驚呆你的騷操作——人尿來源外泌體保護(hù)腎臟缺血/再灌注損傷

    缺血/再灌注損傷（IRI）是急性腎損傷（AKI）的主要原因，與高發(fā)病率和高死亡率相關(guān)，缺乏專門的治療方法。在這項(xiàng)研究中，調(diào)查了人類尿液來源干細(xì)胞（hUSCs）及其外泌體對IRI誘導(dǎo)的AKI的保護(hù)作用，以探索這些細(xì)胞作為新治療策略的潛力。本文發(fā)表在Theranostics（IF:8.579）的2020年1021卷。
技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、分離鑒定hUSCs
    如圖1所示，從人類尿液樣本中分離出細(xì)胞培養(yǎng)3-5天，觀察到微小的紡錘狀細(xì)胞集落，并能在體外迅速增殖，流式，WB和qRT-PCR檢測了其表面分子的表達(dá)，包括OCT4和NANOG。

圖1人類尿液來源干細(xì)胞的特性

2、在腎IRI模型中，USCs可減少腎小管損傷和細(xì)胞凋亡，抑制局部炎癥
    與對照組相比，USC處理顯著提高大鼠生存期，注射USCs后第3天sCr和BUN水平降低，第7天腎臟損傷病理評分降低。

圖2 腎IRI后USCs對腎功能的保護(hù)作用

    隨后，作者檢測了USC處理的IRI小鼠模型腎臟細(xì)胞的凋亡，和炎癥因子的表達(dá)情況，如圖3所示，USC處理后細(xì)胞凋亡顯著減少，炎癥細(xì)胞的浸潤顯著下降，細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平也明顯受到抑制。

圖3 USCs降低IRI后腎臟凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、炎癥細(xì)胞浸潤和氧化應(yīng)激水平

3、USC-Exo在體內(nèi)對IRI有保護(hù)作用，在體外對H/R損傷后的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激有抑制作用
    為了探究USC處理對小鼠的保護(hù)作用是否通過外泌體發(fā)揮作用，作者從USC中提取了外泌體樣本，如圖4A所示。隨后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，USC來源外泌體（USC-Exo）處理組顯著提高了小鼠生存期，sCr和BUN水平降低。在體外H/R損傷后，使用USC-Exo處理組的HK2細(xì)胞的焦亡和炎癥分子的表達(dá)顯著下降，表明USC-Exo對HK2有保護(hù)作用。

圖4 USC-Exo在體內(nèi)對腎功能有保護(hù)作用，在體外對H/R損傷后的HK2細(xì)胞有保護(hù)作用

4、在USC-Exo中，miR-146a-5p抑制IRAK1的表達(dá)
    為了進(jìn)一步探究USC-Exo的作用機(jī)制，作者進(jìn)行了外泌體RNA測序，從而鑒定到20個(gè)候選的miRNA，其表達(dá)如圖5A所示，挑選表達(dá)豐度最高的6個(gè)做了qRT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)只有miR-146a-5p顯著高表達(dá)。隨后，進(jìn)行了熒光素酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示miR-146a-5p與IRAK1具有物理結(jié)合作用。

圖5 USC-Exo含量的miRNA測序及miR-146a-5p的潛在靶點(diǎn)

5、在體內(nèi)和體外USC增強(qiáng)miR-146a-5p的表達(dá)和抑制IRAK1表達(dá)和NF -κB p65亞基的核異位
    為了進(jìn)一步證實(shí)miR-146a-5p對于USC在IRI中的保護(hù)作用至關(guān)重要的假設(shè)，首先確定了USR治療的IRI大鼠腎臟組織中miR-146a-5p的表達(dá)水平。 qRT-PCR分析顯示，USC治療的IRI組的腎臟中miR-146a-5p表達(dá)上調(diào)（圖6A）。為了進(jìn)一步確定USC分泌的miR-146a-5p是否通過外泌體遞送到受損的腎臟組織，在USC處理后第3天從大鼠收集血清樣品，提取外泌體，并檢測miR-146a-5p的表達(dá)水平。結(jié)果顯示與對照組比，外泌體miR-146a-5p在經(jīng)USC治療的血清組中表達(dá)更高（圖6B）。FISH進(jìn)一步證明了在受損的腎臟組織中miR-146a-5p表達(dá)的增加（圖6C）。IRAK1的mRNA（圖6A）和蛋白（圖6D）表達(dá)水平在USC治療的IRI大鼠的腎臟中被下調(diào)。USC-Exo處理可顯著上調(diào)miR-146a-5p表達(dá)并下調(diào)IRAK1在HK2處理細(xì)胞中的表達(dá)（圖6E）。與體內(nèi)觀察結(jié)果一致，WB顯示，USC-Exo處理后IRAK1蛋白表達(dá)以及NF-κB p65亞基的核易位均降低（圖6F）。進(jìn)一步在USC-Exo處理的細(xì)胞中對NF-κB p65進(jìn)行了染色，發(fā)現(xiàn)在H / R后的對照HK2細(xì)胞中，NF-κB p65位于細(xì)胞核中。相反，在H / R后經(jīng)USC-Exo處理的HK2細(xì)胞中，一些NF-κB p65保留在細(xì)胞質(zhì)中，其核定位水平顯著降低（圖6G）。這些結(jié)果表明，USC對腎損傷的保護(hù)作用可能是通過外泌體miR-146a-5p介導(dǎo)的NF-κB信號下調(diào)而發(fā)生的。

圖6 USC或USC-Exo上調(diào)miR-146-5p表達(dá)抑制IRAK1和NF -κB信號體內(nèi)和體外

6、針對H / R HK2細(xì)胞miR-146-5p抑制IRAK1表達(dá)式和NF -κB p65核易位
    接下來在體外使用H / R誘導(dǎo)的損傷模型描述miR-146a-5p和IRAK1之間的調(diào)控關(guān)系。用miR-146a-5p轉(zhuǎn)染HK2細(xì)胞，并通過qRT-PCR證實(shí)了miR-146a-5p表達(dá)增加（圖7A）。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞同時(shí)受到H / R損傷，qRT-PCR分析顯示miR-146a-5p導(dǎo)致IRAK1 mRNA表達(dá)顯著降低（圖7A）。此外，用miR-146a-5p可以減少氧化應(yīng)激，增加SOD活性，并降低MDA含量（圖7B）。WB表明，miR-146a-5p導(dǎo)致IRAK1蛋白表達(dá)和NF-κB p65亞基核易位顯著降低（圖7C）。免疫熒光染色顯示miR-146a-5p可以減少NF-κB p65的核定位（圖7D）。而用miRNA抑制劑處理HK2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制劑治療組IRAK1的表達(dá)水平高于對照組（圖7E）。 miR-146a-5p抑制劑可加重氧化應(yīng)激，降低SOD活性，并增加MDA含量（圖7F-G）。這些結(jié)果共同表明，miR-146a-5p在H / R誘導(dǎo)的損傷中調(diào)控IRAK1表達(dá)和NF-κBp65亞基核易位中具有不可或缺的作用。

圖7 miR-146-5p減少氧化應(yīng)激，抑制IRAK1，NF -κB信號在H/R-induced HK2細(xì)胞的損傷

    總而言之，本文證明了USC通過抗氧化，抗炎和抗凋亡細(xì)胞保護(hù)作用之間的相互作用，在IRI大鼠模型中預(yù)防腎臟損傷。 此外，在體外使用H / R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，確定了USC-Exo中的關(guān)鍵參與者miR-146a-5p，它通過下調(diào)IRAK1 /NF-κB信號傳導(dǎo)來介導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)作用。這些發(fā)現(xiàn)為使用無創(chuàng)且經(jīng)濟(jì)高效的USC或USC-Exo治療AKI提供了理論基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)：
Li Xirui., Liao Jun., Su Xiaojun., Li Weiqiang., Bi Zirong., Wang Jiali., Su Qun., Huang Huiting., Wei Yongcheng., Gao Yifang., Li Jun., Liu Longshan., Wang Changxi.(2020). miR-146a-5pHuman urine-derived stem cells protect against renal ischemia/reperfusion injury in a rat model via exosomal  which targets . Theranostics, 10(21), 9561-9578. doi:10.7150/thno.42153