TAF1-急性髓系白血病的治療靶點(diǎn)

    TAF1在參與細(xì)胞周期和凋亡的基因表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。研究表明賴氨酸43（K43）在AE上被p300乙?；贏E誘導(dǎo)的白血病中起關(guān)鍵作用，并且TAF1優(yōu)先與乙?；腁E肽相互作用。那么小編給大家介紹一篇發(fā)表于nature communications上的文章“TAF1 plays a critical role in AML1-ETO driven leukemogenesis”，讓大家具體了解TAF1在白血病發(fā)生中的作用。

結(jié)果：
1.AE表達(dá)細(xì)胞的增殖需要TAF1
    為了闡明TAF1在AE表達(dá)細(xì)胞增殖中的作用，我們使用了兩種不同的TAF1 shRNA來(lái)降低Kasumi-1和SKNO-1兩種AML細(xì)胞系中TAF1的表達(dá)。通過(guò)TAF1的敲低抑制了這些細(xì)胞的增殖，表明TAF1對(duì)這些細(xì)胞的生長(zhǎng)至關(guān)重要。另外，我們?cè)诓槐磉_(dá)AE的K562白血病細(xì)胞系和CD34+ CB細(xì)胞中敲除TAF1。發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞中TAF1表達(dá)的減少與Kasumi-1細(xì)胞的減少相當(dāng)；然而，降低TAF1的表達(dá)對(duì)這些細(xì)胞的增殖幾乎沒(méi)有影響（圖1a-d）。因此，TAF1在AE表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)中起著特殊的作用。為了評(píng)估TAF1對(duì)細(xì)胞增殖的影響，我們使用BrdU標(biāo)記細(xì)胞并使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞周期。TAF1的敲低降低了Kasumi-1細(xì)胞在S期的比例，但對(duì)K562細(xì)胞和CD34+細(xì)胞在S期的比例沒(méi)有影響（圖1e-h），因此，TAF1對(duì)AE表達(dá)細(xì)胞的增殖尤為重要。

2.TAF1的敲低促進(jìn)髓細(xì)胞分化，損害自我更新
    我們檢測(cè)了人類細(xì)胞中Mac-1（CD11b）的表達(dá)以及小鼠細(xì)胞中Mac-1和Gr-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在兩種情況下，AE引起的髓細(xì)胞分化阻滯被TAF1敲低部分緩解。相比之下，TAF1敲低對(duì)無(wú)AE細(xì)胞的骨髓分化或這些標(biāo)志物的表達(dá)影響不大（圖2a，b）。綜上所述，TAF1參與了髓細(xì)胞分化的阻滯。連續(xù)重復(fù)菌落形成測(cè)定和鵝卵石區(qū)域形成測(cè)定（CAFC）實(shí)驗(yàn)表明TAF1敲低明顯抑制了AE驅(qū)動(dòng)的序列復(fù)制能力和CAFC形成（圖2c-e）。這些結(jié)果表明，TAF1促進(jìn)AE誘導(dǎo)的HSPC自我更新。

3.TAF1敲低抑制AE9a+細(xì)胞的增殖和自我更新
    為了確定TAF1敲低對(duì)表達(dá)AE9a的白血病細(xì)胞的影響，我們開發(fā)了AE9a+熒光素酶+細(xì)胞系，并使用如圖3a所示的次級(jí)脾白血病細(xì)胞。結(jié)果表明，TAF1的缺失損害了AE9a+白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖3b，c）。連續(xù)重復(fù)菌落形成測(cè)定和鵝卵石區(qū)域形成測(cè)定（CAFC）實(shí)驗(yàn)表明TAF1敲低降低了白血病細(xì)胞的集落形成，減少了鵝卵石樣區(qū)形成細(xì)胞（CAFCs）的數(shù)量（圖3d，e），說(shuō)明TAF1對(duì)于維持AE9a+白血病干細(xì)胞的自我更新和頻率至關(guān)重要。

4.TAF1在AE9a誘導(dǎo)的白血病發(fā)生中起關(guān)鍵作用
    為了確定TAF1是否參與AE9a驅(qū)動(dòng)的體內(nèi)白血病發(fā)生，我們使用兩種不同的TAF1定向shRNA敲除AE9a+熒光素酶+小鼠骨髓細(xì)胞系中的TAF1。注射TAF1 敲低的AE9a+細(xì)胞的小鼠存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于注射表達(dá)野生型TAF1水平的AE9a+細(xì)胞的小鼠（圖4a），這表明TAF1在白血病發(fā)展中起關(guān)鍵作用。進(jìn)一步，我們使用IVIS成像系統(tǒng)檢測(cè)小鼠AE9a+白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)接受TAF1 敲低的AE9a+熒光素酶+細(xì)胞的小鼠中只有1/16檢測(cè)到熒光素酶信號(hào)（圖4b，c）。為了進(jìn)一步證明TAF1缺失會(huì)影響小鼠白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)，我們使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)注射3周后外周血中標(biāo)記為AE9a+熒光素酶+的GFP細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行了量化，發(fā)現(xiàn)TAF1 敲低的GFP+細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖4d）。我們也注射了AE9a+白血病細(xì)胞，接受TAF1 敲低的細(xì)胞的小鼠存活時(shí)間更長(zhǎng)，外周血中GFP+ AE9a+細(xì)胞明顯減少（圖4e，f）。總之，這些數(shù)據(jù)表明TAF1在AE9a誘導(dǎo)的白血病發(fā)生中起關(guān)鍵作用，并可能成為抗白血病治療的潛在靶點(diǎn)。

5.TAF1與AE相關(guān)
    為了確定內(nèi)源性TAF1蛋白是否與白血病細(xì)胞中的全長(zhǎng)AE相關(guān)，我們使用抗TAF1和抗ETO抗體進(jìn)行了互惠共免疫沉淀。如圖5a, b所示，我們?cè)贙asumi-1細(xì)胞中檢測(cè)到TAF1與AE的物理相互作用。之后我們使用Kasumi-1細(xì)胞進(jìn)行TAF1免疫沉淀后的質(zhì)譜分析,并證實(shí)TAF1不僅結(jié)合AE，CBFβ，p300，還結(jié)合AE代數(shù)余子式SIN3A和HDAC1等（表1）。由于賴氨酸43（K43）在AE上的乙?；瘜?duì)AE驅(qū)動(dòng)的白血病是至關(guān)重要的，我們檢查了TAF1與AE結(jié)合是否需要賴氨酸43 (K43)的乙?；?。如圖5c所示，AE中賴氨酸-43突變?yōu)榫彼?，阻斷了AE與TAF1的相互作用。因此，賴氨酸-43乙?；瘜?duì)AE與TAF1的相互作用至關(guān)重要。為了確定TAF1中的溴域是否對(duì)識(shí)別AE上的K43乙?；痍P(guān)鍵作用，我們刪除了TAF1的兩個(gè)溴域，發(fā)現(xiàn)這消除了TAF1與AE的關(guān)聯(lián)（圖5d）。因此，TAF1通過(guò)其溴域與AE上的乙?；嚢彼?43結(jié)合。

6.AE靶基因的表達(dá)受TAF1缺失的影響
    鑒于TAF1在介導(dǎo)AML細(xì)胞AE作用中的重要性，我們探討了TAF1的敲低如何影響AE調(diào)控的基因表達(dá)。ID1和MYC是AE激活基因，我們證實(shí)它們?cè)贙asumi-1細(xì)胞中被AE敲低下調(diào)表達(dá)（圖6a）。接下來(lái)，我們發(fā)現(xiàn)TAF1在不降低AE表達(dá)水平的情況下也顯著降低了這些基因的表達(dá)（圖6b，d）。我們還利用AE9a+小鼠細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)TAF1的缺失會(huì)影響ID1和MYC的表達(dá)(圖6c)。另外我們發(fā)現(xiàn)36%的AE激活基因因TAF1敲低而下調(diào)（圖6e）。KEGG分析表明，這些基因參與了DNA復(fù)制、RNA剪接、RNA運(yùn)輸、細(xì)胞周期、核苷酸代謝和核糖體生物發(fā)生。令人驚訝的是，TAF1敲低也上調(diào)了許多基因，其中26%的基因在AE敲低后上調(diào)（圖6f）。顯然，TAF1對(duì)于AE激活基因和被抑制基因的一個(gè)子集的表達(dá)至關(guān)重要，這暗示了TAF1在調(diào)節(jié)AE靶基因表達(dá)方面的獨(dú)特作用。

7.TAF1是AE與染色質(zhì)結(jié)合的關(guān)鍵
    為了評(píng)估TAF1在AE染色質(zhì)沉積中的作用，我們生成了含有或不含TAF1敲低的Kasumi-1細(xì)胞亞細(xì)胞組分。如圖7a所示，TAF1敲低對(duì)AE在染色質(zhì)上結(jié)合的影響具有特異性。為了研究TAF1和AE在整個(gè)基因組中是否共定位于AE靶基因，我們?cè)贙asumi-1細(xì)胞中使用抗AML1-ETO抗體和抗TAF1抗體進(jìn)行ChIP-seq。如圖7b所示，AE峰廣泛分布于遠(yuǎn)端基因間區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)和內(nèi)含子，而TAF1峰大部分位于啟動(dòng)子區(qū)，這可能反映了TAF1在PIC中的作用。此外我們發(fā)現(xiàn)58%的TAF1峰與AE峰重疊，而19%的AE峰與TAF1峰重疊（圖7c）。KEGG分析表明，重疊的峰值與急性和慢性髓系白血病相關(guān)的基因和癌癥中的通路相鄰。大部分重疊AE和TAF1峰位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(附近（圖7d）。然而，從TSS(非TSS)可以看到大量的重疊峰（圖7e）。非TSS的TAF1/AE重疊峰約60%位于假定的增強(qiáng)子上。這說(shuō)明了TAF1/AE復(fù)合物在這些通路中的重要性。鑒于p300的乙?；饔脤?duì)TAF1和AE的相互作用至關(guān)重要，我們研究了p300是否與TAF1和AE共享空間。如圖7f所示，28%的AE/TAF1共存區(qū)域也有p300結(jié)合，如ID1基因的增強(qiáng)子(圖7g)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，TAF1與AE在啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域的結(jié)合對(duì)AE靶基因的一個(gè)子集的表達(dá)至關(guān)重要，這些AE靶基因與細(xì)胞周期和白血病有關(guān)。

8.TAF1抑制降低了表達(dá)AE的細(xì)胞的增殖
    鑒于TAF1在AE細(xì)胞增殖中的重要作用，我們檢測(cè)了bay364和bay299對(duì)Kasumi-1、K562和CD34+細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。如圖8a，d所示，與CD34+細(xì)胞或K562細(xì)胞相比，Kasumi-1細(xì)胞對(duì)bay364處理更敏感，其生長(zhǎng)受到的影響最小。與此相反，bay299可抑制Kasumi-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，但對(duì)CD34+細(xì)胞和K562細(xì)胞有類似的作用（圖8b, d）。JQ-1比bay364更能抑制Kasumi-1細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖8c)；然而，它對(duì)Kasumi-1細(xì)胞和CD34+細(xì)胞有類似的作用。接下來(lái)，我們使用經(jīng)bay364或vehicle處理3天的Kasumi-1細(xì)胞檢測(cè)bay364對(duì)AE介導(dǎo)的基因表達(dá)的影響。bay364可降低ID1和MYC的表達(dá)，但不影響AE的表達(dá)，與TAF1敲低作用相似（圖8e）。為了評(píng)估第二個(gè)TAF1 結(jié)構(gòu)域在控制TAF1和AE調(diào)控基因中的重要性，我們將TAF1敲低和AE敲低實(shí)驗(yàn)的RNA-seq數(shù)據(jù)與Kasumi-1細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較?？偟膩?lái)說(shuō)，由TAF1敲低和AE敲低鑒定的39%的AE和TAF1調(diào)節(jié)的基因也受TAF1溴域抑制劑的控制。這些基因在細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、代謝和凋亡中發(fā)揮作用（圖8g）。此外，bay364處理顯著影響AE9a+細(xì)胞的集落形成（圖8f）。綜上所述，通過(guò)調(diào)節(jié)AE靶基因的一個(gè)關(guān)鍵子集，第二個(gè)TAF1結(jié)構(gòu)域似乎對(duì)AE表達(dá)細(xì)胞的生存和集落形成具有選擇性的重要性。

結(jié)論:
    在本研究中，我們證實(shí)TAF1與白血病細(xì)胞AE相關(guān)，TAF1的KD的下調(diào)破壞了自身的更新，促進(jìn)了AML細(xì)胞的髓樣分化和凋亡，從而阻礙了白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，TAF1的缺失降低了AE與染色質(zhì)的聯(lián)系及其調(diào)控AE激活基因和抑制基因表達(dá)的能力。總之，這些結(jié)果揭示了TAF1在AE驅(qū)動(dòng)的白血病發(fā)生中的獨(dú)特作用， TAF1有可能成為表達(dá)急性骨髓性白血病的治療靶點(diǎn)。