肥胖病研究新火花：m6A甲基化可調(diào)控自噬和脂肪形成

   肥胖，一類由脂肪細(xì)胞的體積和數(shù)量增加所引起的脂肪組織的異?；蜻^度積累的疾病，已然成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，提高對于脂肪生成分子機(jī)制的理解具有重要的科學(xué)意義。研究人員已提出許多調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的機(jī)制，包括細(xì)胞外信號，轉(zhuǎn)錄級聯(lián)和表觀基因修飾等。近日，這篇文章提出了肥胖研究的新奇思路，甲基化和自噬之間能碰撞出什么火花呢，我們來一睹為快吧。

文章思路：

1.FTO促進(jìn)自噬并進(jìn)一步增強(qiáng)脂肪形成
   探討FTO在自噬中的作用：3T3-L1細(xì)胞中FTO敲低顯著降低LC3-II：I比值和增加SQSTM1水平，表明沒有穩(wěn)態(tài)自噬體形成。相反，過度表達(dá)HA標(biāo)記的FTO顯著提高LC3-II：I比值和減弱SQSTM1表達(dá)，表明FTO與自噬之間存在正相關(guān)關(guān)系。FTO的沉默減少自噬體的數(shù)量， 減輕自噬的激活。為確定自噬是否受FTO過表達(dá)影響， 3-MA或巴弗洛霉素A1處理實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)FTO促進(jìn)自噬的激活。
   檢測FTO是否通過自噬影響脂肪形成： 3-MA和Baf A1處理可以逆轉(zhuǎn)FTO過表達(dá)細(xì)胞中增強(qiáng)的自噬、脂肪生成和甘油三酯的積累。脂肪細(xì)胞標(biāo)記基因，包括Pparg、Fabp4和Cebpa在FTO過表達(dá)細(xì)胞中顯著升高，3-MA或Baf A1處理可以下調(diào)到正常水平。這些結(jié)果表明FTO通過促進(jìn)自噬增強(qiáng)脂肪細(xì)胞分化。

2. 敲低FTO可降低ATG5和ATG5的表達(dá)，但沒有降低ULK1的表達(dá)
   鑒定FTO在自噬中的潛在靶基因：檢測FTO敲低后自噬相關(guān)基因的表達(dá)，Atg5和Atg7水平均減弱，而ULK1等自噬相關(guān)蛋白，如ATG12和ATG16L1，沒有顯著改變。檢查脂肪細(xì)胞分化過程中ATG5和ATG7的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)它們都在早期有所增加，之后都減少，這與FTO的表達(dá)模式相似。這些表明FTO的靶基因可能是Atg5和Atg7，而不是Ulk1。
   檢測ATG5和ATG7對自噬和脂肪生成的影響：3T3-L1脂肪前體細(xì)胞敲低Atg5和Atg7， LC3II:I比值降低， FTO蛋白表達(dá)沒變化。FTO，ATG5和ATG7獨(dú)自敲低都會抑制脂肪生成和甘油三酯積累，脂肪細(xì)胞標(biāo)記基因水平下調(diào)。

3.FTO靶向 ATG5和ATG7并影響自噬和脂肪形成
   FTO過表達(dá)增加Atg5和Atg7的mRNA水平，沉默ATG5可逆轉(zhuǎn)FTO過表達(dá)3T3-L1細(xì)胞中上調(diào)的LC3-II：I比例， ATG7效果一樣，表明FTO通過調(diào)節(jié)ATG5和ATG7的表達(dá)影響自噬。前人研究發(fā)現(xiàn)ATG5和ATG7敲低抑制自噬并減少CEBPB水平，抑制PPARG和CEBPA表達(dá)損害脂肪形成分化，提示FTO通過Atg5和Atg7-Cebpb信號調(diào)節(jié)脂肪生成。FTO強(qiáng)表達(dá)促進(jìn)CEBPB蛋白水平，而ATG5和ATG7的敲低逆轉(zhuǎn)CEBPB的表達(dá)（圖3D）。ATG5和ATG7的敲低恢復(fù)了FTO過表達(dá)3T3-L1細(xì)胞的脂肪生成 和甘油三酯積累， FTO過表達(dá)細(xì)胞中Pparg，F(xiàn)abp4和Cebpa的mRNA和蛋白水平也被逆轉(zhuǎn)。FTO通過調(diào)節(jié)Atg5和Atg7-Cebpb信號軸促進(jìn)脂肪生成。

4.FTO以 m6A依賴方式調(diào)節(jié)ATG5和ATG7的表達(dá)
   構(gòu)建野生型（FTO-WT）和突變的FTOR96Q（FTO-MUT）質(zhì)粒，來確定FTO的去甲基酶活性是否必須。LC-MS / MS確認(rèn)FTO-WT或FTO-MUT的異位表達(dá)對細(xì)胞m6A水平的影響。異位表達(dá)FTO-WT，但不是FTO-MUT，顯著增加LC3-II：I表達(dá)，LC3斑點(diǎn)顯著增強(qiáng),自噬體的數(shù)量提高。這些結(jié)果證明FTO去甲基化的活性是前脂肪細(xì)胞中自噬所必需的。
   調(diào)查FTO通過RNA去甲基化影響ATG5和ATG7表達(dá)，異位表達(dá)FTO-WT增加ATG5和ATG7的蛋白質(zhì)和mRNA水平，而ULK1蛋白豐度沒有變化。在Atg5和Atg7的3'UTR處發(fā)現(xiàn)m6A修飾。發(fā)現(xiàn)FTO的敲除增加3T3-L1細(xì)胞的m6A水平?；蛱禺愋约谆疪NA免疫沉淀-qPCR（MeRIP-qPCR）表明FTO敲低顯著增加Atg5和Atg7 mRNA轉(zhuǎn)錄物的m6A水平，但不對Ulk1有影響。評估靶mRNA進(jìn)行m6A修飾對于FTO介導(dǎo)的基因調(diào)控是否必要，3T3-L1細(xì)胞中進(jìn)行雙熒光素酶報告和誘變實(shí)驗(yàn)。強(qiáng)表達(dá)FTO-WT，但不是FTO-MUT，大大促進(jìn)含有Atg5和Atg7的3'UTR片段的單個報告結(jié)構(gòu)的熒光素酶活性，當(dāng)m6A位置發(fā)生突變時，這種增加被消除，證明FTO通過m6A依賴機(jī)制調(diào)節(jié)ATG5和ATG7的表達(dá)。油紅O染色分析顯示FTO-WT促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和甘油三酯積累，驗(yàn)證去甲基化脂肪形成需要FTO的活性。這些結(jié)果說明FTO靶向Atg5和Atg7轉(zhuǎn)錄物并以m6A依賴的方式介導(dǎo)他們的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)自噬和脂肪生成。

5.YTHDF2通過m6A依賴機(jī)制介導(dǎo)ATG5和ATG7的mRNA穩(wěn)定性和表達(dá)
   m6A甲基化影響mRNA穩(wěn)定性和翻譯，YTHDF2選擇性識別m6A修飾的mRNA并使其不穩(wěn)定，促進(jìn)目標(biāo)mRNA的翻譯。進(jìn)一步解釋FTO靶基因的m6A甲基化和蛋白質(zhì)豐度之間的負(fù)相關(guān)，首先研究ATG5和ATG7表達(dá)是否受YTHDF2或YTHDF1的影響，YTHDF2過表達(dá)顯著降低ATG5和ATG7蛋白水平，而ULK1和ATG12無變化，強(qiáng)表達(dá)YTHDF1不影響ATG5和ATG7的表達(dá)。
   檢測在Atg5和Atg7 mRNAs的m6A修飾對YTHDF2介導(dǎo)的基因調(diào)控是是否必需的。YTHDF2異位顯著下調(diào)野生型Atg5和Atg7片段的熒光素酶活性，這種減少完全被m6A共識位點(diǎn)的突變消除。檢測YTHDF2是否介導(dǎo)mRNA衰變從而控制Atg5和Atg7的表達(dá)，在3T3-L1細(xì)胞中進(jìn)行功能缺失研究。敲低YTHDF2后 Atg5和Atg7的mRNA水平提高， mRNA穩(wěn)定性分析顯示YTHDF2缺失延長了Atg5和Atg7 mRNA轉(zhuǎn)錄物的半衰期。過表達(dá)FTO的3T3-L1細(xì)胞中ATG5和ATG7蛋白質(zhì)水平的增加能部分被強(qiáng)表達(dá)YTHDF2逆轉(zhuǎn)，LC3-II：I也部分逆轉(zhuǎn)。異位表達(dá)YTHDF2可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)FTO引起的促脂肪生成和甘油三酯積累。這些數(shù)據(jù)表明FTO調(diào)節(jié)ATG5和ATG7的表達(dá)，通過m6A依賴性和YTHDF2介導(dǎo)的方式。

6.脂肪選擇性缺失FTO可減少白色脂肪量并抑制ATG5和ATG7依賴性自噬
   研究FTO的體內(nèi)作用，建立脂肪選擇性FTO敲除小鼠（fto-AKO）模型，fto-AKO小鼠的脂肪組織（WAT）FTO表達(dá)缺失，其他組織包括肌肉，肝臟，大腦，巨噬細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞并沒有。相對于對照鼠，食物或高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)fto-AKO小鼠的體重增加變?nèi)?，且更瘦，而兩組之間食物攝入沒有顯著差異。fto-AKO小鼠腹股溝脂肪和性腺脂肪的數(shù)量顯著低于同窩對照鼠。SAT和VAT的haematine和伊紅染色顯示HFD對照小鼠的脂肪細(xì)胞表現(xiàn)為一個大脂滴占據(jù)整個細(xì)胞的典型結(jié)構(gòu)。相反，F(xiàn)TO缺乏導(dǎo)致多腔較小脂滴的脂肪細(xì)胞。喂食HFD的fto-AKO小鼠的血糖水平和血清甘油三酯水平的顯著低于對照鼠。脂肪選擇性缺失Fto減弱LC3-II：I比例和SQSTM1蛋白豐度升高，ATG5和ATG7的基因表達(dá)減弱，表明在WAT中自噬抑制。此外， fto-AKO小鼠WAT中Cebpb的mRNA水平下調(diào)，暗示fto敲除可能損害脂肪組織發(fā)育，通過抑制ATG5和ATG7-CEBPB信號。這些表明脂肪細(xì)胞選擇性fto敲除可能會減少WAT量和損害ATG5和ATG7依賴性自噬。

總結(jié)：
   FTO在促進(jìn)自噬和脂肪生成中起作用，主要通過m6A-YTHDF2依賴機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)在預(yù)防和治療肥胖的研究進(jìn)程中迸發(fā)出新的火花新的思路。