灰血小板綜合征免疫失調(diào)和顆粒缺陷的新臨床表現(xiàn)

    2020年7月，《Blood》雜志發(fā)表“Novel manifestations of immune dysregulation and granule defects in gray platelet syndrome.”文章，IF=17.543,此報(bào)道發(fā)現(xiàn)了GPS患者的新特征，包括白細(xì)胞減少、自身免疫性病變、髓細(xì)胞粒度過(guò)細(xì)和促炎血漿蛋白組。通過(guò)評(píng)估GPS患者臨床和細(xì)胞水平的表型，進(jìn)一步證明了Nbeal2在血小板和免疫細(xì)胞的顆粒和細(xì)胞生物學(xué)中的作用，并強(qiáng)調(diào)了之前與這種罕見(jiàn)的出血疾病無(wú)關(guān)的免疫失調(diào)。

    NBEAL2雙等位基因變異導(dǎo)致灰色血小板綜合征(GPS)的發(fā)現(xiàn)是血液學(xué)的一個(gè)重要進(jìn)展，提高了我們對(duì)血小板和顆粒生物學(xué)的理解。Nbeal2 - / -小鼠擬表型GPS的特點(diǎn),包括出血,血小板減少癥,缺乏血小板α(ɑ)顆粒,脾腫大,骨髓(BM)纖維化。Nbeal2-/-小鼠對(duì)細(xì)菌和病毒感染的易感性與器官損傷增加、存活率降低和感染后恢復(fù)時(shí)間更長(zhǎng)有關(guān)。這是由自然殺傷細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌顆粒的缺陷導(dǎo)致的。此外，在貯藏囊泡中，Nbeal2-/-小鼠的肥大細(xì)胞不足，單核細(xì)胞的顆粒度降低。Nbeal2-/-巨核細(xì)胞(MKs)具有促炎特性。這些報(bào)道強(qiáng)調(diào)了Nbeal2對(duì)MKs、血小板以及小鼠中多種骨髓和淋巴細(xì)胞的正常顆粒功能很重要。然而，在小鼠模型中觀察到的免疫細(xì)胞缺陷是否與GPS的病理生理學(xué)相關(guān)，目前還不清楚。GPS患者研究表明復(fù)發(fā)感染和自身免疫性淋巴增生綜合征(ALPS)的不典型表現(xiàn)。對(duì)GPS患者的中性粒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了評(píng)估:一些報(bào)告顯示中性粒細(xì)胞顆粒被保留，而另一些報(bào)告指出中性粒細(xì)胞顆粒沒(méi)有被保留。鑒于發(fā)表的關(guān)于NBEAL2病因變異確診的GPS患者的研究很少，我們建立了一個(gè)國(guó)際合作來(lái)系統(tǒng)性評(píng)估大量的患者臨床和實(shí)驗(yàn)室表型。我們將重點(diǎn)放在與免疫相關(guān)的特征上，隨后使用蛋白質(zhì)譜(MS)和RNA測(cè)序(RNA-seq)對(duì)患者亞群中的血漿、血小板和三種不同白細(xì)胞群體進(jìn)行了分子表征。
一、NBEAL2變異導(dǎo)致GPS

    A)利用Genome Reference Consortium human Genome build 37 (GRCh37)測(cè)定3號(hào)染色體上56個(gè)相對(duì)于NBEAL2的僅有變異位點(diǎn)(Chr 3)。垂直的黑色條代表外顯子。
    B)根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院(ACMG)指南，根據(jù)致病性分類的獨(dú)特變異的頻率22。
    C)與Nbeal2的氨基酸序列和已知功能域(x軸上)相比，錯(cuò)義變異的位置。變異的y軸位置為其利用ConSurf38計(jì)算的估計(jì)進(jìn)化保護(hù)分?jǐn)?shù)。得分為正則表示保護(hù)程度較低，得分為負(fù)則表示保護(hù)程度較高。垂直灰色線代表50%置信區(qū)間的保守分值范圍:柱的底部和頂部分別為推斷出的進(jìn)化率分布的第25個(gè)百分位數(shù)和第75個(gè)百分位數(shù)。
二、新的臨床表型

    A) 人類表型本體論(HPO)樹(shù)，顯示了47例GPS患者最常見(jiàn)的3個(gè)HPO器官系統(tǒng):血液(血液和血液形成組織異常)、免疫(免疫系統(tǒng)異常)和代謝(代謝/穩(wěn)態(tài)異常)。
    HPO 相關(guān)術(shù)語(yǔ):Plt，血小板形態(tài)異常; Bleeding,非正常出血; BM形態(tài)、骨髓細(xì)胞形態(tài)異常;紅細(xì)胞變形、紅細(xì)胞形態(tài)異常;免疫變形。免疫系統(tǒng)形態(tài)異常;免疫雜志。免疫系統(tǒng)生理異常;脾腫大,脾腫大; B12，維生素B12水平異常;TP,血小板減少癥;顆粒數(shù)異常;骨髓纖維化，骨髓纖維化;可變形。巨核細(xì)胞形態(tài)異常;貧血,貧血; Poik。異形紅細(xì)胞癥; Leuk。白細(xì)胞計(jì)數(shù)異常;感染，反復(fù)感染;自身免疫、自身免疫; MTP Macrothrombocytopenia;無(wú)AG，無(wú)顆粒;低單核細(xì)胞減少;低淋巴，淋巴減少;低中性，中性粒細(xì)胞減少;低堿性，嗜堿性細(xì)胞計(jì)數(shù)減少;自體免疫抗體陽(yáng)性。
    B)患者ID 20.3的CD61染色BM trephine 圖像(1000x)，兩個(gè)MKs顯示中性粒細(xì)胞分裂。
    C)三位GPS患者(患者編號(hào)18、33和34.1)MKs伴中性粒細(xì)胞增多百分比的點(diǎn)圖;
    D)對(duì)29例GPS患者(按患者身份標(biāo)記)進(jìn)行自身抗體檢測(cè)的自身免疫性疾病表現(xiàn)、自身抗體檢測(cè)結(jié)果和出血癥狀。
    Abbreviations: aALPS, 盤(pán)狀紅斑狼瘡; HT，橋本甲狀腺炎;  RA, 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎; 自身抗體:aCL，心磷脂; AMA、線粒體; ANA, 核;B2GPI beta2-glycoprotein 1;C-ANCA,中性粒細(xì)胞胞質(zhì);  CCP, 環(huán)瓜氨酸肽; ENA，可提取的核抗原; GPC, 胃壁細(xì)胞;LKM,肝腎微粒體;P-ANCA,中性粒細(xì)胞細(xì)胞核周?chē)? RF, 類風(fēng)濕因子;Sm, spliceosomal;TgAb甲狀腺球蛋白; TPO, thyroperoxidase;TRAb，促甲狀腺激素受體;TSI，甲狀腺刺激免疫球蛋白。
    E)白細(xì)胞總數(shù)的柱狀圖
    F) 5例GPS患者與5例對(duì)照的CBC（全血計(jì)數(shù)）。
三、血小板、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和cd4淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組

    A)RNA-seq差異表達(dá)基因(左)和MS差異豐富蛋白(右)條形圖。由于自身免疫性疾病的傾向和CBC參數(shù)的改變，全面地了解GPS患者CBC參數(shù)在細(xì)胞表型上的差異。用RNA-seq和蛋白質(zhì)譜分析血小板、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和cd4淋巴細(xì)胞，并將結(jié)果與5個(gè)對(duì)照組進(jìn)行比較。通過(guò)主成分分析，除血小板RNA-seq外，其他數(shù)據(jù)清晰地描繪了GPS和對(duì)照樣品(Supp.圖3.1)。在每種血細(xì)胞類型中，差異表達(dá)基因的數(shù)量從95到255不等，差異豐富蛋白的數(shù)量從63到123不等(圖3A;在血小板、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中123、65和63個(gè)差異豐富蛋白中，GPS患者分別減少89%、86%和62%。這些被還原的蛋白質(zhì)在GO術(shù)語(yǔ)中富集，這些條目與細(xì)胞顆粒及其管腔有關(guān)。包括Nbeal2在內(nèi)的9種蛋白在GPS患者中顯著降低。少的蛋白質(zhì)不同GPS血小板豐富,有一個(gè)顯著的代表的蛋白質(zhì)在ɑ顆粒和/或血小板釋放物. 然后我們檢查了這13種不同程度上在GPS血小板中更豐富的蛋白質(zhì)。其中5個(gè)，包括彈性蛋白酶(Elane)和髓過(guò)氧化物酶(Mpo)，已知定位于中性粒細(xì)胞顆粒（figure 3C）。在GPS中性粒細(xì)胞中減少的56個(gè)差異豐富的蛋白中(圖3A)， 36個(gè)(65%)可以被劃分為不同的顆粒亞型(figure 3D）.
四、GPS血漿蛋白質(zhì)組具有促炎和肝臟特征

    作者推測(cè)顆粒異常的血細(xì)胞評(píng)估可能導(dǎo)致系統(tǒng)性的血液循環(huán)改變。為此，我們分析了11例患者和13例對(duì)照組的血漿。首先，對(duì)分離的患者和對(duì)照樣本的血漿蛋白歸一化濃度進(jìn)行無(wú)監(jiān)督隨機(jī)森林分析，并確定51個(gè)鑒別蛋白(圖4A)，分析結(jié)果顯示，11個(gè)和40個(gè)鑒別蛋白在患者中分別有較高和較低的濃度。GO富集分析強(qiáng)調(diào)了與炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)的條目的存在，特別是在GPS血漿中更豐富的11種蛋白的topGO術(shù)語(yǔ)中(圖4B);隨后鑒別血漿蛋白與四種細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)組重疊。在至少一種細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)組中，有14種血漿蛋白的豐富程度存在差異，但其方向模式因蛋白而異(圖4C)。此外，蛋白質(zhì),少在GPS血小板豐富的蛋白質(zhì)組也豐富GPS等離子體,包括蛋白質(zhì)局部ɑ顆粒。與此相反，血漿中四種高水平的重疊蛋白都存在于中性粒細(xì)胞顆粒中。其中抗菌肽(Camp)、富含半胱氨酸的分泌蛋白3 (Crisp3)和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)的脂質(zhì)鈣蛋白(Lcn2)在GPS中性粒細(xì)胞中含量較低，且均定位于中性粒細(xì)胞特異性顆粒。