

4、用軌跡推斷研究MyoCAF的激活
       為了研究從富集于對(duì)照組織的肺泡和外膜成纖維細(xì)胞亞群向富集于腫瘤組織的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過(guò)程，我們對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行了軌跡推斷，使用擴(kuò)散映射降維方法。結(jié)果顯示，外膜和肺泡成纖維細(xì)胞可能作為獨(dú)立的祖細(xì)胞，可以進(jìn)行向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化（圖4a，b）。然后，我們將細(xì)胞按照“偽時(shí)間”排序，表示它們相對(duì)于肌成纖維細(xì)胞表型的進(jìn)展（圖4c）。通過(guò)分別檢查每個(gè)數(shù)據(jù)集，并使用Stouffer方法計(jì)算元p值，識(shí)別了偽時(shí)間上差異表達(dá)的基因。然后，基于在“偽時(shí)間”上的相關(guān)表達(dá)，將具有顯著差異表達(dá)的基因（經(jīng)過(guò)調(diào)整的元p值< 1 × 10?10，并且在至少三個(gè)數(shù)據(jù)集中的名義p值< 0.05）聚類成模塊。這在兩個(gè)軌跡上識(shí)別出了四個(gè)模塊，代表了轉(zhuǎn)分化的不同階段：祖細(xì)胞、早期激活、原始分化和分化（圖4d，e）。將分配給每個(gè)模塊的基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)軌跡之間存在顯著的重疊，表明無(wú)論前體亞群如何，肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過(guò)程是相似的（Fisher精確p值< 1.03e-10）。
       為了對(duì)這些轉(zhuǎn)分化階段進(jìn)行功能注釋，我們使用REACTOME通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析（圖4h）。早期激活模塊顯著富集了已知參與細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的基因（圖4h），并且還包含多個(gè)先前描述的iCAF標(biāo)記基因（例如IL6和CCL2）。值得注意的是，當(dāng)分析僅包含對(duì)照樣本或包含對(duì)照樣本和NSCLC樣本的數(shù)據(jù)集時(shí)，發(fā)現(xiàn)類似的表達(dá)模式（圖4f），這表明轉(zhuǎn)分化過(guò)程的這個(gè)階段可能獨(dú)立于與NSCLC腫瘤相關(guān)的刺激。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們根據(jù)細(xì)胞在偽時(shí)間中的位置，將scRNA-seq數(shù)據(jù)集中的所有成纖維細(xì)胞分為五個(gè)區(qū)間，然后計(jì)算每個(gè)模塊的表達(dá)的樣本平均值。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)分化過(guò)程的所有階段相比，對(duì)照樣本中的早期激活模塊在成纖維細(xì)胞中顯著增加，而在腫瘤樣本中顯著降低（圖4g）。
       相比之下，對(duì)于原始分化和分化模塊，偽時(shí)間上的表達(dá)趨勢(shì)在僅包含對(duì)照樣本或包含對(duì)照樣本和NSCLC樣本的數(shù)據(jù)集之間存在定性差異（圖4f）。因此，我們采用相同的方法來(lái)確定樣本類型對(duì)Proto-differentiation模塊的表達(dá)是否有影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)分化的中間階段，腫瘤樣本中這個(gè)模塊的表達(dá)顯著增加（圖4g）。這個(gè)模塊富集了許多編碼核糖體蛋白的基因（圖4h），這是肌成纖維細(xì)胞的一個(gè)良好描述的超結(jié)構(gòu)特征，可能表明這些細(xì)胞具有增加的蛋白質(zhì)翻譯能力。熱休克家族基因參與了HSF1轉(zhuǎn)錄激活（例如HSPA1A、DNAJB1和HSP90AB1），在這個(gè)模塊中也顯著富集（圖4h），先前的研究已經(jīng)顯示它們調(diào)節(jié)了腫瘤介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化。此外，與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的基因（如HIF1A、GGT和SERPINE1），這是熱休克應(yīng)激和成纖維細(xì)胞活化的已知驅(qū)動(dòng)因素，在這個(gè)模塊中也被發(fā)現(xiàn)。為了進(jìn)一步研究熱休克/應(yīng)激反應(yīng)在肌成纖維細(xì)胞活化中的作用，我們使用mxIHC檢查了HSPA1A/Hsp70的表達(dá)。結(jié)果顯示，在將位于腫瘤內(nèi)的細(xì)胞與腫瘤旁對(duì)照區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí)，每個(gè)成纖維細(xì)胞亞群中的HSPA1A/Hsp70表達(dá)顯著增加（圖4i），確認(rèn)與NSCLC腫瘤相關(guān)的刺激引起的熱休克反應(yīng)比來(lái)自對(duì)照組織的刺激更為明顯。
       與對(duì)照組織相比，分化模塊在所有轉(zhuǎn)分化階段的腫瘤組織中顯著增加（圖4g）。該模塊富集了參與膠原形成和細(xì)胞外基質(zhì)組織的基因（圖4h），與肌成纖維細(xì)胞表型一致，以及上述數(shù)據(jù)顯示與對(duì)照組織樣本相比，腫瘤樣本中纖維蛋白膠原的上調(diào)。
       綜上所述，這些結(jié)果表明，對(duì)照組織富集的兩個(gè)成纖維細(xì)胞亞群（外膜和肺泡）可能作為組織內(nèi)駐地的肌成纖維細(xì)胞的祖細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)還表明，不考慮祖細(xì)胞亞群，轉(zhuǎn)分化的過(guò)程是相似的：涉及短暫的炎癥基因上調(diào)階段，與腫瘤的直接相互作用無(wú)關(guān)；隨后是通過(guò)與腫瘤的相互作用增加的熱休克反應(yīng)信號(hào)介導(dǎo)的原始分化；最后形成完全分化的肌成纖維細(xì)胞表型，具有增強(qiáng)的細(xì)胞外基質(zhì)組織和膠原形成能力，該過(guò)程受到腫瘤相關(guān)刺激的顯著增強(qiáng)。

5、成纖維細(xì)胞表型的跨組織分析
       為了確定這些成纖維細(xì)胞表型是否在不同的癌癥類型中保持一致，我們分析了公開(kāi)可用的胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）和結(jié)直腸癌（CRC）的數(shù)據(jù)。在每種情況下，通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類和Mural cell的排除來(lái)識(shí)別成纖維細(xì)胞，如上所述（圖5a）。然后使用概率機(jī)器學(xué)習(xí)模型將這些細(xì)胞分類為在NSCLC中識(shí)別出的三個(gè)亞群（圖5b，c）。結(jié)果顯示，無(wú)論是PDAC（冠狀動(dòng)脈中位數(shù)概率=0.67），HNSCC（0.75），還是CRC（1），冠狀動(dòng)脈和肌成纖維細(xì)胞人群在所有分析的癌癥類型中都保持高度一致（肌中位數(shù)概率=1）。然而，被歸類為肺泡亞群的成纖維細(xì)胞具有更低的概率分?jǐn)?shù)（PDAC中位數(shù)概率=0.49，HNSCC=0.52，CRC=0.56），這表明它們與肺之間存在更大程度的表型分化。
       然后，我們通過(guò)將我們的多重免疫組織化學(xué)（multiplex IHC）面板應(yīng)用于由PDAC、HNSCC和CRC的腫瘤和對(duì)照組織核心組成的組織微陣列，來(lái)驗(yàn)證這些結(jié)果。與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，這顯示冠狀動(dòng)脈和肌成纖維細(xì)胞是每種癌癥類型中主要識(shí)別出的亞群（圖5d）。此外，與我們?cè)贜SCLC中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一樣，無(wú)論是PDAC、HNSCC還是CRC，冠狀動(dòng)脈成纖維細(xì)胞在對(duì)照組織中明顯更豐富，而肌成纖維細(xì)胞在腫瘤組織中更豐富（圖5e和圖5f）。
       為了測(cè)試肺泡表型是否特異于肺組織，我們對(duì)由特發(fā)性肺纖維化（IPF）樣本[15]（即非癌性肺病理）生成的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了類似的分析。結(jié)果顯示，在所有三個(gè)亞群中都高概率地識(shí)別出特發(fā)性肺纖維化樣本（中位數(shù)概率=0.95 [冠狀動(dòng)脈]，0.88 [肺泡]，0.90 [肌]）。值得注意的是，這種分析還顯示，與癌癥數(shù)據(jù)集中的肌成纖維細(xì)胞分類相比，IPF中的肌成纖維細(xì)胞分類概率較低，這表明癌癥和纖維化中的肌成纖維細(xì)胞可能存在細(xì)微的差異。

6、應(yīng)用多個(gè)非小細(xì)胞肺癌隊(duì)列進(jìn)行生存分析
       為了研究成纖維細(xì)胞亞群在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的臨床相關(guān)性，我們利用CIBERSORTx介導(dǎo)的數(shù)字細(xì)胞學(xué)的計(jì)算細(xì)胞豐度，對(duì)大規(guī)模的臨床注釋的NSCLC隊(duì)列進(jìn)行了分析（四個(gè)LUAD隊(duì)列，n = 1669；四個(gè)LUSC隊(duì)列，n = 1104）。我們使用每個(gè)成纖維細(xì)胞亞群的相對(duì)豐度進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸建模。結(jié)果顯示，在LUAD中，肌成纖維細(xì)胞與較差的總體生存率之間存在一致的關(guān)聯(lián)（p < 0.01），但在LUSC中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性。鑒于肌成纖維細(xì)胞在這兩種NSCLC亞型中豐度高，我們推測(cè)這種差異可能是由于亞型之間的表型變化。然而，通過(guò)樣本水平的分析未能發(fā)現(xiàn)任何顯著差異表達(dá)的基因，這表明這兩種NSCLC亞型中的肌成纖維細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組水平上的表型差異很小。
       為了研究在LUAD中使用肌成纖維細(xì)胞豐度作為患者分層的預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力，我們使用TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集作為測(cè)試隊(duì)列，確定將樣本分為肌成纖維細(xì)胞高（> 85.2%）和低（< 85.2%）的最佳閾值（圖6a-c）。然后將這個(gè)閾值應(yīng)用于三個(gè)驗(yàn)證隊(duì)列，結(jié)果顯示始終存在顯著的患者分層效果（log-rank p ≤ 0.02；圖6d）。多變量Cox回歸分析還表明，這些預(yù)后相關(guān)性與疾病階段和患者年齡無(wú)關(guān)（p < 0.0001，HR [95% CI] = 1.70 [1.38, 2.09]；圖6i）。
       相反，肺泡和冠狀動(dòng)脈成纖維細(xì)胞的豐度與多個(gè)LUAD數(shù)據(jù)集中更好的總體生存率相關(guān)。這種關(guān)聯(lián)尤其在肺泡成纖維細(xì)胞中非常一致，在所有分析的數(shù)據(jù)集中都顯著（p < 0.01）。因此，我們采用上述相同的方法，測(cè)試將LUAD隊(duì)列作為肺泡成纖維細(xì)胞高（> 22.0%）或低（< 22.0%）進(jìn)行分組的潛力作為預(yù)后標(biāo)志物（圖6e-g）。結(jié)果同樣顯示，將LUAD隊(duì)列按肺泡成纖維細(xì)胞的豐度分為高和低，能夠有效地分層總體生存率（log-rank p < = 0.02；圖6h）；并且這種關(guān)聯(lián)與疾病階段和患者年齡無(wú)關(guān)（圖6j）。

7、研究LUAD與關(guān)鍵預(yù)后特征的相關(guān)性
       已知，LUAD腫瘤的形態(tài)亞型與患者的生存率相關(guān)。根據(jù)CIBERSORTx（n = 623，p < 0.0001；圖7b）、scRNAseq（n = 21；圖7c）和mxIHC（n = 15；圖7a，d）的結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞亞群的豐度在LUAD的形態(tài)亞型之間存在顯著差異。與中度/良分化（G1/G2；鱗狀、腺泡和乳頭狀）的腫瘤相比，肌成纖維細(xì)胞在差分化較差（G3；實(shí)性或微乳頭狀）的腫瘤中增加。盡管存在這種關(guān)聯(lián)，成纖維細(xì)胞亞群的豐度仍然是多元Cox回歸中的一個(gè)重要獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，包括年齡、分期和分級(jí)作為協(xié)變量（肌成纖維細(xì)胞：HR [95% CI] = 1.44 [1.07, 1.95]，adj.P = 0.015；肺泡成纖維細(xì)胞：HR [95% CI] = 0.67 [0.46, 0.96]，adj.P = 0.028；n = 601）。
       LUAD腫瘤內(nèi)部的形態(tài)可以具有異質(zhì)性。因此，我們利用我們的MxIHC數(shù)據(jù)集來(lái)研究成纖維細(xì)胞亞群與特定形態(tài)模式之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肌成纖維細(xì)胞與實(shí)性生長(zhǎng)模式在腫瘤中所占比例之間存在顯著相關(guān)性（rho = 0.60，p < 0.01）；肌成纖維細(xì)胞明顯是混合形態(tài)腫瘤實(shí)性區(qū)域中的主要基質(zhì)細(xì)胞類型。與微乳頭狀生長(zhǎng)模式之間存在較弱且不顯著的相關(guān)性（rho = 0.44，p = 0.07）
       先前的研究已經(jīng)描述了LUAD的形態(tài)亞型和分子亞型（近端-炎癥性[PI]、近端-增殖性[PP]和末端呼吸單位[TRU]）之間的關(guān)聯(lián)。我們?cè)诖髽颖窘M織數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證了這一關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)77%的TRU腫瘤為中度/良分化（G1/G2），而69%的PP腫瘤為差分化較差（G3）。符合這種關(guān)聯(lián)的預(yù)期，肌成纖維細(xì)胞在PP腫瘤中豐度最高，而肺泡和外膜成纖維細(xì)胞在TRU腫瘤中最為突出（圖7f）。此外，與先前描述的PP腫瘤與TP53突變之間的關(guān)聯(lián)一致，我們還發(fā)現(xiàn)在攜帶TP53突變的LUAD腫瘤中，肌成纖維細(xì)胞的豐度增加（圖7e）。
       我們還使用CIBERSORTx來(lái)檢查免疫細(xì)胞亞群（LM22-57）的豐度以及它們與成纖維細(xì)胞亞群之間的相關(guān)性。這顯示了與肌成纖維細(xì)胞和肺泡成纖維細(xì)胞相關(guān)的免疫細(xì)胞之間的反向關(guān)系，在所有分析的LUAD轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中一致觀察到（圖7g）。結(jié)果顯示，肺泡成纖維細(xì)胞與多個(gè)靜息型免疫細(xì)胞亞群呈正相關(guān)（圖7g，例如肥大細(xì)胞、CD4 + 記憶T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞），還包括單核細(xì)胞和B細(xì)胞（記憶型和未經(jīng)刺激的亞群）。相反，肌成纖維細(xì)胞與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞和活化CD4 + 記憶T細(xì)胞呈正相關(guān)（圖7g）。這表明，在腫瘤微環(huán)境中，肌成纖維細(xì)胞的分化也與輔助T細(xì)胞和髓系細(xì)胞的激活/分化相關(guān)聯(lián)。

實(shí)驗(yàn)方法
scRNA-seq數(shù)據(jù)處理與分析、成纖維細(xì)胞的鑒定、多重免疫組織化學(xué)(MxIHC)、多重序列優(yōu)化和驗(yàn)證、多重圖像生成、多重圖像分析、基質(zhì)細(xì)胞鑒定和組織細(xì)胞計(jì)數(shù)法、空間分析、批量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析、利用CIBERSORTx進(jìn)行數(shù)字細(xì)胞學(xué)分析、生存分析、統(tǒng)計(jì)分析。

參考文獻(xiàn)
Hanley, C.J., Waise, S., Ellis, M.J. et al. Single-cell analysis reveals prognostic fibroblast subpopulations linked to molecular and immunological subtypes of lung cancer. Nat Commun 14, 387 (2023).