環(huán)狀RNA circPPP1R12A編碼的蛋白通過Hippo-YAP信號通路促進結腸癌的發(fā)病和轉移

欄目：最新研究動態(tài) 發(fā)布時間：2020-01-07
circRNA通常通過作為miRNA海綿調節(jié)基因表達，但circRNA編碼的肽段在腫瘤作用仍不明確......

   環(huán)狀RNA（circRNA）在腫瘤進展過程中起著重要的調節(jié)作用。circRNA通常通過作為miRNA海綿調節(jié)基因表達，但circRNA編碼的肽段在腫瘤作用仍不明確。近期，來自蘇州大學的研究團隊在Molecular Cancer期刊上發(fā)表題名為A novel protein encoded by a circular RNA circPPP1R12A promotes tumor pathogenesis and metastasis of colon cancer via Hippo-YAP signaling的文章。該文章揭示了結腸癌（CC）進程中circRNA circPPP1R12A的編碼肽段的作用，circPPP1R12A-73aa通過激活Hippo-YAP信號通路促進了CC的腫瘤發(fā)病和轉移。

1、CC組織和細胞中circRNA的表達譜和篩選
   使用circRNA基因芯片確定10例結腸癌患者癌和癌旁組織circRNA表達譜。在CC與癌旁組織間共有126個差異表達的circRNA；與癌旁組織相比，在CC組織中有110個circRNA上調，有16個circRNA下調。這些circRNAs大多位于外顯子區(qū)域。hsa_circ_0000423（circPPP1R12A）在CC組織中上調最為明顯，由位于12q21.2 PPP1R12A基因24、25外顯子反向拼接而成。接下來通過qRT-PCR檢測20例CC患者癌和癌旁組織中circPPP1R12A表達，確定其表達升高。與正常人結腸粘膜上皮細胞系NCM460細胞相比，circPPP1R12A表達在CC細胞系（HT-29，HCT-116，SW480，SW620，LoVo，SW48，DLD-1，Caco2和HCT-15）中明顯上調。


2、CC細胞和組織中circPPP1R12A的存在和亞細胞分布的特征
   實驗根據(jù)circPPP1R12A特征設計了兩組引物。一組（divergent primers，發(fā)散引物）用于擴增環(huán)狀轉錄物，而另一組（convergent primers，收斂引物）用于檢測線性轉錄物。結果表明，收斂引物可以用于cDNA和gDNA擴增，而發(fā)散引物只能用于cDNA擴增。為了進一步證實circPPP1R12A的存在，使用RNase R降解試驗評估circPPP1R12A對RNase R處理的抗性。結果顯示，通過RNase R處理降解了PPP1R12A的線性轉錄物，而這種處理未能降解circPPP1R12A的環(huán)狀轉錄物。核質量分離測定法和FISH分析結果顯示93％以上的circPPP1R12A出現(xiàn)在HCT-116和LoVo細胞的細胞質中。還通過原位雜交技術檢測100例CC患者癌和癌旁組織中circPPP1R12A的表達。結果表明circPPP1R12A在CC組織中的表達高于正常組織，并且這種表達上調與更高的TNM分期呈正相關。并且生存曲線表明，circPPP1R12A表達較高的患者的總生存期較短。



3、circPPP1R12A促進細胞增殖
   在兩個低circPPP1R12A表達的CC細胞系（DLD-1和Caco-2）中通過質粒過表達了circPPP1R12A，并通過PCR驗證過表達效率。CCK8和集落形成的結果表明，circPPP1R12A過表達加速了DLD-1和Caco-2細胞的細胞增殖。劃痕實驗和Transwell結果表明，過表達circPPP1R12A也增強DLD-1和Caco-2細胞的遷移和侵襲能力。此外，在兩個高表達circPPP1R12A的CC細胞系（HCT-116和LoVo）中通過質粒過表達了circPPP1R12A。通過CCK8和集落形成結果證明，circPPP1R12A過表達加速了HCT-116和LoVo細胞的細胞增殖。但是，circPPP1R12A過表達未能在劃痕實驗和Transwell中顯示對CC細胞遷移和侵襲能力的影響。


4、敲低circPPP1R12A可抑制CC細胞的增殖，遷移和侵襲能力
   接下來，研究敲低circPPP1R12A對細胞增殖，遷移和侵襲性的影響。通過PCR證驗證敲低效率，circPPP1R12A的敲低影響了兩個高表達細胞系的增殖（圖和集落形成的能力。在劃痕和Transwell測定中，circPPP1R12A的敲低顯著影響HCT-116和LoVo細胞的遷移和侵襲能力。這些結果表明，circPPP1R12A在CC細胞的增殖，遷移和侵襲中發(fā)揮了關鍵作用。


5、CircRNA circPPP1R12A編碼一個小的未鑒定蛋白
   circRNA circPPP1R12A最初是在circRNA Db數(shù)據(jù)庫中標注的，因此發(fā)現(xiàn)circPPP1R12A具有一個短的216 nt的小ORF，具有編碼73個氨基酸肽段的潛力。在人類circPPP1R12A中，環(huán)化產生了起始密碼子AUG，該起始密碼子與遺傳密碼一起開始翻譯。circPPP1R12A的ORF應該被翻譯成73個氨基酸的蛋白，稱之為circPPP1R12A-73aa。設計標記的過表達載體（Lv-flag-circPPP1R12A），突變一個位點的載體（Lv-flag-circPPP1R12A-Mut）和過表達circPPP1R12A-73aa mRNA的載體。PCR驗證DLD-1和Caco-2細胞過表達效率，WB檢測DLD-1和Caco-2細胞circPPP1R12A-73aa蛋白表達情況。通過LC-MS / MS從證實circPPP1R12A翻譯了circPPP1R12A-73aa，并確定了circPPP1R12A-73aa的獨特的氨基酸序列。在LC-MS / MS結果中，從10 kDa條帶中鑒定出超過76％的circPPP1R12A-73aa序列。另外，鑒定了由circPPP1R12A翻譯獨特的氨基酸序列為“ GRLRHVNCLSPGVQD”。


6、CircPPP1R12A-73aa在體外和體內促進CC的增殖和轉移能力
   為了進一步探索circPPP1R12A-73aa的生物學功能，在低表達CC細胞系DLD-1和Caco-2中穩(wěn)轉上述過表達載體。CCK8、集落形成實驗和細胞周期結果證實過表達circPPP1R12A和circPPP1R12A-73aa增加的細胞增殖能力。然而突變的circPPP1R12A的過表達組中，不能翻譯circPPP1R12A-73aa，不能增加DLD-1和Caco-2細胞的增殖能力。劃痕實驗和Transwell結果中，過表達circPPP1R12A和circPPP1R12A-73aa增強了遷移和侵襲的能力，突變體circPPP1R12A的過表達未能提高這些能力。這些數(shù)據(jù)表明，如果沒有circPPP1R12A編碼蛋白circPPP1R12A-73aa參與，circPPP1R12A并不能直接調控CC細胞的增殖。接下來，利用異種移植腫瘤模型進一步研究了circPPP1R12A-73aa在體內CC細胞生長中的作用。過表達circPPP1R12A和circPPP1R12A-73aa組中腫瘤體積和重量明顯大于載體對照組和突變組。并且在小鼠生物發(fā)光成像結果中，突變組的腫瘤肝轉移顯著減少。這些數(shù)據(jù)表明， 是circPPP1R12A編碼的circPPP1R12A-73aa促進了CC細胞的增殖和轉移，而不是circPPP1R12A。


7、circPPP1R12A-73aa通過激活hippo-YAP信號通路促進CC的增殖，遷移和侵襲能力
   對四組穩(wěn)轉DLD-1細胞進行RNA測序分析，篩選出差異表RNA，以確定可能的信號通路。通過KEGG通路分析，篩選出差異信號通路。Hippo-YAP作為最豐富的信號通路接受下一步WB驗證。YAP1是Hippo信號通路中的轉錄共激活子，而YAP1誘導的轉錄反應在癌細胞的增殖和轉移中至關重要。為了驗證YAP1激活是否為癌細胞的circPPP1R12A-73aa誘導的生長和轉移的關鍵，在過表達circPPP1R12A-73aa的DLD-1和Caco-2 DLD-1和Caco-2和Caco-2細胞系中加入YAP1抑制劑肽17，實驗結果肽17顯著抑制了因circPPP1R12A-73aa過表達引起的CC細胞的增殖、遷移和侵襲的能力增強。

結論：
   CC組織和細胞的細胞質中發(fā)現(xiàn)了circRNA circPPP1R12A高表達。circPPP1R12A編碼的circPPP1R12A-73aa促進了CC細胞在體內與體外增殖和轉移，而不是circPPP1R12A。circPPP1R12A-73aa通過激活Hippo-YAP信號通路提高了CC細胞的增殖，遷移和侵襲能力。