circRNA綜述：環(huán)狀RNA在膠質(zhì)瘤中的作用及臨床意義

    CircRNAs是一類具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA分子，具有高度的穩(wěn)定性、豐度、保守性和顯示組織/發(fā)育階段特異性表達(dá)等特點(diǎn)，此外，基于不同體液或外泌體中的豐度，CircRNAs為癌癥的診斷和預(yù)后提供了新的生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)。近年來(lái)，miRNAs和RBPs海綿、翻譯以及轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)控等生物發(fā)生和分子功能的調(diào)控機(jī)制逐漸被揭開(kāi)，盡管許多方面仍有待結(jié)合深序列和生物信息學(xué)來(lái)闡明。越來(lái)越多的研究表明，CircRNAs在神經(jīng)元組織中更加豐富，部分原因是促進(jìn)環(huán)化的特異性基因的豐度較高，這表明CircRNAs的失調(diào)與包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。
    近期，一篇名為“Functions and clinical significance of circular RNAs in glioma”的綜述文章在Molecular Cancer（IF=10.679）上發(fā)表，就膠質(zhì)瘤的生物發(fā)生、功能、數(shù)據(jù)庫(kù)以及分子通路方面的最新進(jìn)展作總結(jié)，強(qiáng)調(diào)其作為膠質(zhì)瘤診斷或治療靶點(diǎn)的重要價(jià)值。

一、circRNA的生物發(fā)生和調(diào)控

圖一：該代表圖總結(jié)了circRNA的形成模型 a三種典型的環(huán)化形式。內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化是由順式作用的調(diào)控元件介導(dǎo)的，其中包括反向互補(bǔ)序列(Alu重復(fù))，從而促成側(cè)翼內(nèi)含子的直接堿基配對(duì)。套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化，內(nèi)含子對(duì)的套結(jié)形成使外顯子通過(guò)后向剪接跳過(guò)，形成ecircRNA或eIciRNA。反式作用因子，如RNA結(jié)合蛋白(RBPs)或幾種與側(cè)翼內(nèi)含子特定序列基序結(jié)合的剪接因子，促進(jìn)CircRNA的生物發(fā)生。富GU和富C元素有助于在規(guī)范剪接后產(chǎn)生內(nèi)含子RNA。 b基因間環(huán)狀RNA是由基因間的遠(yuǎn)距離區(qū)域產(chǎn)生的。 c 環(huán)狀LINC-PINT外顯子的形成。

二、環(huán)狀RNA的功能

圖二：CircRNA的潛在功能。CircRNA可作為miRNA海綿，調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的表達(dá)。CircRNA可以調(diào)節(jié)其親本基因的轉(zhuǎn)錄和剪接。CircRNA可以結(jié)合幾種蛋白質(zhì)來(lái)介導(dǎo)其作用。豐富的IRES和M6A修飾可以促進(jìn)多種CircRNA的翻譯，尤其是GBM的豐富。CircRNAs也可以作為存在于血清和其他體液中的分子生物標(biāo)記物，突出顯示對(duì)包括癌癥在內(nèi)的疾病進(jìn)行診斷和治療的重要價(jià)值。
1. CircRNA充當(dāng)miRNA海綿或競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA
    MiRNA介導(dǎo)的mRNA和相關(guān)信號(hào)通路的失調(diào)與癌癥的進(jìn)展和治療抗性密切相關(guān)。CircRNA可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(ceRNAs)或miRNA海綿來(lái)抑制miRNA，從而通過(guò)MREs上調(diào)靶基因的表達(dá)(圖2)。
2. 核circRNA調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和剪接
    環(huán)核糖核酸的加工自然影響其線性同源物的選擇性剪接，并與pre-mRNA剪接競(jìng)爭(zhēng)，這表明CircRNA與其線性異構(gòu)體之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。例如，CircMb1來(lái)源于MBL第二外顯子的環(huán)化，它可以與線性MBL mRNA競(jìng)爭(zhēng)，以維持典型剪接和環(huán)核糖核酸生產(chǎn)之間的平衡。另一種核保留的CircSEP3也被發(fā)現(xiàn)通過(guò)RNA：DNA雜交體或R-loop來(lái)調(diào)控其線性對(duì)應(yīng)物的剪接，上述這些研究表明一些定位的核環(huán)狀核糖核酸可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和剪接(圖2)。
3. CircRNA與RBP相互作用
    CircRNAs可以與不同的蛋白質(zhì)結(jié)合形成特異的CircRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物(CircRNPs)，從而調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)的作用、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位以及親本或相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄(圖2)。此外，CircRNAs還可以通過(guò)與翻譯因子的特異性結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)其同源mRNA的翻譯。特定的circRNA可以與不同的RBPs結(jié)合，而某些circRNA對(duì)不同的RBPs也具有動(dòng)態(tài)親和力。
4. CircRNAs 可被翻譯
    circRNA的翻譯在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的人類癌細(xì)胞中可能更為普遍。CircRNA和由這些circRNA編碼的肽/蛋白質(zhì)在腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展和侵襲中起著重要的作用。circRNAs編碼的肽的研究主要與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)，這表明circRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展中具有重要意義。
CircRNAs編碼的多肽/蛋白通常含有不到100個(gè)氨基酸，在調(diào)節(jié)腫瘤能量代謝、EMT轉(zhuǎn)移、c-Myc癌蛋白穩(wěn)定性等方面發(fā)揮著重要作用。因此，這些肽/蛋白是腫瘤治療的有希望的藥物靶點(diǎn)或預(yù)測(cè)患者臨床預(yù)后的生物標(biāo)志物，特別是在GBM(圖2)。
5. 其他功能
    由EML4-ALK融合基因產(chǎn)生的CircRNA F-CircEA可作為一種新的非小細(xì)胞肺癌液體活檢生物標(biāo)志物。穩(wěn)定的CircRNAs可以被逆轉(zhuǎn)錄，并最終作為加工假基因插入宿主基因組，通過(guò)提供額外的CTCF結(jié)合位點(diǎn)來(lái)重塑基因組結(jié)構(gòu)。CircANRIL與Peccadillo同系物1(PES1)結(jié)合，損害了核酸外切酶介導(dǎo)的Pre-rRNA加工和核糖體的生物發(fā)生。

三、CircRNA和神經(jīng)膠質(zhì)瘤
    CircRNA在神經(jīng)元組織中含量更高，并且在不同的大腦區(qū)域表現(xiàn)出差異表達(dá)。這種現(xiàn)象可能歸因于大量產(chǎn)生各種circRNA和剪接因子的蛋白編碼基因，以及調(diào)節(jié)circRNA形成的RBP。
1. circRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)
    越來(lái)越多的證據(jù)表明，CircRNAs的異常表達(dá)與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建表明，circRNA的改變，豐富了多種癌癥相關(guān)通路，是腦癌或神經(jīng)系統(tǒng)疾病的驅(qū)動(dòng)因素。
2. CircRNA充當(dāng)microRNA海綿，促進(jìn)增殖和侵襲

圖三：circRNA介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)與癌基因信號(hào)通路的代表圖。目前對(duì)膠質(zhì)瘤的研究強(qiáng)調(diào)了circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)對(duì)不同信號(hào)通路的調(diào)控關(guān)系。多種已鑒定的CircRNAs作為miRNA海綿發(fā)揮作用，隨后上調(diào)相關(guān)靶基因的表達(dá)水平。然而，這些靶基因或蛋白通過(guò)作為轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)蛋白等機(jī)制進(jìn)一步調(diào)節(jié)與癌癥信號(hào)通路相關(guān)的下游因子。圖中主要顯示CIRC-0000177通過(guò)miR-638/FZD7激活Wnt/β-catenin途徑。CircTTBK2、CircSHKBP1和CircHIPK3分別通過(guò)miR217/HNF1β、miR544a/foxp1和miR379/foxp2激活PI3K/AKT和MARK/ERK信號(hào)通路。另外，CircNPIX通過(guò)miR34a/NOTCH1激活Notch信號(hào)通路。更重要的是，包括miR-124、miR-29和miR-654等被circHIPK3海綿化的大量mirna，影響多種信號(hào)通路，提示circRNA介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)通過(guò)信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。
3. CircRNA通過(guò)癌癥相關(guān)的信號(hào)通路影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲
    CircRNA的異常表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)與癌癥相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)的互補(bǔ)miRNA或靶標(biāo)mRNA，如PI3K / AK / mTOR，Wnt /β-catenin，在膠質(zhì)瘤的增殖，細(xì)胞周期，侵襲和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用?？偟膩?lái)說(shuō)，與癌癥相關(guān)的通路與腫瘤發(fā)生、化療和抗輻射密切相關(guān)，識(shí)別更多參與腫瘤通路的CircRNAs對(duì)于進(jìn)一步了解膠質(zhì)瘤的分子生物學(xué)和開(kāi)發(fā)新的靶向治療方法具有重要意義。(圖3)。
4. CircRNA和血管生成
    缺氧和各種信號(hào)通路刺激腫瘤血管生成，缺氧也可以誘導(dǎo)circRNA的產(chǎn)生，而circRNA也參與了血管生成。RBPs可與CircRNA相互作用，參與腫瘤血管生成的調(diào)節(jié)。最近的一項(xiàng)研究提出，circSMARCA5作為海綿，作用于剪切因子絲氨酸和富含精氨酸的剪切因子1 (SRSF1)，在GBM中靶向并介導(dǎo)VEGFA的表達(dá)，從而表現(xiàn)出抗血管生成的功能(圖3)。
5. CircRNAs是膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后的潛在新型生物標(biāo)志物
    CircRNAs的鑒定和功能研究表明，CircRNAs可作為癌基因或腫瘤抑制基因調(diào)控下游靶基因，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。與其他ncRNA相比，ncRNA除了具有獨(dú)特的共價(jià)環(huán)狀結(jié)構(gòu)外，還有其他一些獨(dú)特的特征。具體地說(shuō)，1）沒(méi)有5 'caps和3 'poly (A)的尾巴的結(jié)構(gòu)特征使CircRNA對(duì)核酸外切酶具有抗性，半衰期大于48?h。2)大多數(shù)CircRNA的序列在不同物種間在進(jìn)化上是保守的。3)CircRNA表現(xiàn)出細(xì)胞類型、組織類型和發(fā)育特異性表達(dá)。4)CircRNA是通過(guò)獨(dú)占可變剪接產(chǎn)生的，并且在真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中大量存在。5)CircRNA在真核細(xì)胞的胞漿中大量存在。7)CircRNAs含量豐富，廣泛富集在外切體中。從臨床角度來(lái)看，CircRNA被證實(shí)廣泛存在于血液和液體(唾液、尿液、滑液)中。因此，這些特性促使CircRNAs成為膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)后和療效評(píng)價(jià)的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。細(xì)胞外小泡(EVs、外泌體和微泡)通過(guò)將分子運(yùn)輸?shù)街車h(huán)境中，從而改變或重新編程腫瘤微環(huán)境，在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它們含有各種分子的載體，如蛋白質(zhì)/肽、mRNA、非編碼RNA和DNA，這些分子決定了它們?cè)谀[瘤進(jìn)展、代謝調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、血管生成和治療耐藥中的作用。此外，由于它們的高度穩(wěn)定性和特異的差異表達(dá)模式，它們被認(rèn)為是很有前途的癌癥生物標(biāo)記物。（表1）

    目前，miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)特異性靶基因來(lái)調(diào)節(jié)TMZ敏感性已得到廣泛驗(yàn)證。所有相關(guān)研究都將使CircRNA成為有希望的診斷/預(yù)后生物標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)。
6. CircRNA和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的免疫治療
    PD-1/PD-L1檢查點(diǎn)阻斷是幾種腫瘤(包括膠質(zhì)瘤)的一種很有前途的靶向策略。然而，基于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的低免疫原性和免疫抑制微環(huán)境，盡管PD-L1上調(diào)是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞免疫治療的預(yù)后生物標(biāo)志物，但針對(duì)PD-1/PD-L1檢查點(diǎn)的效率低下主要?dú)w因于腫瘤的TME，如各種基因組亞型或分子譜。因此，迫切需要RT、TMZ、抗體聯(lián)合檢查點(diǎn)阻斷免疫治療。miRNAs與腫瘤免疫的關(guān)系是明確的，而CircRNA與抗腫瘤免疫密切相關(guān)。根據(jù)與miRNAs、蛋白結(jié)合的理論，腫瘤外體中的CircRNA可作為腫瘤抗原激活抗腫瘤免疫，是潛在的免疫治療靶點(diǎn)。這些不同的理論是預(yù)測(cè)性的，CircRNA-miRNA-mRNA和其他可用的RBPs對(duì)膠質(zhì)瘤免疫調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)機(jī)制還很薄弱，值得全面和深入的探討。

四、研究策略與鑒定
    高通量RNA-seq和芯片分析促進(jìn)了CircRNAs的檢測(cè)。生物信息學(xué)社區(qū)迅速發(fā)展了CircRNA探索過(guò)程，即從處理映射閱讀的自定義腳本到生產(chǎn)完整的工作流。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是繼計(jì)算預(yù)測(cè)之后進(jìn)一步研究CircRNAs功能的基礎(chǔ)。利用位于BSJ位點(diǎn)兩側(cè)的發(fā)散引物進(jìn)行QRT-PCR，證實(shí)在互補(bǔ)DNA(CDNA)中擴(kuò)增出環(huán)狀DNA，而在基因組DNA(GDNA)中沒(méi)有擴(kuò)增出環(huán)狀DNA，而Sanger測(cè)序證實(shí)了連接位點(diǎn)的存在?；虻那贸瓦^(guò)表達(dá)同樣應(yīng)用于CircRNAs功能的研究。通過(guò)反向剪接位點(diǎn)與同源線性RNA互補(bǔ)的小干擾RNA或短發(fā)夾狀RNA對(duì)線性核糖核酸的表達(dá)有潛在的影響，說(shuō)明應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格控制的小干擾RNA半序列(～10?NT)替換。

五、circRNA的數(shù)據(jù)庫(kù)
    為了促進(jìn)circRNA研究的分析，已經(jīng)有數(shù)個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)提供巨大的有價(jià)值的信息。