m6A甲基化與肝癌之間的奧秘

m6A甲基化與肝癌之間的奧秘

    m6A甲基化是一種眾所周知的具有表觀遺傳新功能的修飾，有報道稱其參與了肝癌（HCC）的發(fā)生，為該疾病的分子發(fā)病機制提供了新的見解。然而，作為m6A甲基化的關鍵成分，WTAP在HCC中尚未得到很好的研究。在此，我們研究了WTAP在肝癌中的生物學作用及其機制.

本文利用組織芯片和TCGA數據集檢測WTAP的表達及其與臨床病理特征的關系。通過細胞增殖實驗、菌落形成實驗、Edu化驗和皮下異種移植實驗，闡明了WTAP對肝癌細胞的作用。另外，利用RNA測序結合GEO數據篩選WTAP候選靶點。最后，我們通過m6A點印記法、甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）、雙熒光素酶報告基因檢測、RNA免疫沉淀（RIP）和染色質免疫沉淀（ChIP）等方法研究了WTAP在HCC中的調控機制。

結果：

1.    WTAP過表達與肝癌預后不良有關

為了闡明WTAP的作用，我們首先從GEO數據集和TCGA數據中分析了WTAP在人HCC樣本中的mRNA表達。結果顯示WTAP在腫瘤組織中的表達顯著增高（圖1a）。WTAP蛋白水平在HCC組織中也明顯上調（圖1b），經TMA隊列IHC染色進一步證實（圖1c，d）。此外，探討了90例HCC患者WTAP表達與臨床病理特征的關系。Kaplan-Meier分析顯示，WTAP表達水平越高的患者總體生存率（OS）和無病生存率（DFS）越低（圖1e）。而且WTAP的過表達被發(fā)現是HCC患者的OS 和DFS 的獨立預后因素（圖1f）。綜上所述，我們的結論是WTAP在HCC中上調，并與其不良預后密切相關。

2.  WTAP在體內外均能促進腫瘤的增殖和致瘤能力

CCK-8和集落形成試驗表明，WTAP缺乏抑制了三種細胞系（Huh7，Hep3B，PLC/PRF/5）的增殖能力（圖2 a-c）。此外，EdU分析暗示敲低WTAP會減緩細胞生長（圖2 d）。

為了證實WTAP在體內的作用，我們通過皮下注射HCC細胞，在裸鼠體內穩(wěn)定敲低（shWTAP #1， #3）或過表達WTAP （WTAP- oe），構建了腫瘤異種移植模型。我們發(fā)現WTAP損耗抑制腫瘤發(fā)生（圖2 e），顯著降低腫瘤體積和重量（圖2 f，g）。與此同時，WTAP的強迫表達導致異種移植小鼠的表型逆轉（圖2h-j）。綜上所述，我們認為WTAP在HCC中具有腫瘤促進作用。

3.ETS1被認為是HCC中WTAP的潛在靶點

為了了解WTAP在HCC中發(fā)揮腫瘤促進作用的潛在機制，我們采用轉錄組測序來闡明WTAP敲除細胞的轉錄改變。WTAP缺失后，層次聚類顯示上調基因1636個，下調基因794個（圖3a）。為了縮小下游靶點的范圍，我們整合Liu等人發(fā)表的GEO數據（GSE46705）。通過MeRIP -seq和CLIP-seq對WTAP調控的轉錄本進行精化，建立基因集重疊。維恩圖共揭示了15個基因（圖3b）。然后我們進行RT-qPCR來評估WTAP對每個候選基因的影響。其中，在WTAP沉默后，ETS1和ETS2持續(xù)顯著上調，當WTAP過表達時，ETS1和ETS2均適度下調（圖3c-e）。然而，western blot分析顯示，WTAP失活明顯導致ETS1蛋白水平升高，而不是ETS2蛋白水平升高（圖3f，g）。接著我們進一步證明，在Hep3B和HCCLM3細胞中，WTAP對ETS1的含量有相反的影響（圖3h，i）。因此，我們推測ETS1功能障礙可能是WTAP介導的HCC增殖特征的原因。

4. WTAP增加了ETS1 mRNA的m6A修飾，并以m6A-HuR介導的方式抑制ETS1的表達

為了確定ETS1的m6A修飾是否通過WTAP介導，我們首先通過兩種不同的方法（m6A斑點印跡法和RNA甲基化定量法）檢測陰性對照組和穩(wěn)定的WTAP敲低組的m6A的整體水平。結果表明，隨著WTAP的缺失，兩株HCC細胞系m6A水平顯著降低（圖4a，b）。通過MeRIP-qPCR檢測m6A在ETS1中的富集情況。發(fā)現與IgG對照相比，m6A特異性抗體較強地富集了ETS1轉錄本。此外，我們發(fā)現在WTAP沉默后，m6A修飾的ETS1顯著減少（圖4c）。因此，我們認為WTAP能夠影響m6A的總體水平，尤其是ETS1。

為了證實m6A修飾ETS1的要求，我們用野生型（WT）和兩個突變體（Mut）質粒進行了熒光素酶報告基因測定。對于Mut報告基因，預測m6A位點的幾個腺苷堿基（A）被胞嘧啶堿基（C）取代，以消除m6A甲基化的影響，而WT報告基因包含完整的m6A位點（圖4d）。正如所料，WT組的熒光素酶活性在WTAP敲低作用下適度增強，而Mut組的熒光素酶活性對WTAP沉默的影響具有一定的抵抗作用（圖4e），說明ETS1的調控受WTAP誘導的m6A修飾的控制。總之，這些數據表明WTAP足以調控ETS1 mRNA的m6A修飾。

RNA結合蛋白HuR易于與較少的m6A修飾的RNA結合，并穩(wěn)定其結合的對應物，因此我們認為HuR可能調控ETS1。結果表明，HuR的減少顯著減輕了ETS1的表達（圖4f）。我們發(fā)現，與IgG對照組相比，HuR特異性抗體顯著富集ETS1 mRNA，而WTAP的抑制顯著增強了ETS1 mRNA的富集（圖4g）。此外，WTAP敲低引起的ETS1升高可以通過HuR的衰減來恢復（圖4h）。我們還發(fā)現，敲除WTAP可以延長ETS1 RNA的半衰期，而HuR沉默可以逆轉這種效果（圖4i）。最后，我們還進行了熒光素酶報告基因測定，以確定HuR參與m6A的修飾。在WT組中，HuR可以挽救WTAP沉默引起的熒光素酶活性的增強。然而，當ETS1的m6A位點可能發(fā)生突變時，HuR表達的改變似乎對熒光素酶活性沒有影響（圖4j）?？傊?，我們的發(fā)現表明WTAP通過m6A- HuR依賴的通路抑制ETS1。

5. ETS1作為一種腫瘤抑制因子，逆轉了WTAP在HCC中的作用

與癌旁組織相比，腫瘤組織中ETS1的表達較低（圖5a，b）。通過對cohort1的免疫組化染色，我們發(fā)現鄰近組織的陽性率明顯較高（圖5c，d）。根據TCGA數據，ETS1水平越高，預后越好（圖5e）。體外功能驗證表明，ETS1的敲除增強了MHCC97H、HCCLM3和Huh7細胞的增殖能力（圖5f，g）。此外，ETS1沉默足以挽救WTAP敲低對HCC細胞生長和存活的抑制作用（圖5h，i），因此ETS1的失活可能通過WTAP-ETS1軸導致HCC的進展。

6. WTAP的沉默通過ETS1-p21/p27軸在HCC中引起G2/M阻滯

據報道WTAP參與細胞周期調控，因此我們擬探討其在HCC中的相關機制。結果表明，WTAP敲低導致了G2/M的大量阻滯（圖6a，b）。為了闡明潛在的機制，我們研究了與細胞周期相關的幾個元素。有趣的是，當WTAP在轉錄水平失活時，在細胞周期和增殖中發(fā)揮重要作用的腫瘤抑制因子p21和p27的表達顯著增加（圖6c、d）。同時，western blot分析發(fā)現WTAP敲低上調了p21和p27，同時下調了CDC25C、CDK1、cyclin-A2和cyclin-B1。相反，WTAP的過表達減輕了p21和p27的表達，降低了G2期所有指示的檢查點蛋白的放大（圖6e）。

為了進一步研究ETS1是否參與WTAP誘導的細胞周期效應，我們進行了一系列的挽救性實驗。結果表明抑制ETS1可顯著逆轉WTAP沉默引起的G2/M阻滯（圖6f）。此外，ETS1的下調導致p21和p27的減少（圖6h）。而且我們推測ETS1可能增強p21和p27的轉錄，因為ChIP實驗表明ETS1可以與啟動子結合（圖6i）。此外，ETS1的抑制恢復了WTAP抑制引起的p21和p27表達升高（圖6j，k），這些數據表明ETS1-p21/p27軸在HCC中對WTAP依賴的細胞周期調控至關重要。

7.結合高WTAP和低ETS1表達預測肝癌的不良預后

為了評估WTAP和ETS1的臨床相關性，我們對來自cohort1的相同HCC標本進行了WTAP和ETS1染色的IHC檢測。近65.2%的高WTAP表達的樣本ETS1染色較弱，而大約55.6%的低WTAP表達的樣本表現出更強的ETS1染色（圖6a，b）?；谶@兩種因素結合的Kaplan-Meier分析進一步證明，WTAPhighETS1low表達的HCC患者的總體生存率比其他任何組都要低（圖7c）。綜上所述，WTAP與ETS1在臨床樣本中呈負相關關系，WTAP與ETS1的共表達模式可能是判斷HCC預后的一個有效因素。

總結：

總之，我們的研究闡明了WTAP和活化的WTAP介導的m6A機制在HCC中的致癌作用。WTAP上調參與了ETS1的m6A修飾，隨后通過HuR關聯的方式使ETS1表觀遺傳沉默。我們的發(fā)現豐富了腫瘤特征中m6A甲基化的功能價值，為探索肝癌治療中有效的治療策略開辟了潛在的途徑。