小RNA測序的11分雜志攻略

導(dǎo)語:
    細(xì)胞外泡(EVs)在正常的肺生理中起著重要的作用，通過細(xì)胞間通訊維持氣道內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。ev包括外泌體和微囊泡，并以其磷脂雙層為特征。EVs被認(rèn)為是一種新型的疾病循環(huán)生物標(biāo)志物，由不同類型的細(xì)胞釋放。EV miRNAs的生物分析對于開發(fā)可用于COPD診斷、預(yù)后和治療的生物標(biāo)志物具有巨大的轉(zhuǎn)化潛力。近期，一篇名為“Small RNA-sequence analysis of plasma-derived extracellular vesicle miRNAs in smokers and patients with chronic obstructive pulmonary disease as circulating biomarkers”的文章在雜志Journal of extracellular vesicles（IF=11）上發(fā)表，首次報(bào)道血漿來源的EV miRNAs是一種新的循環(huán)肺部疾病生物標(biāo)志物。

技術(shù)路線:

研究結(jié)果:
1.人血漿衍生EV的分離和表征鑒定
    對6名非吸煙者、6名吸煙者和8名慢性阻塞性肺病患者的EV/外泌體分離和特征進(jìn)行了全面分析，并對人血漿來源的EV進(jìn)行了小RNA測序。對等離子體衍生的ev進(jìn)行了透射電鏡(TEM)、納米顆粒跟蹤分析(NTA)和可調(diào)電阻脈沖傳感(TRPS)，其范圍在50-150 nm之間, TEM分析證實(shí)了從非吸煙者、吸煙者和COPD患者的血漿樣本中分離出的杯狀ev的形態(tài)ogy。非吸煙者、吸煙者和慢性阻塞性肺病患者EVs濃度的數(shù)據(jù)顯示，在顆粒大小分布或總顆粒數(shù)方面沒有顯著差異，但在三組中均顯示外泌體的大小范圍內(nèi)富含vesi- cles。進(jìn)行了微BCA蛋白質(zhì)分析量化exosomal總額之間相對比較孤立的EV出現(xiàn)在所有三組。從非吸煙者、吸煙者和COPD患者中分離出的等離子體衍生EVs中，TSG- 101、rab5b和Alix的外泌體標(biāo)記物富集。從人血漿樣品中分離的ev不含calnexin或GRP94，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白未受污染。

 
 
2.EV標(biāo)記證明被人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)所攝取
    使用來自血漿的EV非吸煙組和吸煙者組使用ExoGlow-membrane EV labelling kit試劑盒進(jìn)行標(biāo)簽。將標(biāo)記的ev加入到BEAS-2B細(xì)胞中，以驗(yàn)證人支氣管上皮細(xì)胞對血漿來源的EV的吸收。紅色熒光標(biāo)記的電動汽車被確定在BEAS-2B細(xì)胞,表明EVs的吸收。生活共焦顯微鏡圖像從不同地區(qū)獲得24小時后的后處理貼上EVs BEAS-2B細(xì)胞陽性顯示約50 - 60%的標(biāo)簽EVs不吸煙和吸煙組。

 
 
3.輸入Read校準(zhǔn)和小RNA生物型映射           
    Exosomal RNA濃度在人類plasma-derived EVs不吸煙,吸煙者和COPD患者59和310 pg /μl之間不等，各種小RNA生物型的百分比分布對人類基因組的reads進(jìn)行分類。每組小RNA生物型的平均reads總數(shù)在110萬到140萬之間。我們觀察到一個不同的模式和生物型豐富的百分比分布非吸煙者,吸煙和慢性阻塞性肺病患者。microRNA(24.9 - 31.9%, 15.9 22.9%和58.9 6.4%),tRNA(23.3 - 24.3%, 26.5 23.8%和11.1 2.5%)和protein_coding(25.2 - 16.9%, 25.7 16.7%和10.2 2.8%)生物型的最高濃縮生物型非吸煙者,吸煙和慢性阻塞性肺病患者,分別。misc_RNA和lincRNA的生物型分別為3.0% - 8.2%和0.5% - 2.9%。最后,piRNAs (0.6 - 2.6%), Mt_rRNAs (0.1 - 0.6%), Mt_tRNAs(0.1%)、核內(nèi)小RNA(0.1 0.5%)和snoRNA(0.1 0.3%)至少代表生物型的非吸煙者,吸煙和慢性阻塞性肺病患者。生物型分布百分比為個人所有三組樣本表示在圖2(表3)。

4.非吸煙者、吸煙者與COPD患者的miRNA比較
    從所有三組(非吸煙者、吸煙者和COPD患者)中總共識別出329種不同的miRNA。只有219個miRNA序列的平均讀數(shù)大于5 /百萬。139個、115個和198個總miRNA分別存在于非吸煙者、吸煙者和慢性阻塞性肺病患者的等離子體衍生外體RNA中。比較吸煙者和COPD時，兩組之間共有111個miRNA。非吸煙者、吸煙者和COPD組患者均有一定數(shù)量的miRNAs(分別為17、3和65)，這些miRNAs是各組特有的。在比較不吸煙者和吸煙者時發(fā)現(xiàn)了五種差異表達(dá)的miRNA。當(dāng)我們比較非吸煙者和慢性阻塞性肺病患者時，發(fā)現(xiàn)了21種不同具體表達(dá)的miRNA。此外，當(dāng)對比吸煙者與COPD時，發(fā)現(xiàn)15個miRNA有差異表達(dá)。在非吸煙者與吸煙者之間以及吸煙者與COPD之間的比較中，只發(fā)現(xiàn)了一個共同的差異表達(dá)的miRNA;在非吸煙者vs. COPD和吸煙者vs. COPD比較中共鑒定出24種miRNA，三種不同的兩兩比較中均未發(fā)現(xiàn)相同的miRNA。使用三個比較組中發(fā)現(xiàn)的前20個最豐富的miRNA來分析這些獨(dú)特的miRNA。結(jié)果顯示17 microRNA豐富的存在在所有三組,1獨(dú)特的microRNA的每個非吸煙者和吸煙者組和2獨(dú)特的microRNA在COPD患者組,前20名中有豐富的microRNA。在不吸煙者與smo- kers、不吸煙者與COPD、吸煙者與COPD成對比較中，miRNA的表達(dá)有顯著差異，采用層次聚類方法進(jìn)行聚類分析。通過測試統(tǒng)計(jì)和P值來選擇每對比較中識別出的候選miRNA。此外，我們還使用調(diào)整后的P值P < 0生成熱圖和兩兩比較的層次聚類分析。0 1。只有6個獨(dú)特的miRNA在非吸煙者與COPD和吸煙者與COPD兩兩比較中有差異表達(dá)。我們沒有觀察到任何miRNA候選體在非吸煙者與吸煙者兩兩比較中使用調(diào)整后的p值有差異表達(dá)。

 

5.非吸煙者、吸煙者與COPD患者tRNAs的比較
所有三組(非吸煙者、吸煙者和COPD患者)中總共識別出25個不同的tRNA。通過分析三組的平均讀計(jì)數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)了六種不同的tRNA: tRNALys、tRN AGly、tRN ACys、tRN AAla、tRNAGluand tRNAValto是本研究發(fā)現(xiàn)的25種富含等離子體源EV tRNA中最豐富的tRNA片段。在非吸煙者和吸煙者中有差異。比較非吸煙者和COPD時，發(fā)現(xiàn)了5個差異表達(dá)的tRNAs(兩個獨(dú)特的tRNALysand tRNAGlu;三種常見的tRNAGly, tRN異型tRNA)和在吸煙者與COPD組中的比較(兩種獨(dú)特的tRNALeu和tRNAMet;三種常見tRNAGly t R N ATyrand tRNA),和所有的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA被發(fā)現(xiàn)在普遍不吸煙者和吸煙者不吸煙與慢性阻塞性肺病和吸煙與慢性阻塞性肺病成對比較。非吸煙者與吸煙者、非吸煙者與COPD、吸煙者與COPD兩兩比較中，tRNAs有顯著性差異表達(dá)，采用層次聚類方法進(jìn)行聚類分析。在25個富集tRNAs中，5個tRNAs在非吸煙者與COPD和吸煙者與COPD中存在差異表達(dá)，并且在25個富集tRNAs中存在兩兩獨(dú)特和三種常見的兩兩比較。我們沒有觀察到任何tRNA候選基因在非吸煙者和吸煙者兩兩比較中均有差異表達(dá)。 

6.非吸煙者、吸煙者與COPD患者的piRNAs比較
    從所有三組(非吸煙者、吸煙者和COPD患者)中總共識別出34種不同的piRNAs。通過分析所有三組的平均read數(shù)，發(fā)現(xiàn)三種不同的piRNAs: piro -016658、piro -016659和piro -019825，它們是血漿衍生EV富含34種piRNAs中最豐富的。無法在不吸煙者和吸煙者中檢測到任何獨(dú)特的差異表達(dá)的piRNAs。當(dāng)比較非吸煙者與COPD組(pi -012753)和吸煙者與COPD組(pi -016735)時，發(fā)現(xiàn)一個獨(dú)特的piRNA表達(dá)差異。在com- mon中僅發(fā)現(xiàn)一個piRNA (pi -020813)，非吸煙者與吸煙者、非吸煙者與COPD、吸煙者與COPD兩兩比較中存在顯著性差異的piRNAs表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了兩種piRNAs(一種獨(dú)特的:12 I. K. SUNDAR等人的piR-012753和一種常見的:piR-020813)在非吸煙者與非吸煙者、吸煙者與COPD兩兩比較時存在差異。

 
7.miRNA的功能過表達(dá)分析(ORA)和基因集富集分析(GSEA)
    對差異表達(dá)的miRNA(非吸煙者vs.吸煙者、非吸煙者vs. COPD、吸煙者vs. COPD)進(jìn)行了功能性過表達(dá)分析(ORA)和基因集富集分析(GSEA)。發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的重要濃縮microRNA從屬于類別的非吸煙者和吸煙者基因本體論(去)和目標(biāo)基因。奧拉非吸煙者的差異表達(dá)miRNA與慢性阻塞性肺病屬于類似的識別重要的充實(shí)等途徑。奧拉在非吸煙者與慢性阻塞性肺病的比較顯示,濃縮的smoking-mediated信號通路如細(xì)胞凋亡信號通路,通過趨化因子和細(xì)胞因子信號通路介導(dǎo)的炎癥,氧化應(yīng)激反應(yīng),這與各自相關(guān)基因本體和疾病。miRNA的功能過表達(dá)分析吸煙者和 COPD也顯示出明顯的miRNA靶點(diǎn)富集，miRNA表達(dá)(不吸煙與慢性阻塞性肺病com -半成品)顯示出上調(diào)。使用非吸煙者與吸煙者配對比較中差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行GSEA。由于這些比較中差異表達(dá)的miRNA數(shù)量較少，我們沒有獲得任何富集數(shù)據(jù)。當(dāng)我們進(jìn)行GSEA利用非吸煙者的差異表達(dá)miRNA與慢性阻塞性肺病,兩類(通路和基因本體)顯示富集,觀察到在奧拉數(shù)據(jù)分析以及免疫細(xì)胞(CD19, CD3和CD56),發(fā)現(xiàn)新通路在GSEA途徑豐富利用吸煙與慢性阻塞性肺病的差異表達(dá)miRNA成對比較。這包括p53通路反饋環(huán)2、參與DNA損傷反應(yīng)(DDR)的miRNA、G1對S細(xì)胞周期的控制、肌動蛋白骨架的調(diào)節(jié)和DNA損傷反應(yīng)。

8. miRNA的數(shù)據(jù)庫搜索/分析
    在數(shù)據(jù)庫中搜索了調(diào)整后的顯著性p值(非吸煙者與COPD之間的miR-151a-5p;miR-151b、miR-335-5p、miR-320d、miR-628-3p miR-877-5p和miR-937-3p)和吸煙者與COPD (miR- 22-3p、miR-99a-5p、miR-320b、miR-320d、miR-877-5p和miR-937-3p)的比較。EV miRNA、ExoCarta、Vesiclepedia和miRDB數(shù)據(jù)庫的搜索結(jié)果證實(shí)，上面列出的大多數(shù)miRNA之前都在血清/血漿、腦脊液和/或結(jié)直腸can- cer細(xì)胞來源的外泌體/EV中得到了富集/鑒定。此外，一些miRNAs也在尿液中被發(fā)現(xiàn)，其中一個在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞來源的exo- somes/ ev中被發(fā)現(xiàn)。

9.通過實(shí)時熒光定量PCR和nanostring分析對選定的RNA-seq miRNA進(jìn)行驗(yàn)證
    使用人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)，加入或不加入CSE(0.5%) 3天，從條件培養(yǎng)基中分離外泌體/ ev到RNA-seq分析中鑒定的有效的選定miRNA。選擇了11種不同的miRNA (miR-let-7a-5p, miR- let-7i-5p, miR-29a-3p, miR-92a-3p, miR-99a-5p, miR- 100-5p, miR-151b, miR-184, miR-375, miR-486-5p和miR-584-5p)。 qPCR結(jié)果顯示，11個miRNA中有8個在BEAS-2B細(xì)胞的CSE來源的外泌體中表達(dá)顯著增加控制。其余三個microRNA并沒有顯示出顯著改變他們exosomal CSE之間microRNA的表達(dá)水平與對照組。選擇了11種不同的miRNAs (miR-let-7a-5p、miRlet-7i-5p、miR-23b-3p、miR-25-3p、miR-29a-3p、miR-92a-3p、miR-99a-5p、miR-103a-3p、miR-128-3p、miR-151b和miR-375)。qPCR分析未發(fā)現(xiàn)U937細(xì)胞的外泌體與cse來源的外泌體相比有顯著變化。數(shù)據(jù)表明，在吸煙者和COPD患者中發(fā)現(xiàn)的一些系統(tǒng)miRNA生物標(biāo)志物(血漿來源的外體miRNA)有可能成為新的環(huán)狀外體miRNA生物標(biāo)志物。通過使用nSolver分析軟件4.0對樣本中100個高表達(dá)miRNA的總數(shù)進(jìn)行NanoString分析顯示，兩組之間有13個miRNA存在差異表達(dá)。與對照組相比，cse處理組中有5個miRNA被下調(diào)(miR-574-5p、miR- 575、miR-146a-5p、miR-320e和miR-181a-5p)， 8個miRNA被上調(diào)(miR-15a-5p、miR- 130a-3p、miR-19b-3p、miR-99a-5p、miR-30a- 3p、miR-25-3p和miR-32-5p)和。值得注意的是, 在CSE處理組中發(fā)現(xiàn)的13個miRNA中有兩個(miR-99a-5p和miR-25-3p)差異表達(dá)。

總結(jié):
    總之，從非吸煙者、吸煙者和COPD患者中分離和鑒定血漿來源的EVs/外泌體。我們使用小RNA測序分析來鑒定ncRNA類的富集，如miRNA、tRNA、lincRNA、piRNAs、snRNAs、snoRNAs等生物類型。特別關(guān)注miRNA、tRNAs和piRNAs的差異表達(dá)(DESeq2)，以及單獨(dú)用于進(jìn)一步分析(包括驗(yàn)證)的miRNA。選擇了差異顯著的兩兩比較的miRNA，并通過ev的qPCR分析和使用NanoString技術(shù)的人類miRNA面板對對照組與經(jīng)cse處理的BEAS-2B細(xì)胞的總RNA進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證?；蚣患治鼋沂玖嗽谡{(diào)節(jié)慢性阻塞性肺病患者和吸煙者的cyto- kine信號(炎癥)、細(xì)胞外基質(zhì)和組織重塑的生物學(xué)通路中起關(guān)鍵作用的幾個靶點(diǎn)。未來的研究正在進(jìn)行中，以確定EV生物標(biāo)記物使用不同的體液，如血清/血漿、BAL液、尿液，來自非吸煙者、吸煙者和COPD患者，以發(fā)現(xiàn)局部與系統(tǒng)循環(huán)的EV生物標(biāo)記物之間可能的關(guān)系。