載脂蛋白C3在炎癥中的新功能
NLRP3-炎癥體驅(qū)動(dòng)的炎癥與多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。內(nèi)源性炎癥因子激活劑的鑒定對(duì)于開發(fā)新的抗炎治療策略至關(guān)重要。德國薩爾蘭大學(xué)Thimoteus Speer研究組發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白C3通過替代激活炎性小體誘導(dǎo)炎癥和器官損傷。該研究2019年12月9日在線發(fā)表在國際學(xué)術(shù)期刊Nature Immunology：《自然—免疫學(xué)》，影響因子= 23.53的一篇論文“Apolipoprotein C3 induces inflammation and organ damage by alternative inflammasome activation”。該研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白C3(Apo3)通過胱天蛋白酶-8和Toll樣受體2和4的二聚化誘導(dǎo)另一種NLRP3炎癥體，從而激活人單核細(xì)胞中的NLRP3炎癥體。為NLRP3炎癥體的調(diào)節(jié)和含有ApoC3的富含甘油三酯脂蛋白的病理生理學(xué)作用提供了新的見解。靶向ApoC3可以防止器官損傷，并為血管和腎臟疾病提供抗炎治療。
亮點(diǎn)：
（1）該研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白C3(ApoC3)通過caspase-8和Toll樣受體2和4二聚化的方式誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的替代激活，從而激活了人單核細(xì)胞中的NLRP3炎性小體。
（2）人單核細(xì)胞中炎性小體的替代激活受Toll樣受體蛋白SCIMP的調(diào)控。這種激活引起Lyn / Syk依賴的鈣離子進(jìn)入和活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致caspase-8的活化。
（3）在人源化的小鼠模型中，ApoC3在體內(nèi)以NLRP3和caspase-8依賴性方式激活人單核細(xì)胞從而阻止內(nèi)皮再生并促進(jìn)腎臟損傷。
結(jié)果分析：
一、ApoC3誘導(dǎo)無菌炎癥
低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)處理了人單核細(xì)胞，并確定了IL-1β的釋放。與HDL和LDL相反，VLDL刺激了IL-1β的釋放(圖1a)。脫脂的VLDL刺激的IL-1β釋放的程度與天然VLDL相似，表明VLDL的蛋白質(zhì)部分可能是其對(duì)IL-1β釋放的影響(圖1b)。蛋白質(zhì)組學(xué)分析檢測到ApoC3，ApoE和ApoC2是VLDL顆粒中三種最豐富的蛋白質(zhì)。用這些載脂蛋白孵育單核細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)只有ApoC3才能誘導(dǎo)IL-1β釋放(圖1c)。六個(gè)獨(dú)立分離的脂蛋白制劑的VLDL級(jí)分中檢測到大量的ApoC3(圖1d)。盡管HDL也包含ApoC3，但它本身并沒有誘導(dǎo)IL-1β釋放，甚至沒有降低ApoC3驅(qū)動(dòng)的IL-1β釋放(圖1e)，這表明HDL及其主要成分ApoA1減少了炎性體的激活，這與之前的研究一致報(bào)告。 ApoC3與人單核細(xì)胞直接相互作用(圖1f)并誘導(dǎo)IL-1β的釋放，但也誘導(dǎo)非炎性體依賴性細(xì)胞因子白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF)的濃度依賴性方式(圖1g–i)。這表明ApoC3可能激活NLRP3炎性體以誘導(dǎo)IL-1β釋放。
圖1:Apo3誘導(dǎo)全身炎癥
二、ApoC3激活人類單核細(xì)胞中的另一種炎性體途徑
ApoC3能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞釋放IL-1β，而無需使用先前報(bào)道為生理學(xué)相關(guān)濃度的TLR配體(圖2a)進(jìn)行預(yù)刺激。直接從人血漿中分離的ApoC3誘導(dǎo)的IL-1β釋放的程度與整個(gè)研究中使用的來自商業(yè)供應(yīng)商的ApoC3的釋放程度相似(圖2b)。正如預(yù)期的那樣，ApoC3處理誘導(dǎo)了IL-1β和caspase-1的成熟(圖2c)。因此，caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK廢除了ApoC3誘導(dǎo)的IL-1β釋放(圖2d)，表明ApoC3釋放IL-1β涉及caspase-1的激活。相反，ApoC3僅誘導(dǎo)小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞(BMDM)中的IL-1β適度釋放，與人單核細(xì)胞相比降低了十倍(圖2e)。ApoC3不會(huì)誘導(dǎo)焦磷酸化細(xì)胞死亡(圖2f)或ASC斑點(diǎn)的形成(圖2g)。此外，ApoC3介導(dǎo)的IL-1β釋放不依賴于人類單核細(xì)胞中的鉀流出(圖2h)。因此，ApoC3不會(huì)誘導(dǎo)加德明D的裂解(圖2i)。已經(jīng)描述了人類單核細(xì)胞可以獨(dú)立于鉀外排和熱解而響應(yīng)LPS參與其他的炎性體活化，這需要通過Toll / interleukin-1受體域的適配器誘導(dǎo)干擾素-β(TRIF)受體進(jìn)行TLR依賴性信號(hào)傳導(dǎo)-相互作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(RIPK1)和胱天蛋白酶8。 ApoC3處理誘導(dǎo)了caspase-8的裂解(圖2j)，并且對(duì)caspase-8的催化抑制作用顯著降低了ApoC3驅(qū)動(dòng)的IL-1β釋放(圖2k)。此外，通過特異性抑制劑抑制RIPK1和TRIF可以顯著降低響應(yīng)ApoC3的單核細(xì)胞IL-1β釋放(圖2l)。這些發(fā)現(xiàn)表明，ApoC3代表人類單核細(xì)胞中替代性炎性體激活的新型誘導(dǎo)劑。
圖2:Apo3誘導(dǎo)選擇性NLRP3炎癥體激活
三、ApoC3需要TLR2和TLR4異二聚體誘導(dǎo)誘導(dǎo)的炎性體激活
NF-κB抑制劑Bay 11-7082完全廢除了ApoC3誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生(圖3a)。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)和應(yīng)激激活的蛋白激酶( SAPKs)/ c-Jun氨基末端激酶(JNK)(圖3b)。此外，ApoC3能夠引發(fā)人類單核細(xì)胞進(jìn)行經(jīng)典的炎性體激活(圖3c)。 ApoC3與被Tlr2或Tlr4相似轉(zhuǎn)染的人類胚胎腎臟(HEK)細(xì)胞相互作用(圖3d，e)。因此，對(duì)TLR2或TLR4的抗體阻斷減少了人類單核細(xì)胞中ApoC3誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生(圖3f)?？贵w對(duì)TLR2或TLR4的阻斷降低了ApoC3與人類單核細(xì)胞的相互作用(圖3g)。為了測試是否需要ApoC3的內(nèi)在化來誘導(dǎo)IL-1β釋放，將ApoC3固定在細(xì)胞培養(yǎng)板上，然后將其接種在人單核細(xì)胞上(圖3h)。接下來，單獨(dú)或組合用TLR4配體LPS或TLR2配體Pam3CSK4刺激人類單核細(xì)胞，以評(píng)估每個(gè)TLR的個(gè)體貢獻(xiàn)(圖3i)。與單獨(dú)用LPS處理的細(xì)胞相比，用Pam3CSK4刺激LPS引發(fā)的細(xì)胞可導(dǎo)致更高的IL-1β產(chǎn)生和釋放以及caspase-1裂解(圖3j)。在未刺激的細(xì)胞中，CFP和YFP熒光主要定位在細(xì)胞質(zhì)中(圖3k)。這些發(fā)現(xiàn)表明，TLR2和TLR4的異二聚體是ApoC3誘導(dǎo)的炎性體激活的關(guān)鍵介質(zhì)。
圖3:Apo3誘導(dǎo)TLR2和TLR4的異二聚化
四、炎性體的替代活化需要鈣依賴性超氧化物的產(chǎn)生
鈣離子在ApoC3介導(dǎo)的IL-1β的產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用(圖4a)。鈣螯合劑還阻止了LPS依賴性IL-1β的產(chǎn)生。因此，ApoC3誘導(dǎo)細(xì)胞鈣內(nèi)流(圖5c)。瞬時(shí)受體電位陽離子通道(TRPM2)抑制劑氟芬那酸，而不是儲(chǔ)庫操縱的鈣進(jìn)入抑制劑BTP-2或磷脂酶C抑制劑U-73122，顯著降低ApoC3誘導(dǎo)的IL-1β釋放(圖4b)。通過電子自旋共振(ESR)光譜測量，ApoC3和LPS處理均顯著增加了超氧化物的產(chǎn)生(圖4c，d)。在鈣螯合劑存在下，ApoC3誘導(dǎo)的超氧化物產(chǎn)生減少(圖4e)。用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)，黃素蛋白抑制劑DPI或NADPH氧化酶抑制劑VAS-2870預(yù)處理單核細(xì)胞，幾乎完全消除了響應(yīng)ApoC3和LPS的IL-1β釋放，同時(shí)阻斷了使用MitoTEMPO的線粒體ROS無效(圖4f)。該發(fā)現(xiàn)表明氧化應(yīng)激觸發(fā)了交替的炎性體活化的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致IL-1β的產(chǎn)生。ApoC3增加了單核細(xì)胞中TXNIP的表達(dá)，這被BAPTA-AM和NAC廢除了(圖4i)。
圖4:替代性炎癥體激活需要鈣依賴性超氧化物產(chǎn)生
五、可選的炎性體激活涉及銜接蛋白SCIMP
為了探討LPS和ApoC3對(duì)TLR的激活如何轉(zhuǎn)化為替代的炎癥小體激活，集中研究了脾酪氨酸激酶(Syk)，它已被證明有助于NLRP3炎癥小體激活。ApoC3和LPS觸發(fā)了Syk的磷酸化(圖5a)。因此，抑制Syk可防止LPS和ApoC3誘導(dǎo)的IL-1β釋放(圖5b)。為了確定Syk是否代表上游信號(hào)誘導(dǎo)鈣流入和隨后的超氧化物產(chǎn)生，在Syk抑制劑R406存在的情況下測量了細(xì)胞鈣通量(圖5c)。Syk的抑制顯著降低了人類單核細(xì)胞中ApoC3介導(dǎo)的鈣內(nèi)流以及超氧化物的產(chǎn)生和TXNIP表達(dá)(圖5c-e)。用LPS或ApoC3刺激的人單核細(xì)胞中進(jìn)行了交聯(lián)實(shí)驗(yàn)，并觀察到另一個(gè)高分子量條帶，將其切下并進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析(圖5f)。值得注意的是，在用LPS或ApoC3刺激后，檢測到了跨膜蛋白SCIMP(圖5g)。因此，LPS或ApoC3增加了人單核細(xì)胞中SCIMP的表達(dá)(圖5h)。ApoC3迅速誘導(dǎo)了人類單核細(xì)胞中SCIMP，Lyn和Syk之間的相互作用(圖5i)。ROS清除鈣螯合和Syk抑制減少了LPS響應(yīng)時(shí)前caspase-8的加工，表明SCIMP介導(dǎo)的Syk激活可能代表了caspase-8依賴性替代性炎性體激活的上游事件(圖5j– l)。
圖5:替代性炎癥體激活涉及銜接蛋白SCIMP
六、ApoC3在體內(nèi)誘導(dǎo)人源化小鼠的器官損傷
由于ApoC3激活的其他炎性體激活僅限于人類單核細(xì)胞，因此使用了人源化的小鼠模型。通過流式細(xì)胞術(shù)確定，ApoC3誘導(dǎo)了NOD-SCID小鼠移植人單核細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)(圖6a)。 為了評(píng)估ApoC3對(duì)血管再生的作用，使用血管周圍頸動(dòng)脈損傷模型(圖6b)。頸動(dòng)脈損傷后三天，與用PBS處理的小鼠相比，在用人單核細(xì)胞重組并注射ApoC3的小鼠中，受損頸動(dòng)脈的重新內(nèi)皮化顯著減少(圖6c，d)。在用特異性NLRP3抑制劑MCC950或caspase-8抑制劑Z-IETD-FMK治療的小鼠中，ApoC3對(duì)再內(nèi)皮化的抑制作用消失了(圖6e，f)。將用PKH67標(biāo)記的人單核細(xì)胞重構(gòu)的NOD-SCID小鼠進(jìn)行單側(cè)輸尿管結(jié)扎，作為腎臟損傷的模型(圖6g)。重要的是，ApoC3強(qiáng)烈增強(qiáng)了腎臟的損害，如擴(kuò)張的腎小管百分比增加所示(圖6h-i)。因此，在經(jīng)ApoC3處理的小鼠中，在受傷的腎臟中積聚的人類單核細(xì)胞數(shù)量明顯更高(圖6j，k)。這些發(fā)現(xiàn)表明，ApoC3介導(dǎo)的人類單核細(xì)胞活化導(dǎo)致體內(nèi)器官損傷增加。
圖6:Apo3和人單核細(xì)胞在體內(nèi)誘導(dǎo)器官損傷
七、ApoC3與死亡率增加有關(guān)
在急性心肌梗塞(AMI)和CKD患者中測量ApoC3血漿濃度，以強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性。與健康受試者相比，在患有AMI和CKD的患者中，ApoC3血漿濃度顯著更高(圖7a，b)。路德維希港風(fēng)險(xiǎn)與心血管健康(LURIC)研究的3,313名參與者進(jìn)行了冠狀動(dòng)脈造影，其中ApoC3血漿水平高的人具有明顯更高的全身炎癥標(biāo)志物，例如E-選擇蛋白和高敏感性C反應(yīng)蛋白(hsCRP)(圖7c，d)。為了研究中位9.9年隨訪期間ApoC3與全因死亡率之間的關(guān)聯(lián)，建立了危險(xiǎn)比圖(圖7e)。值得注意的是，ApoC3血漿水平與更高的全因死亡率顯著相關(guān)。這突顯了ApoC3作為炎癥小體驅(qū)動(dòng)的炎癥介質(zhì)的臨床意義。
圖7:Apo3與死亡率增加相關(guān)
結(jié)論：
ApoC3是一種新型的介體，通過TLR2，TLR4和SCIMP的異源三聚化以及隨后的器官損傷，導(dǎo)致人類單核細(xì)胞中的炎性體替代激活。 這些發(fā)現(xiàn)不僅與ApoC3有關(guān)，而且擴(kuò)展了對(duì)替代性炎癥小體激活所需的信號(hào)通路的認(rèn)識(shí)。 該研究為NLRP3炎性小體的調(diào)控以及富含ApoC3的甘油三酯脂蛋白的生理病理作用提供了新的見解。靶向ApoC3可以防止器官損傷并為血管和腎臟疾病提供了新的抗炎治療策略。