BATF2 mRNA的m6A甲基化修飾在胃癌中的功能抑制作用

    由于惡性增殖和轉(zhuǎn)移的發(fā)生，胃癌患者預(yù)后不佳。BATF2在其它腫瘤中被發(fā)現(xiàn)能夠降低腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)BATF2的mRNA水平可能與N6-甲基腺苷(m6A)甲基化修飾有關(guān)，然而BATF2在胃癌（GC）中的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院的謝建偉等人于2020年7月在Molecular Cancer（IF=15.302）這一雜志發(fā)表文章，研究METTL3/BATF2/p53/ ERK在GC發(fā)展中的作用，探究BATF2在GC中的臨床意義及調(diào)控機(jī)制。
技術(shù)路線圖：

研究結(jié)果：
1.BATF2表達(dá)降低與胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)
    對8對GC和正常胃組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)GC中871個基因表達(dá)下調(diào)，這些基因在TCGA-STAD和ACRG數(shù)據(jù)庫中的生存分析結(jié)果（P<0.01）顯示5個基因可作為GC患者的預(yù)后標(biāo)志物, 其中BATF2被確認(rèn)是下調(diào)基因。在組織和細(xì)胞中，通過WB、PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在腫瘤中BATF2的表達(dá)水平降低。BATF2低表達(dá)患者的總體和無病生存率明顯低于BATF2高表達(dá)患者，并且多變量Cox回歸分析顯示，BATF2是獨(dú)立預(yù)后因素。

2. 體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中，BATF2抑制腫瘤的生長
    集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，BATF2表達(dá)上調(diào)（過表達(dá)）抑制腫瘤細(xì)胞增殖，BATF2表達(dá)下調(diào)（敲除）則相反。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示BATF2表達(dá)增加，G1期細(xì)胞增多，細(xì)胞的生長受到抑制，而敲除BATF2導(dǎo)致G1期細(xì)胞減少。移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示BATF2高表達(dá)的小鼠中腫瘤的生長速度比較慢，BATF2低表達(dá)的小鼠則較快。免疫組化結(jié)果顯示，BATF2高表達(dá)組中Ki-67（增殖細(xì)胞的標(biāo)記）評分低于BATF2低表達(dá)組中。這些結(jié)果提示BATF2可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來抑制GC。

3. 在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中，BATF2調(diào)節(jié)GC轉(zhuǎn)移
    細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，BATF2過表達(dá)顯著抑制GC細(xì)胞的遷移和侵襲，BATF2敲除則增加遷移和侵襲。移植瘤實(shí)驗(yàn)的生物發(fā)光成像結(jié)果顯示，注射過表達(dá)BATF2細(xì)胞的小鼠胃癌肺轉(zhuǎn)移明顯減少。轉(zhuǎn)移菌落數(shù)量、轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)和腹膜轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BATF2在抑制胃癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

4. BATF2調(diào)節(jié)ERK信號抑制GC
    基因探針富集分析(GSEA)顯示，BATF2與MAPK信號通路相關(guān)。人磷酸激酶芯片檢測BATF2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響，結(jié)果顯示BATF2過表達(dá)降低了ERK的磷酸化，BATF2敲除增強(qiáng)了ERK的磷酸化。WB和免疫組化結(jié)果驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)?；赥MA的免疫組化驗(yàn)證了低BATF2表達(dá)組中62.6%的患者p-ERK水平增強(qiáng)。
    在BATF2敲除的GC細(xì)胞中抑制p-ERK（U0126， ERK抑制劑）能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。而且，文章中分析了在BATF2過表達(dá)或敲除的細(xì)胞中ERK介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄靶基因MMP2, MMP9,和cyclin D1的表達(dá)變化。
    隊列研究表明BATF2調(diào)節(jié)ERK磷酸化可能是BATF2在GC中抑制腫瘤功能的機(jī)制。

5. 在p53存在的情況下，BATF2控制ERK磷酸化
    互作基因(STRING)數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)p53蛋白可能與BATF2相互作用，并且過表達(dá)BATF2會導(dǎo)致p53蛋白表達(dá)增加，而沉默BATF2會降低p53的表達(dá)。移植瘤免疫組化顯示p53蛋白與BATF2表達(dá)呈正相關(guān)，細(xì)胞免疫熒光顯示p53蛋白與BATF2共定位，co-IP檢測顯示BATF2和p53蛋白相互作用，但是qRT-PCR檢測顯示BATF2和p53表達(dá)沒有顯著相關(guān)性，因此文章中推測BATF2可能通過翻譯后修飾調(diào)控p53蛋白水平。
    加入翻譯抑制劑cycloheximide(CHX)后，BATF2過表達(dá)顯著增加了p53蛋白的半衰期。MG132，一種蛋白酶體抑制劑，挽救了BATF2過表達(dá)誘導(dǎo)的p53蛋白水平變化。沉默p53可以恢復(fù)GC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。沉默p53表達(dá)可顯著消除BATF2對p-ERK、MMP2、MMP9和cyclin D1水平的抑制作用(圖5k)。綜上所述，這些結(jié)果表明BATF2的缺失促進(jìn)了泛素介導(dǎo)的p53降解，從而激活了ERK信號。

6. GC中，METTL3介導(dǎo)BATF2 mRNA的m6A修飾
    沉默METTL3的表達(dá)能增加BATF2的表達(dá)，反之亦然。我們發(fā)現(xiàn)，在GC細(xì)胞中，BATF2 mRNA m6A修飾與METTL3表達(dá)呈正相關(guān)?；赥MA的免疫組織分析顯示，METTL3在GC中的表達(dá)與BATF2存在一定程度的負(fù)相關(guān)。熒光素酶報告基因檢測確定BATF2的3個未翻譯區(qū)域(3’UTR)特異性m6A修飾位點(diǎn)-MUT3位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，在GC中，m6A通過METTL3維持了BATF2 mRNA的穩(wěn)定性。

總 結(jié)：
1.文章揭示了BATF2在胃癌發(fā)展中的抑癌作用。
2.BATF2表達(dá)顯著下調(diào)與胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)。
3.METTL3/BATF2/p53/ERK通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和ECM降解抑制GC生長和轉(zhuǎn)移。綜上，BATF2可能是潛在的胃癌預(yù)測因子和治療靶點(diǎn)