肺癌治療的手段-AIF

凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）不僅參與細(xì)胞凋亡，還在線粒體內(nèi)發(fā)揮重要的功能，它通過(guò)線粒體呼吸鏈中復(fù)合物I的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，決定氧化磷酸化(OXPHOS)的速率。近些年，AIF被廣泛研究。今天小編就帶大家了解關(guān)于AIF調(diào)控氧化磷酸化支持肺癌的發(fā)展的文章AIF-regulated oxidative phosphorylation supports lung cancer development。

在本研究中，作者使用Kras^G12D驅(qū)動(dòng)的小鼠肺癌模型，通過(guò)AIF敲減、線粒體呼吸評(píng)估、糖酵解、WT或線粒體錨定的AIF重新表達(dá)和和肺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析證明了AIF調(diào)控線粒體呼吸和OXPHOS，從而促進(jìn)肺癌的進(jìn)展。
結(jié)果:
1）減少AIF缺乏Kras^G12D小鼠的肺癌
為了確定AIF在肺癌中的作用，我們將AIF ^fl/fl 小鼠與Lox-Stop-Lox-Kras^G12D菌株雜交。Lox-Stop-Lox-Kras^G12D小鼠在Cre缺失并誘導(dǎo)突變的Kras^G12D等位基因后，逐步發(fā)展為非小細(xì)胞肺癌（NSCLCs），從上皮細(xì)胞增生到良性腺瘤和惡性腺癌。與對(duì)照組相比，Kras^G12D驅(qū)動(dòng)的肺癌模型中AIF的缺失顯著延長(zhǎng)了存活時(shí)間（圖1a）。在所有時(shí)間點(diǎn)分析中，與對(duì)照相比，Aif^{fl / y} Kras^G12D小鼠肺中腫瘤區(qū)域的數(shù)量減少(圖1 b， c)。這些結(jié)果表明，AIF基因失活可顯著降低krasg12d驅(qū)動(dòng)的肺癌發(fā)生。接下來(lái)我們?cè)u(píng)估了腫瘤的發(fā)生和肺癌的惡性進(jìn)展。Ad5-CMV-Cre吸入4周后，微CT顯示Aif^fl/y Kras^G12D小鼠腫瘤病灶明顯減少，且在整個(gè)觀察期間均觀察到腫瘤病灶減少（圖1d）。

2）AIF的缺失會(huì)損害OXPHOS并破壞線粒體結(jié)構(gòu)
由于AIF影響腫瘤的發(fā)生和早期發(fā)展，我們從Aif^fl/y Kras^G12D和AIF^+/y Kras^G12D胎鼠中分離出原代肺細(xì)胞，隨后用Ad5-CMV-Cre-eGFP感染培養(yǎng)細(xì)胞，激活Kras^G12D表達(dá)，同時(shí)刪除AIF（圖2a）。正如之前研究中所預(yù)期的那樣，AIF的缺失也導(dǎo)致線粒體復(fù)合物I蛋白的減少（圖2a）。然后分析AIF突變?cè)渭?xì)胞的耗氧量（OCR），以評(píng)估線粒體呼吸。Aif^fl/y Kras^G12D細(xì)胞在較低的基礎(chǔ)水平上消耗氧氣，產(chǎn)生更少的ATP，并且在對(duì)FCCP的響應(yīng)中表現(xiàn)出有限的OCR增加，導(dǎo)致最大呼吸容量降低（圖2 b，c）。
在體內(nèi)Ad5-CMV-Cre感染6周后，我們從Aif^fl/y Kras^G12D和Aif^+/y Kras^G12D胎鼠中分離出原代轉(zhuǎn)化的肺細(xì)胞。值得注意的是，小鼠感染的病毒滴度是正常濃度的5倍，以確保大多數(shù)肺細(xì)胞被感染（圖2d）。與我們的短期培養(yǎng)相似，體內(nèi)Ad5- CMV-Cre處理導(dǎo)致基礎(chǔ)呼吸、ATP生成、最大呼吸和備用呼吸能力減少（圖2e）。我們還對(duì)Ad5-CMV-Cre吸入16周后Aif^fl/y Kras^G12D和Aif^+/y Kras^G12D小鼠新分離腫瘤組織中的線粒體進(jìn)行了表征。具有AIF活性的腫瘤細(xì)胞與缺乏AIF的腫瘤細(xì)胞線粒體數(shù)量無(wú)明顯差異；然而，Aif^fl/y Kras^G12D腫瘤細(xì)胞線粒體腫脹，嵴結(jié)構(gòu)明顯減少，排列紊亂（圖2f）。因此，AIF的缺失不僅會(huì)導(dǎo)致OXPHOS的普遍受損，還會(huì)導(dǎo)致線粒體形態(tài)異常。

3）AIF缺乏增強(qiáng)糖酵解和對(duì)葡萄糖缺乏的敏感性
在添加葡萄糖刺激糖酵解后，Aif^fl/y Kras^G12D肺細(xì)胞的基礎(chǔ)細(xì)胞外酸化率高于Aif^+/y Kras^G12D對(duì)照細(xì)胞（圖3a）。添加寡霉素后，通過(guò)OXPHOS抑制ATP產(chǎn)生，Aif^fl/y Kras^G12D細(xì)胞和Aif^+/y Kras^G12D細(xì)胞的糖酵解活性均增加，但Aif^+/y Kras^G12D細(xì)胞的糖酵解活性明顯增加（圖3 b）。在體外Ad5-mSPC-Cre處理的Aif^fl/y Kras^G12D肺細(xì)胞中，糖酵解也增加了（圖3 c，d）。對(duì)照Aif^+/y Kras^G12D細(xì)胞不受2-DG 72 h孵育的影響，，而Aif^fl/y Kras^G12D細(xì)胞死亡率增加（圖3e）。同樣，葡萄糖缺乏對(duì)Aif^+/y Kras^G12D細(xì)胞無(wú)明顯影響，但影響Aif^fl/y Kras^G12D細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖3f）。最后，我們觀察到在葡萄糖缺乏條件下培養(yǎng)的Aiffl/yKrasG12D肺細(xì)胞內(nèi)ATP水平顯著下降（圖3g）。這些結(jié)果表明AIF的缺失導(dǎo)致OXPHOS缺乏癥和細(xì)胞代謝向糖酵解的轉(zhuǎn)變。Aif^fl/y Kras^G12D肺細(xì)胞中，OXPHOS對(duì)ATP合成的貢獻(xiàn)較小，主要由糖酵解提供，而Aif^+/y Kras^G12D細(xì)胞中的ATP大部分由OXPHOS生成。

4）穩(wěn)定的AIF缺失會(huì)損害KRAS WT和KRAS突變的肺癌細(xì)胞的克隆潛能和增殖
在KRAS突變的NSCLC A549細(xì)胞中，AIF的穩(wěn)定下調(diào)抑制了CHCHD4的表達(dá)，并導(dǎo)致呼吸鏈蛋白如CIII-UQCRC2、cii - coxii和CI-NDUFB8的減少以及OXPHOS、ATP生成、克隆潛能和增殖的減少。另外，AIF敲除顯著降低了H1437、H727、A427、H1650、H358以及A549細(xì)胞的克隆能力（圖5）。

5）重新表達(dá)WT或線粒體錨定的AIF可恢復(fù)肺癌敏感性
Aif^fl/y Kras^G12D小鼠在吸入Ad5-CMV-Cre后存活的時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組小鼠。在敲除AIF的小鼠中重新表達(dá)WT AIF后，存活率顯著降低。而且線粒體錨定突變體AIF替代內(nèi)源性AIF也恢復(fù)了Aif^fl/y Kras^G12D小鼠的癌癥表型（圖6c）。另外WT或突變AIF的重新表達(dá)導(dǎo)致肺腫瘤負(fù)荷增加（圖6d，e）。接下來(lái)為了進(jìn)一步研究AIF和OXPHOS在腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤干細(xì)胞樣特性中的功能相關(guān)性，我們采用最近開(kāi)發(fā)的3D腫瘤球體培養(yǎng)法，從Ad5-mSPC-Cre感染6周后的Aif^+/y Kras^G12D、Aif^fl/y Kras^G12D、Aif^fl/y WT ki Kras^G12D、Aif^fl/y MT ki Kras^G12D小鼠中分離純化的原發(fā)肺細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。在從每個(gè)基因型中植入相同數(shù)量的腫瘤細(xì)胞后，我們發(fā)現(xiàn)Aif^fl/y Kras^G12D小鼠與Aif^+/y Kras^G12D小鼠相比，來(lái)自Aif^fl/y Kras^G12D小鼠的腫瘤球體數(shù)量顯著減少。WT和突變型AIF的重新表達(dá)幾乎完全恢復(fù)了莖樣性質(zhì)，形成腫瘤球形，達(dá)到AIF ^+/y Kras^G12D對(duì)照水平（圖6f，g）。接下來(lái)，我們通過(guò)BrdU標(biāo)記來(lái)確定這些腫瘤球的增殖能力。再次，我們觀察到Aif^fl/y Kras^G12D腫瘤球體中陽(yáng)性細(xì)胞明顯少于AIF WT、AIF WT敲入和AIF突變敲入腫瘤球體（圖6h，i）。

6）WT或線粒體錨定AIF的修復(fù)可消除線粒體呼吸缺陷
將WT或線粒體錨定的AIF重新引入Aif^fl/y Kras^G12D肺細(xì)胞中，可將其呼吸能力提高到與AIF ^+/y Kras^G12D對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃剑▓D7a， b）。另外，與生物能量譜一致，AIF缺陷細(xì)胞所含PEP和NADH明顯減少，但乳酸含量高得多（圖7c），這表明AIF耗盡后OXPHOS確實(shí)受到抑制。另外，三羧酸循環(huán)的中間代謝物，包括檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸，在AIF缺乏的細(xì)胞中大量增加（圖7c），這與KEGG富集分析一致（圖7d）。

7）AIF在人類(lèi)肺腫瘤中經(jīng)常過(guò)度表達(dá)，高AIF表達(dá)與低生存率有關(guān)
最后，我們通過(guò)分析已發(fā)表的數(shù)據(jù)集，探討AIF在人類(lèi)肺癌中的臨床意義。肺癌和不同肺癌亞型的轉(zhuǎn)錄組研究表明，與正常組織相比，肺癌組織中AIF mRNA水平顯著上調(diào)（圖8a）。為了在蛋白水平上驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，我們用免疫組織化學(xué)方法研究了AIF在人類(lèi)肺癌樣本中的表達(dá)。與之前的研究結(jié)果一致，我們觀察到Kras突變和Kras WT肺癌患者的腫瘤組織中AIF表達(dá)均高于正常肺組織（圖8b）。另外，我們發(fā)現(xiàn)，在三個(gè)不同的NSCLC群體中，不僅AIF，而且編碼復(fù)合物I亞基或其組裝因子的絕大多數(shù)基因在NSCLC組織中都比正常相鄰肺組織明顯過(guò)表達(dá)（圖8c）。因此，當(dāng)我們用Ad5-mSPC-Cre感染Aif^+/y和Aif^+/y Kras^G12D小鼠的肺細(xì)胞時(shí)，在激活Kras^G12D 8天后檢測(cè)到AIF表達(dá)顯著誘導(dǎo)；然而，在表達(dá)WT Kras的非轉(zhuǎn)化性肺細(xì)胞中沒(méi)有觀察到這種效應(yīng)（圖8d）。此外，我們通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)集中的RNAseq數(shù)據(jù)，評(píng)估了AIF表達(dá)與總生存率之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)無(wú)論KRAS突變情況如何，AIF高表達(dá)與預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)（圖8e）。同樣，免疫組化檢測(cè)顯示，NSCLCs表達(dá)低水平AIF蛋白的患者比AIF高腫瘤患者生存時(shí)間更長(zhǎng)（圖8f），這與AIF高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)的結(jié)論一致。