Nat. Methods | TooManyCells識(shí)別并可視化單細(xì)胞進(jìn)化枝的關(guān)系

    細(xì)胞轉(zhuǎn)錄輸出有助于細(xì)胞類型和狀態(tài)的確定。新興技術(shù),如單細(xì)胞RNA-seq (scRNA-seq)改善了識(shí)別和描述的細(xì)胞狀態(tài)異質(zhì)性由不同的基因表達(dá)程序和擁有先進(jìn)我們理解細(xì)胞多樣性的功能作用在細(xì)胞分化等領(lǐng)域,對(duì)刺激的回應(yīng),和失調(diào)疾病。
    許多聚類算法建議對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行劃分，以識(shí)別具有相關(guān)轉(zhuǎn)錄程序的細(xì)胞群，將細(xì)胞劃分為已知的細(xì)胞類型或狀態(tài)，在某些情況下描述新的稀有細(xì)胞種群?；趌ouva的聚類方法s1是應(yīng)用最廣泛的scRNA-seq聚類方法之一。這些算法以貪婪的方式迭代地優(yōu)化社區(qū)度量，即Newman-Girvan模塊化，以生成單個(gè)的單元?jiǎng)澐?。在大多?shù)scRNA-seq分析工作流程,確定細(xì)胞具有相似的轉(zhuǎn)錄組的集群模式然后使用降維可視化技術(shù),如t-distributed隨機(jī)鄰居嵌入(t-SNE) 2,在高維基因表達(dá)空間隨機(jī)減少到項(xiàng)目每個(gè)細(xì)胞的位置在一個(gè)二維曲面。這個(gè)工作流程導(dǎo)致識(shí)別單個(gè)單層的單元分區(qū)，這些單元使用缺乏定量的組間和組內(nèi)關(guān)系信息的可視化方法進(jìn)行解釋?？紤]到精確的細(xì)胞狀態(tài)定義和國(guó)米和intra-relationships是上下文相關(guān)的,可能不適合一個(gè)uni-layer分區(qū)的細(xì)胞,而是一個(gè)層次結(jié)構(gòu)的嵌套細(xì)胞狀態(tài),我們介紹了一個(gè)范式轉(zhuǎn)變套件工具的分析,解釋和單細(xì)胞的可視化數(shù)據(jù)通過(guò)啟用同步描述和可視化的多層細(xì)胞演化支。
    TooManyCells是一套基于圖形的算法和工具，可在保持和呈現(xiàn)細(xì)胞群之間的相互關(guān)系的同時(shí)，高效，全局且無(wú)偏見(jiàn)地識(shí)別和鑒定細(xì)胞進(jìn)化枝。TooManyCells提供了一種新穎的單細(xì)胞聚類算法ClusterTree，該算法為單細(xì)胞測(cè)量分析實(shí)現(xiàn)了有效的無(wú)矩陣分裂分層光譜聚類。此外，TooManyCells 能夠評(píng)估細(xì)胞多樣性并估計(jì)調(diào)查異質(zhì)種群中特定水平的細(xì)胞物種豐富度所需的樣本量。TooManyCells還提供BirchBeer了一個(gè)完全可定制的新穎模型，用于以單細(xì)胞分辨率可視化分層細(xì)胞聚類分析。在渲染聚類樹(shù)時(shí)，BirchBeer利用著色標(biāo)簽，縮放分支，模塊化疊加，內(nèi)部節(jié)點(diǎn)標(biāo)簽，葉節(jié)點(diǎn)摘要等的加權(quán)平均混合，可以對(duì)單細(xì)胞進(jìn)化枝進(jìn)行多層和多方面的探索。為了提供最大的適用性，TooManyCells加載并生成幾種標(biāo)準(zhǔn)文件格式。因此，可以將替代聚類算法與可視化結(jié)合使用，從而在多種方法之間提供協(xié)調(diào)，以幫助闡明單個(gè)單元格之間的關(guān)系。這些聚類和可視化算法能夠描述依賴于上下文和應(yīng)用程序的細(xì)胞集群，并加速探索和量化細(xì)胞分支之間的相互關(guān)系。
    近日，來(lái)自賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院的病理學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系，賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系，美國(guó)賓夕法尼亞州佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院的賓夕法尼亞大學(xué)艾布拉姆森家庭癌癥研究所，法尼亞大學(xué)賓夕法尼亞大學(xué)表生遺傳研究所課題組在Nat. Methods 發(fā)表題為TooManyCells identifies and visualizes relationships of single-cell clades的研究，報(bào)道了一種新軟件——TooManyCells，可以識(shí)別并可視化單細(xì)胞進(jìn)化枝的關(guān)系。
    這組工具通過(guò)在依賴于上下文和應(yīng)用程序的范圍內(nèi)同時(shí)比較單元狀態(tài)，從而在分析和解釋單細(xì)胞數(shù)據(jù)方面提供了范式轉(zhuǎn)換。這種轉(zhuǎn)變的一個(gè)副產(chǎn)品是對(duì)稀有種群的即時(shí)檢測(cè)和可視化，其性能優(yōu)于以前的算法，這是通過(guò)將這些工具應(yīng)用于來(lái)自各種小鼠器官的現(xiàn)有單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)集而得到證明的。
一、TooManyCells 用于單細(xì)胞分辨率的聚類和可視化

    例如，通過(guò)scRNA-seq測(cè)量對(duì)遞歸結(jié)構(gòu)進(jìn)行遞歸劃分可以概括脾臟中的淋巴樣群體，在該群體中，分裂將B與T細(xì)胞分開(kāi)，然后可以將血漿細(xì)胞譜系與過(guò)渡性B細(xì)胞分離，然后分離成漿細(xì)胞和漿細(xì)胞，直至達(dá)到具有不同B細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)的漿細(xì)胞的分離。要確定單元狀態(tài)的連續(xù)體ClusterTree，TooManyCells，從屬于單個(gè)組的所有單元格開(kāi)始，作為聚類樹(shù)的根（圖1a和1b）。這些細(xì)胞由具有m個(gè)細(xì)胞和n個(gè)基因的m × n矩陣表示。矩陣中的每個(gè)條目都是細(xì)胞中某個(gè)基因的豐度數(shù)據(jù)。因此，ClusterTree生成嵌套單元簇的層次結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)內(nèi)部節(jié)點(diǎn)都是給定規(guī)模的簇，葉節(jié)點(diǎn)是細(xì)粒度簇，其中任何附加的二分分割都將與單元的隨機(jī)分裂一樣好。
二、ClusterTree：用于scRNA-seq的無(wú)矩陣分裂分層光譜聚類算法

    單細(xì)胞分辨率的可視化是scRNA-seq數(shù)據(jù)解釋的組成部分。為了適應(yīng)對(duì)嵌套細(xì)胞簇的層次結(jié)構(gòu)的詢問(wèn)，TooManyCells它配備了BirchBeer一個(gè)完全可定制的新穎軟件，專門為清晰，可解釋地顯示細(xì)胞簇的層次結(jié)構(gòu)而開(kāi)發(fā)（圖2a）。BirchBeer是專為顯示整個(gè)樹(shù)而設(shè)計(jì)的，它具有其他一些功能，可幫助用戶查找相關(guān)種群并促進(jìn)數(shù)據(jù)探索。BirchBeer可以根據(jù)該子樹(shù)中的單元格數(shù)量縮放每個(gè)分支，并使用通過(guò)該分支連接的單元格標(biāo)簽顏色的加權(quán)平均混合為每個(gè)分支點(diǎn)著色（圖2a）?；焐梢栽诙鄠€(gè)范圍內(nèi)增強(qiáng)對(duì)重疊或不同種群的識(shí)別（圖2b）。葉節(jié)點(diǎn)上的單元組可以使用多種可視化格式。葉節(jié)點(diǎn)可以顯示一個(gè)餅狀圖，顯示其細(xì)胞組成的分布。為了以單細(xì)胞分辨率描述信息，可以在葉節(jié)點(diǎn)處對(duì)每個(gè)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行渲染和顏色編碼，以可視化其他信息，例如細(xì)胞的確切數(shù)量，每個(gè)細(xì)胞上給定基因的表達(dá)水平以及其他信息。葉簇（圖2b）。為了幫助解釋和分析復(fù)雜的細(xì)胞混合物，birch-tree提供了幾種修剪聚類樹(shù)的方法（圖2c-k）。這些方法包括距根的步驟數(shù)，最小葉節(jié)點(diǎn)大小以及基于分位數(shù)的修剪解決方案（圖2c）。重要的是，TooManyCells可以在葉節(jié)點(diǎn)群集和群集層次結(jié)構(gòu)中的所有嵌套群集之間進(jìn)行比較。為了幫助選擇給定的細(xì)胞分區(qū)，請(qǐng)BirchBeer提供每個(gè)內(nèi)部或葉節(jié)點(diǎn)群集標(biāo)識(shí)號(hào)的覆蓋圖，可用作重疊TooManyCells表達(dá)式分析模塊的輸入，以比較分析不同規(guī)模的群集或進(jìn)行其他下游分析（圖2d） 。由于分支縮放寬度在美學(xué)上可能是主觀的，因此可以對(duì)其進(jìn)行調(diào)整（圖2e與圖2c）或完全禁用（圖2f）。由于候選分割的模塊性證明了該分裂相對(duì)于隨機(jī)分割模型的重要性，因此BirchBeer可以將模塊顯示為圓周黑暗程度不同的黑圈，以幫助識(shí)別彼此非常不同的種群（圖2g）。BirchBeer可以可視化內(nèi)部和葉節(jié)點(diǎn)的多樣性（圖2h）。除了在樹(shù)上覆蓋連續(xù)變量之外，還BirchBeer可以覆蓋離散變量。例如，BirchBeer可以覆蓋每個(gè)細(xì)胞和簇的UMI計(jì)數(shù)（圖2i），以及一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)狀態(tài)以適應(yīng)可視細(xì)胞分級(jí)分析（圖2j和2k）。
三、TooManyCells 識(shí)別純細(xì)胞簇

    簇純度的比較分析。（a）所分析的種群由x軸（胸腺，脾臟，骨髓，肢體肌肉，舌頭，心臟，肺，乳腺，膀胱，膀胱）左側(cè)的x軸上的部位（即器官和組織）的數(shù)量表示，腎臟，肝臟}。比較了集群多樣性的分布。從TooManyCells分層群集樹(shù)中考慮了全部，64或32個(gè)群集（從根開(kāi)始的所有步驟，從根開(kāi)始的6個(gè)步驟或從根開(kāi)始的5個(gè)步驟）群集。所有算法均使用默認(rèn)過(guò)濾和參數(shù)。較高的多樣性表示較低的準(zhǔn)確性。（b）逆加權(quán)分集定義為逆最小-最大歸一化分集和簇大小與單元總數(shù)之比的乘積。值越大表示簇越純凈。（c）與（a）相同，不同之處TooManyCells標(biāo)準(zhǔn)化程序：TooManyCells默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)化（默認(rèn)標(biāo)度）項(xiàng)頻率-逆文檔頻率（tf-idf），上四分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化（Upper Quartile Scaled），總和基因中位數(shù)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化（Cell和Gene Scaled），然后進(jìn)行tf-idf標(biāo)準(zhǔn)化。（d）與（b）相同，不同的TooManyCells歸一化程序相同。
四、TooManyCells 準(zhǔn)確描繪出細(xì)胞混合物中的稀有種群

    從兩個(gè)稀有種群與一個(gè)普通細(xì)胞種群混合中檢測(cè)細(xì)胞，以此作為通用聚類算法（a和b）的基準(zhǔn)。從左到右的列：用實(shí)際類型（即器官）標(biāo)記的細(xì)胞，以及用scRNA-seq聚類算法分配的簇標(biāo)記的細(xì)胞。從上到下的行：Monocle，Phenograph，Seurat和Cellranger t-SNE投影。提出了對(duì)a）900個(gè)普通（舌）細(xì)胞和100個(gè)稀有（50個(gè)乳腺和50個(gè)骨髓）細(xì)胞以及b）990個(gè)普通和10個(gè)稀有細(xì)胞（5個(gè)乳腺和5個(gè)骨髓）的分析。（c）結(jié)果TooManyCells聚類和可視化。左：900（普通）（普通）和100（罕見(jiàn)）。右：990個(gè)普通細(xì)胞和10個(gè)稀有細(xì)胞。（d）量化稀有人口基準(zhǔn)。對(duì)于每次運(yùn)行，性能代表真正的稀有對(duì)（乳腺與乳腺以及骨髓和骨髓在同一簇中）/總稀有對(duì)（真正的稀有對(duì)和具有骨髓的乳腺）。
五、小鼠脾臟中成漿細(xì)胞亞群的鑒定

    (a) TooManyCells用先前識(shí)別的細(xì)胞類型標(biāo)記的小鼠脾臟數(shù)據(jù)集的聚類樹(shù)(b)來(lái)自(a)的具有新識(shí)別的b細(xì)胞亞型的樹(shù)(c)與所有其他細(xì)胞相比,來(lái)自(b)的成漿細(xì)胞節(jié)點(diǎn)的前100個(gè)差異表達(dá)基因的MyGeneSet基因表達(dá)(d) (a)中的細(xì)胞使用秀蘭的加工和t-SNE投影,用TooManyCells對(duì)樹(shù)葉進(jìn)行聚類,為每片樹(shù)葉分配不同的顏色類似的顏色表示樹(shù)中的附近位置,例如,粉色和紫色在樹(shù)中的位置比粉色和綠色更近(e) (d)中t-SNE投影的坐標(biāo),其坐標(biāo)為(b)中子集的人口成漿細(xì)胞是橙色的,分布在整個(gè)b細(xì)胞群中(f)來(lái)自(d)中t-SNE投影的坐標(biāo),該投影由修生成的簇標(biāo)簽著色。
六、SOX2OT對(duì)體內(nèi)BCSC生長(zhǎng)和致瘤性的影響
    SOX2OT對(duì)體內(nèi)BCSC生長(zhǎng)和致瘤性的影響。顯示了從小鼠收集的腫瘤。b測(cè)量并分析了sh-SOX2OT和sh-NC治療組的腫瘤重量。c測(cè)量并分析了sh-SOX2OT和sh-NC治療組的腫瘤體積曲線。d測(cè)量和分析了sh-SOX2OT和sh-NC治療組的無(wú)腫瘤比例。敲低SOX2OT在體內(nèi)抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。e和f敲低SOX2OT在體內(nèi)的BCC中增加了miR-200c的表達(dá)，降低了SOX2和SOX2靶基因的表達(dá)，并抑制了EMT。G：擊倒SOX2OT降低了SOX2的表達(dá)，并且SOX2OT和SOX2在BCC體內(nèi)共定位。h和i擊倒SOX2OT會(huì)降低體內(nèi)BCC中SOX2和ki67的表達(dá)。j細(xì)胞熒光示蹤系統(tǒng)的示意圖。敲除SOX2OT的k和l顯著降低了異種移植物中sh-SOX2OT細(xì)胞的比例。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD。* p ?<0.05；** p ?<0.01
七、敲減SOX2OT抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移
    SOX2OT對(duì)膀胱癌肺轉(zhuǎn)移的影響以及SOX2OT致癌作用的示意圖。a和b sh-SOX2OT組的熒光素酶信號(hào)顯著低于sh-NC組的熒光素酶信號(hào)。c兩個(gè)治療組的小鼠體重之間無(wú)顯著差異。d和e與sh-NC組相比，sh-SOX2OT組的肺轉(zhuǎn)移數(shù)目和大小明顯減少。f和h降低SOX2OT的表達(dá)會(huì)降低肺轉(zhuǎn)移中SOX2的表達(dá)。G在sh-SOX2OT組中，E-cadherin的表達(dá)明顯高于在sh-NC組中。敲除SOX2OT可降低肺轉(zhuǎn)移中N-鈣黏著蛋白的表達(dá)。i SOX2OT在膀胱癌中的致癌作用示意圖