人胰島的單核 RNA 測序識別新基因組 并區(qū)分具有動態(tài)轉(zhuǎn)錄組概況的 β 細(xì)胞亞群

???

單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 為人類胰島細(xì)胞類型及其相應(yīng)的穩(wěn)定基因表達(dá)譜提供了寶貴的見解。然而，這種方法需要細(xì)胞解離，這使其在體內(nèi)的應(yīng)用變得復(fù)雜。另一方面，單核 RNA 測序 (snRNA-seq) 與冷凍樣品兼容，消除了解離誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄應(yīng)激反應(yīng)，并提供了可用于識別前體 mRNA 轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子序列的增強信息。作者使用snRNA-seq分析顯示人胰島內(nèi)分泌細(xì)胞體外和體內(nèi)差異選擇性表達(dá)前四位的基因不是經(jīng)典基因，而是一組新的非經(jīng)典基因標(biāo)記，包括ZNF385D、TRPM3、LRFN2、 PLUT（β細(xì)胞）； PTPRT、FAP、PDK4、LOXL4（α-細(xì)胞）； LRFN5、ADARB2、ERBB4、KCNT2（δ 細(xì)胞）；和 CACNA2D3、THSD7A、CNTNAP5、RBFOX3（γ 細(xì)胞）。其次，通過整合來自人胰島細(xì)胞的 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的信息，我們區(qū)分了三個 β 細(xì)胞亞群：INS pre-mRNA 群 (β3)、中間 INS mRNA 群 (β2) 和 INS富含 mRNA 的簇 (β1)。這些顯示不同的基因表達(dá)模式，代表體外和體內(nèi)不同的生物動態(tài)狀態(tài)。有趣的是，富含 INS mRNA 的簇 (β1) 成為體內(nèi)主要的亞簇。綜上所述，人胰島細(xì)胞的 snRNA-seq 和 pre-mRNA 分析可以準(zhǔn)確識別人胰島細(xì)胞群、亞群及其體內(nèi)動態(tài)轉(zhuǎn)錄組概況。

該研究于2023年5月發(fā)表發(fā)表在《Genomemedicine》，IF：15.266。

技術(shù)路線：

實驗方法：人胰島細(xì)胞和細(xì)胞核加工、人胰島細(xì)胞移植、scRNA-Seq、snRNA-Seq、無監(jiān)督數(shù)據(jù)分析、偽時間分析和RNA速度分析、通路分析、RNA原位雜交。

1、人胰島細(xì)胞和細(xì)胞核的RNA-seq分析

圖1A和B描述了用于這些研究的方法和數(shù)據(jù)分析工作流程。

作者分析了10,732個細(xì)胞和11,018個核。與scRNA-seq方法(圖1C)相比，snRNA-seq方法中每個細(xì)胞的基因和讀數(shù)測序的數(shù)量較低。在細(xì)胞核中測序的線粒體基因的TE百分比低于1%，明顯低于在細(xì)胞制備中測序的線粒體基因(圖1C)。在snRNA-Seq數(shù)據(jù)中，當(dāng)分析內(nèi)含子加外顯子讀取時，基因和讀取的數(shù)量明顯高于單獨的外顯子讀取(圖1D)。

基于上述數(shù)據(jù)質(zhì)量，我們接下來將使用外顯子讀取的scRNA-seq與使用內(nèi)含子和外顯子讀取的snRNA-seq進行比較，以改進基因檢測和映射。scRNA-seq分析核轉(zhuǎn)錄本和細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄本，其中大部分是細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄本，而snRNA-seq分析的主要是核轉(zhuǎn)錄本，而在細(xì)胞核分離過程中，來自細(xì)胞質(zhì)或粗糙ER的轉(zhuǎn)錄本最少。因此，我們預(yù)計，在scRNA和snRNA測序過程中，RNA-seq讀數(shù)會不同。在細(xì)胞中，17±0.7%的讀數(shù)為內(nèi)含子讀出，而在細(xì)胞核中為53±1.9%。另一方面，細(xì)胞中73±1.6%的讀出為外顯子讀出，而細(xì)胞核中為32±0.8%。因此，只有當(dāng)核與核或細(xì)胞與細(xì)胞進行比較時，基因表達(dá)相關(guān)性才會完全或接近完全線性(圖1E)，而當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞核相比時，這種相關(guān)性較低(圖1F)。

兩種RNA測序方法(UMI>20)檢測到的共同基因數(shù)量為16,452個(71.3%)，而1433個基因(6.2%)僅在scRNA-seq中檢測到，5184個基因(22.5%)僅在snRNA-seq中檢測到(圖1G)。表明兩種方法檢測到的幾乎29%的基因?qū)τ谙嗤娜艘葝u樣本是不同的，兩種RNA測序方法可能揭示了胰島細(xì)胞群體的同一性。

有趣的是，用Seurat的整合算法，使用外顯子讀數(shù)(scRNA-seq)或內(nèi)含子加外顯子讀數(shù)(snRNA-seq)對細(xì)胞和細(xì)胞核進行無監(jiān)督聚類，揭示了具有相似位置且在其UMAP中具有強烈重疊的簇（圖1H，I）。

2、使用scRNA-seq和snRNA-seq對人類胰島細(xì)胞類型進行監(jiān)督分類

我們將scRNA-seq和snRNA-seq數(shù)據(jù)集投影到一個公開可用的Azimuth整合人類胰腺參考文獻中，該參考文獻包含六個不同的scRNA-seq數(shù)據(jù)集，這些數(shù)據(jù)集是使用Seurat的幾種不同單細(xì)胞技術(shù)生成的（圖1B和2A-D）。投影是通過scRNA-seq的外顯子讀數(shù)（圖2A、B）和snRNA-seq的外顯子或內(nèi)含子加外顯子讀數(shù)（圖2C、D）完成的。當(dāng)我們將當(dāng)前研究的人類胰島scRNA-seq數(shù)據(jù)投影到參考上時，我們發(fā)現(xiàn)不同的人類胰島細(xì)胞群幾乎完美對齊，預(yù)測分?jǐn)?shù)中位數(shù)為1，平均值為0.948（圖2A，B）。使用外顯子讀數(shù)或內(nèi)含子加外顯子讀數(shù)將snRNA-seq數(shù)據(jù)投影到參考也導(dǎo)致高度對齊（圖2C，D），外顯子加內(nèi)含子的預(yù)測分?jǐn)?shù)顯著高于單獨外顯子（圖2D）。為了確定觀察到的與外顯子加內(nèi)含子讀取的參考比對的更高概率是否可以用不同的UMI深度來解釋，我們對包含內(nèi)含子的庫進行二次采樣，中值為1247 UMI（外顯子只讀庫的中值）并分析了參考對齊預(yù)測分?jǐn)?shù)。我們發(fā)現(xiàn)在二次采樣后，包含內(nèi)含子的文庫的比對預(yù)測分?jǐn)?shù)仍然優(yōu)于僅包含外顯子的文庫。這進一步驗證了使用來自內(nèi)含子和外顯子讀取的信息，并使用snRNA-seq對人類胰島細(xì)胞群進行詳細(xì)分析。數(shù)據(jù)還表明，來自scRNA-seq和snRNA-seq的人類胰島細(xì)胞簇具有高度相似性，并且用于鑒定人類胰島細(xì)胞類型簇時，包含內(nèi)含子和外顯子讀數(shù)的snRNA-seq數(shù)據(jù)可與scRNA-seq數(shù)據(jù)可以互換。

接下來，我們測試了從scRNA-seq和snRNA-seq數(shù)據(jù)（圖2A、C）生成的不同簇與不同內(nèi)分泌細(xì)胞簇中典型基因的基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)（圖2E-H）。在scRNA-seq中觀察到已建立的典型基因細(xì)胞標(biāo)記（GCG、INS、SST和PPY）與其他幾種已知選擇性標(biāo)記與α-、β-、δ-和γ-細(xì)胞之間的強相關(guān)性。因此，在scRNA-seq分析中相應(yīng)地分配了UMAP中的細(xì)胞類型（圖2E，G）。然而，在scRNA-seq中觀察到的這些典型基因標(biāo)記的強相關(guān)性在snRNA-seq中對于α-、β-和γ-細(xì)胞較弱（圖2F，H）。例如，在β細(xì)胞中，INS和IAPP是差異表達(dá)最多的基因，而在snRNA-seq數(shù)據(jù)集中它們不是差異表達(dá)最多的基因。這些結(jié)果強調(diào)需要鑒定新的基因組作為胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)記，以便在snRNA-seq分析中更恰當(dāng)?shù)囟x它們。

3、用于鑒定人胰島內(nèi)分泌細(xì)胞類型的snRNA-seq數(shù)據(jù)集中的新基因集

在scRNA-seq和snRNA-seq樣本之間進行了差異基因表達(dá)分析，并研究了snRNA-seq富集基因的生物型。即使包含內(nèi)含子讀數(shù)，snRNA-seq中的大多數(shù)基因都是蛋白質(zhì)編碼基因（圖3A）。接下來，注釋了snRNA-seq數(shù)據(jù)，并投影到Azimuth的人類胰腺參考上，并用整個數(shù)據(jù)集測試了每個簇的差異基因表達(dá)（圖1B）。使用這種方法，每個細(xì)胞簇中差異表達(dá)的基因被鑒定為p值~0和log2FC大于1.5。即使候選基因符合這些標(biāo)準(zhǔn)，我們也忽略了在其他細(xì)胞簇中表現(xiàn)出相當(dāng)大的表達(dá)(log2FC>0.85)的基因。因此，制作了一個表，其中包含每種細(xì)胞類型的前四個差異表達(dá)基因（圖3B）。有趣的是，scRNA-seq中定義內(nèi)分泌細(xì)胞的前四個差異表達(dá)基因（即INS、GCG、STS或PPY）都沒有出現(xiàn)在snRNA-seq中差異和選擇性表達(dá)基因的簡短列表中。這表明這些典型基因不是snRNA數(shù)據(jù)集中在α-、β-、δ-和γ細(xì)胞中差異表達(dá)最高的基因。為了確認(rèn)這些新鑒定的內(nèi)分泌細(xì)胞基因標(biāo)記的可靠性，我們在snRNA-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)對象上測試了它們。它們在snRNA-seq和scRNA-seq的相應(yīng)細(xì)胞簇中顯示出清晰且主要是排他性的表達(dá)模式，但在snRNA-seq數(shù)據(jù)集中具有更高的表達(dá)（圖3C，D）。

前幾個內(nèi)分泌細(xì)胞基因標(biāo)記顯示出比其相應(yīng)的典型單細(xì)胞聚類基因標(biāo)記更具特色的定位模式，分別用于snRNA-seq數(shù)據(jù)對象中的α-、β-、δ-和γ-細(xì)胞（圖2H和3E）。值得注意的是，CNTNAP5在γ細(xì)胞中沒有表現(xiàn)出高度不同的表達(dá)模式，但它被認(rèn)為是基于高調(diào)整p值(1.58×10-5)和log2FC為1.654的γ細(xì)胞基因標(biāo)記。有趣的是，在非內(nèi)分泌細(xì)胞的snRNA-seq分析中，差異表達(dá)最高的基因包含在scRNA-seq中定義這些細(xì)胞類型的典型基因標(biāo)記（REG1A、CFTR、FLT1、COL1A1和PRKG1，用于腺泡、導(dǎo)管、內(nèi)皮、分別為激活的星狀細(xì)胞、靜止的星狀細(xì)胞）。這表明人類內(nèi)分泌細(xì)胞和非內(nèi)分泌細(xì)胞之間關(guān)于規(guī)范基因的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄本豐度的有趣二分法（圖3F）。

為了驗證這些來自snRNA-seq分析的新鑒定的基因作為細(xì)胞標(biāo)記的存在，我們聚焦于β細(xì)胞，并使用RNA顯微鏡檢測來自健康捐贈者的分散的人胰島細(xì)胞中的ZNF385D mRNA。如圖3G所示，ZNF385D mRNA在人β細(xì)胞中明顯且唯一地被檢測到。使用內(nèi)含子探針的表達(dá)僅限于細(xì)胞核(圖3G，上圖)，而使用外顯子探針的信號定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(圖3G，下圖)。

4、比較scRNA-seq和snRNA-seq分析在區(qū)分三種不同的β細(xì)胞亞型時的異同

為了識別β細(xì)胞簇中的人類β細(xì)胞亞型，我們創(chuàng)建了一個新的數(shù)據(jù)對象，集成了scRNA-seq和snRNA-seq數(shù)據(jù)集，以比較INS基因表達(dá)模式（圖1B和4A-C）。結(jié)合這兩個數(shù)據(jù)集有效地增加了分析的能力，同時提供了來自細(xì)胞質(zhì)和核轉(zhuǎn)錄組的額外信息。在對已識別的β細(xì)胞簇進行子集化后，我們生成了Louvain分辨率為0.8的簇（圖4C）以分配三個β細(xì)胞亞簇。scRNA-和snRNA-seq數(shù)據(jù)對象之間的β細(xì)胞簇中的INS基因表達(dá)在拓?fù)湮恢梅矫媸遣煌模▓D4D、E）。聚類3在scRNA-seq數(shù)據(jù)中顯示較低的INS表達(dá)，但在snRNA-seq數(shù)據(jù)對象中顯示最高（圖4E），這表明聚類3包括主要具有INS pre-mRNA的β細(xì)胞，因為snRNA-seq主要分析pre-mRNA。

接下來，我們創(chuàng)建了偽時間和RNA速度軌跡圖，將聚類3作為基礎(chǔ)（圖4F），并根據(jù)偽時間或RNA速度軌跡重新排列了每個聚類的順序，分為β1、β2和β3細(xì)胞（圖4G）。使用兩個數(shù)據(jù)集的綜合數(shù)據(jù)進行偽時間或RNA速度分析時，從聚類3到聚類1的類似進展發(fā)生。單個scRNA-seq數(shù)據(jù)的RNA速度分析顯示了從聚類3到聚類1的類似轉(zhuǎn)變。有趣的是，僅使用snRNA-seq數(shù)據(jù)的RNA速度分析顯示從聚類3末端到聚類3邊緣的分叉，然后從聚類2到聚類1。這些結(jié)果表明，可以通過綜合或單個RNA-seq數(shù)據(jù)觀察到β細(xì)胞亞聚類的識別和轉(zhuǎn)變，但是這種轉(zhuǎn)變似乎在scRNA-seq和snRNA-seq之間有所不同。這很可能是因為RNA速度基于外顯子-內(nèi)含子讀數(shù)比率，利用新轉(zhuǎn)錄的未剪接mRNA推斷基因表達(dá)狀態(tài)的時間導(dǎo)致，但是snRNA-seq中外顯子-內(nèi)含子讀數(shù)較低，使得在聚類之間的轉(zhuǎn)變的解釋變得復(fù)雜。因此，對于綜合或scRNA-seq數(shù)據(jù)，RNA速度是適當(dāng)?shù)?，但是對?/span>snRNA-seq，似乎RNA速度不太適合分析β細(xì)胞成熟的進展。

由于β1細(xì)胞簇中的細(xì)胞具有從scRNA-seq（成熟mRNA）β細(xì)胞簇對象推斷出的穩(wěn)定INS表達(dá)，但從snRNA-seq（pre-mRNA）β細(xì)胞簇對象推斷出非常低的INS表達(dá)，我們將這些細(xì)胞視為富含INS的細(xì)胞亞群。接下來，我們觀察了ZNF385D表達(dá)，它是β細(xì)胞中snRNA-seq中差異表達(dá)最高的基因，發(fā)現(xiàn)scRNA-seq數(shù)據(jù)對象中β細(xì)胞亞群中的表達(dá)最小，但snRNA-seq數(shù)據(jù)中的拓?fù)湮恢貌煌瑢ο螅▓D4H，I），其中β1代表具有高ZNF385Dpre-mRNA表達(dá)的細(xì)胞，與INS表達(dá)相反（圖4E）。接下來，我們觀察了INSmRNA結(jié)合蛋白HNRNPA2B1的表達(dá)，這是一種調(diào)節(jié)INSmRNA穩(wěn)定性和翻譯的RNA結(jié)合蛋白，以確定β2細(xì)胞簇是否代表β3和β1之間的過渡階段。如圖4J、K所示，與聚類3相比，聚類2和聚類1中的HNRNPA2B1表達(dá)增加，表明聚類2可能代表“轉(zhuǎn)變中”β細(xì)胞類型，其中細(xì)胞從轉(zhuǎn)錄活性β3細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>β1細(xì)胞具有成熟儲存的INS mRNA。

5、三種不同β細(xì)胞亞型的基因通路分析

為了研究β3、β2和β1之間潛在的生物學(xué)差異，我們對來自scRNA和snRNA-seq實驗的組合數(shù)據(jù)集進行了GSEA。有趣的是，定義細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形成、相互作用和反應(yīng)的生物過程的基因富集獨特地存在于β3亞群中（圖5A）。同樣，GSEA也表明細(xì)胞內(nèi)囊泡出芽、運輸和形成的生物學(xué)過程主要存在于β2亞群中（圖5B），而胰島素分泌、加工和葡萄糖代謝生物學(xué)過程的基因主要存在于β2亞群中。在β2和β1子簇中表示（圖5C）。當(dāng)我們將來自兩種RNA-seq方法的數(shù)據(jù)集輸入GSEA時，還獲得了關(guān)于對β細(xì)胞的發(fā)育、分化、基因表達(dá)調(diào)控和增殖具有重要意義的幾個生物學(xué)過程的附加信息。

如圖5D所示，參與β細(xì)胞增殖的基因在β3亞群中表達(dá)更高，參與基因表達(dá)調(diào)控的基因在β2亞群中突出，而參與β-細(xì)胞發(fā)育和分化在β1亞群中表達(dá)更高。這些結(jié)果清楚地描述了不同β細(xì)胞亞群中特定細(xì)胞功能的不同基因集，強調(diào)了人類胰島中β細(xì)胞的異質(zhì)性。

6、人體內(nèi)胰島的snRNA-seq分析

接下來，我們試圖使用移植到血糖正常的免疫抑制小鼠體內(nèi)的人類胰島移植物來檢查體內(nèi)不同的人類胰島細(xì)胞群。為此，我們將來自四名健康供體的1000個人類IEQ移植到RAG1-/-小鼠的腎囊中，并在移植后3個月收獲移植物（圖6A）。

通過Minute?單核分離試劑盒直接從移植物中提取細(xì)胞核，在質(zhì)量評估和計數(shù)后將每個樣本5000-16,000個細(xì)胞核加載到10X GenomicsChromiumController中，poly-A轉(zhuǎn)錄本逆轉(zhuǎn)錄擴增，cDNA標(biāo)記，以及得到的文庫測序深度為每個樣本250-5億個讀數(shù)。最終，分析了7765個細(xì)胞核?；驍?shù)為2226±263，基因計數(shù)為4125.64±263，決定測序效率的可用讀數(shù)與測序讀數(shù)之比為0.999±0.001。在細(xì)胞核制備物中測序的線粒體基因百分比低于1%。snRNA-seq數(shù)據(jù)被投射到Azimuth人類胰腺參考上，以使用規(guī)范基因集以及之前描述的新基因集（圖1A和6A）識別胰島細(xì)胞群。此外，snRNA-seq數(shù)據(jù)被投影到來自體外研究的集成scRNA-seq和snRNA-seq數(shù)據(jù)上，用于分析不同的β細(xì)胞亞群（圖6A）。去除基因計數(shù)和/或UMI計數(shù)異常值或線粒體基因高表達(dá)或環(huán)境RNA污染≥20%的細(xì)胞。在質(zhì)量控制過程中，我們發(fā)現(xiàn)≤10%的小鼠基因比率對于在這種胰島移植環(huán)境中識別體內(nèi)不同細(xì)胞類型是最佳的，而小鼠基因?qū)垲惸Ｊ經(jīng)]有顯著影響。

使用Azimuth的基于參考的縮減和注釋，我們確認(rèn)了七個不同的人類胰島細(xì)胞簇，主要由內(nèi)分泌細(xì)胞組成（圖6B）。為簡單起見，我們從數(shù)據(jù)集中省略了少于五個細(xì)胞的簇。通過體外snRNA-seq分析鑒定的基因標(biāo)記集（圖3C）在基于平均表達(dá)的點圖（圖6C）和散點圖（圖6D)與典型基因標(biāo)記的非特異性模式相比。當(dāng)使用基于內(nèi)部參考的減少和注釋時，體外snRNA-seq分析中新鑒定的基因集的這種特異性細(xì)胞簇比對持續(xù)存在（圖6E-G）。

7、人體內(nèi)胰島中的β細(xì)胞亞型

首先，我們確定在scRNA-seq/snRNA-seq體外研究中鑒定的β細(xì)胞亞型是否在體內(nèi)環(huán)境中仍然存在于人類胰島中。因此，我們將體內(nèi)snRNA-seq數(shù)據(jù)集投影到體外scRNA-/snRNA-seq數(shù)據(jù)集參考上，該數(shù)據(jù)集預(yù)先標(biāo)記了β細(xì)胞亞型（圖6E）并提取了β細(xì)胞簇（圖7A)。我們從主要數(shù)據(jù)簇中分離出β細(xì)胞亞簇并檢查基因表達(dá)模式（圖7A-H）。有趣的是，與體外人胰島的snRNAseq數(shù)據(jù)相反，體內(nèi)人胰島中的β1簇與β2和β3簇相比顯示出相似水平的INS表達(dá)（圖7B，C）。當(dāng)分析先前來自人類胰島移植物的snRNA-seq數(shù)據(jù)集時，觀察到類似的結(jié)果。此外，在我們的數(shù)據(jù)集中，ZNF385D和HNRNPA2B1的表達(dá)在體內(nèi)和體外人胰島的β細(xì)胞亞群中似乎相似（圖7D-G）。重要的是，與體外相比，體內(nèi)人胰島中β1亞群中具有穩(wěn)定INS表達(dá)的細(xì)胞比例顯著增加，而β2轉(zhuǎn)換群和主要含有INS pre-mRNA的β3細(xì)胞比例顯著降低（圖7H）。我們推測這可能代表細(xì)胞從較低的INS表達(dá)β3和β2組到更成熟的INSmRNAβ1組的表型或成熟轉(zhuǎn)移，與生理性較低的體外條件相比，可能反映了體內(nèi)微環(huán)境的成熟特征。

我們還使用與上述相同的方法對體內(nèi)人類胰島的不同β細(xì)胞亞群進行了基因集富集分析（圖5和圖8）。正如在體外觀察到的（圖5），與β2和β1細(xì)胞亞型相比，β3細(xì)胞亞型顯示出更高水平的參與ECM生物過程的基因表達(dá)（圖8A）。在β2和β1細(xì)胞亞型中，參與細(xì)胞內(nèi)囊泡出芽、運輸和形成、胰島素分泌、加工和葡萄糖代謝、β細(xì)胞分化、發(fā)育、增殖和基因表達(dá)調(diào)控等生物學(xué)過程的基因表達(dá)在體內(nèi)和體外保持相當(dāng)（圖8B-D）。值得注意的是，人類β3細(xì)胞體內(nèi)與體外β細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)低于體外（圖8B-D），再次表明體內(nèi)微環(huán)境可能為β細(xì)胞提供線索以支持功能更強、但與生理性較低的體外環(huán)境相比，有絲分裂狀態(tài)較低。

參考文獻：

Kang,R.B.,Li,Y.,Rosselot,C.etal.Single-nucleusRNAsequencingofhumanpancreaticisletsidentifiesnovelgenesetsanddistinguishesβ-cellsubpopulationswithdynamictranscriptomeprofiles.GenomeMed15,30(2023).https://doi.org/10.1186/s13073-023-01179-2

???