一種新的lncRNA，ZFPM2-AS1通過穩(wěn)定MIF來抑制p53途徑并促進胃癌發(fā)生

長鏈非編碼RNAs（lncRNs）與多種癌癥的發(fā)病機制有關(guān)。2018年7月 9號Oncogene雜志上發(fā)表了一篇題為“ZFPM2-AS1, a novel lncRNA, attenuates the p53 pathway and promotes gastric carcinogenesis by stabilizing MIF”的文章，論文報道了一種新的lncRNA，ZFPM2反義RNA1（ZFPM2-AS1）在胃癌發(fā)生中的關(guān)鍵作用。應(yīng)用基因表達綜合數(shù)據(jù)對胃癌組織中ZFPM2-AS1進行了分析，并用qRT-PCR在73對胃癌組織和正常胃組織標(biāo)本進行了驗證。通過改變ZFPM2-AS1在體外和體內(nèi)的表達，評價ZFPM2-AS1表達對胃癌細胞增殖和凋亡的影響。采用細胞和分子生物學(xué)方法進行機理研究。ZFPM2-AS1在胃腫瘤組織中的表達高于正常胃組織。胃癌組織中ZFPM2-AS1表達的增加與腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、分化程度、TNM分期有關(guān)。ZFPM2-AS1高表達可顯著降低胃癌患者的總生存期和無病生存期。功能實驗表明，ZFPM2-AS1表達促進胃癌細胞的增殖和抑制細胞凋亡，促進體內(nèi)腫瘤的生長，這種作用與p53的核轉(zhuǎn)位減弱有關(guān)。機械實驗表明，腫瘤激活的ZFPM2-AS1可以結(jié)合并保護一種有效的p53失穩(wěn)劑-巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）的降解。敲除MIF可降低ZFPM2-AS1對胃癌細胞p53表達的影響。

這些研究結(jié)果表明ZFPM2-AS1調(diào)節(jié)胃癌進展，并揭示了一種新的ZFPM2-AS1/MIV/p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸，闡明了某些惡性胃癌細胞致瘤性的分子機制。

技術(shù)路線

結(jié)果：

圖1. ZFPM2-AS1表達上調(diào)預(yù)示胃癌預(yù)后不良。

（a）ZFPM2-AS1的5'，3'和全長RACE。（b）ZFPM2-AS1位置示意圖。ZFPM2-AS1的部分序列在反義鏈中與ZFPM2蛋白編碼基因的內(nèi)含子重疊。（c）胃癌和鄰近非腫瘤胃組織標(biāo)本中ZFPM2-AS1的相對表達水平。結(jié)果表示為log2（2-△△Ct）。（d）使用qRT-PCR分析胃癌和鄰近非腫瘤胃組織標(biāo)本（n = 73）中的ZFPM2-AS1表達。將ZFPM2-AS1表達水平標(biāo)準(zhǔn)化為U6的表達水平。（e）ZFPM2-AS1在正常胃細胞（GES-1）和胃癌細胞系（AGS，BGC-823，MGC-803，MKN-28，MKN-45和SGC-7901）中的表達水平。（f）根據(jù)基于qRT-PCR的ZFPM2-AS1表達水平預(yù)測胃癌的受試者 - 操作特征曲線。（g，h）Kaplan-Meier分析胃癌患者的總生存期（OS）（g）和無病生存期（DFS）（h）。

圖2. ZFPM2-AS1在體外促進胃癌細胞增殖并抑制胃癌細胞的凋亡。

（a） 在體外用生長細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）評估胃癌細胞在體外生長。OD光密度。* P <0.05。（b）用ZFPM2-AS1特異性shRNA（sh＃1和sh＃2）或非靶向?qū)φ誷hRNA（shNC）轉(zhuǎn)染AGS和MKN-45細胞的克隆形成實驗。 （c）進行EdU摻入測定以確定ZFPM2-AS1抑制對胃癌細胞增殖期間DNA合成的影響。敲除ZFPM2-AS1降低了總胃癌細胞中EdU陽性（S期）細胞的比例。（d）流式細胞術(shù)檢測HSZFPM2-AS1處理48小時后對AGS和MKN-45細胞周期阻滯的影響。* P <0.05（e）用流式細胞術(shù)分析SZFPM2-AS1或SHNC治療后AGS和MKN-45細胞的凋亡率。* P <0.05

圖3. ZFPM2-AS1在體內(nèi)促進胃癌細胞的生長。

將ZFPM2-AS1表達質(zhì)?；騭hRNA處理后的AGS細胞經(jīng)皮下注射到裸鼠的左大腿（每只小鼠1×10 6個細胞，每組5只小鼠）。在所示小鼠組中顯示了腫瘤生長曲線（a1，a2; * P <0.05），腫瘤重量（b1，b2）和腫瘤（c1，c2）。（d）Ki67腫瘤組織免疫組化染色的代表性圖像

圖4. ZFPM2-AS1負調(diào)控p53蛋白的表達并抑制p53下游分子的表達。

（a）Western印跡分析表明，ZFPM2-AS1表達的上調(diào)或下調(diào)改變了胃癌細胞系中p53及其下游靶標(biāo)cyclin D1，cyclin E1，p21和PUMA的表達。（b）ZFPM2-AS1敲除改變了p53下游基因的mRNA表達，但沒有改變胃癌細胞系中p53 mRNA的表達水平。 * P <0.05。（c）AGS和MKN-45細胞的生長速率。 * P <0.05。 （d）shZFPM2-AS1轉(zhuǎn)染有或沒有siTp53存在的胃癌細胞的凋亡分析。 *與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）; 與shZFPM2-AS1組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）

圖5. ZFPM2-AS1與MIF結(jié)合并增加MIF表達。

（a）帶有銀染色的SDS-PAGE分析顯示來自AGS細胞的免疫沉淀蛋白被ZFPM2-AS1或其反義RNA拉下。箭頭表示隨后可能切除用于質(zhì)譜分析的ZFPM2-AS1結(jié)合蛋白。 （b）生物素化的ZFPM2-AS1或反義RNA與AGS和MKN-45細胞的全細胞蛋白裂解物在另一種RNA pull-down測定中一起孵育。使用特異性MIF抗體通過蛋白質(zhì)印跡檢測MIF蛋白。（c）RIP實驗確定了MIF和ZFPM2-AS1的相互作用。（d）用不同的ZFPM2-AS1片段拉下AGS細胞的免疫印跡。 （e）在胃癌標(biāo)本中具有高或低ZFPM2-AS1表達的MIF蛋白表達的代表性免疫組織化學(xué)圖像（n = 26）。（f）使用Spearman相關(guān)系數(shù)分析（n = 26）評估ZFPM2-AS1和MIF蛋白表達之間的直接相關(guān)性。分別檢測ZFPM2-AS1的表達和每種胃癌標(biāo)本中MIF蛋白的免疫組織化學(xué)評分。 W弱，M中等，S強。 （g）通過RT-qPCR分析ZFPM2-AS1在AGS和MKN-45細胞裂解物中的細胞內(nèi)分布。 GAPDH和U6用作內(nèi)部對照。 （h）在AGS和MKN-45細胞中ZFPM2-AS1表達降低或增加后，MIF表達的Western印跡。（i）qRT-PCR結(jié)果證明ZFPM2-AS1的過表達和敲除不影響胃癌細胞中的MIF mRNA表達水平。（j）用40μg/ mL CHX處理指定時間的AGS和MKN-45細胞中MIF的Western印跡。 （k）Western印跡顯示蛋白酶體抑制劑MG132在有或沒有shZFPM2-AS1處理48小時的條件下對胃癌細胞中MIF表達的影響

圖6. ZFPM2-AS1 / MIF軸通過減弱p53信號傳導(dǎo)促進胃癌細胞增殖并抑制其凋亡。

（a）使用抗-MLF抗體或用抗-p53抗體進行對照IgG對AGS和MKN-45細胞提取物的蛋白質(zhì)印跡進行共免疫沉淀（IP）。使用抗p53和-IgG抗體進行相互的共-IP，然后用抗MIF抗體進行蛋白質(zhì)印跡。（b）在MIF表達降低或增加后，AGS和MKN-45細胞中p53表達的Western印跡分析。（c，d）qRT-PCR（c）和蛋白質(zhì)印跡（d）分析結(jié)果證明ZFPM2-AS1以MIF依賴性方式調(diào)節(jié)p53途徑。檢測了所示組中p53靶向細胞周期蛋白D1，細胞周期蛋白E1，p21和PUMA的mRNA和蛋白質(zhì)表達。 GAPDH用作加載對照。 siMIF MIF特異性siRNA。 * P <0.05用于“vector + siNC”和“ZFPM2-AS1 + siNC”之間的比較; #P <0.05用于“ZFPM2-AS1 + siNC”和“ZFPM2-AS1 + siMIF”之間的比較。 （e）用ZFPM2-AS1過表達載體轉(zhuǎn)染AGS和MKN-45細胞的免疫熒光染色，體外培養(yǎng)48小時，p53（綠色），MIF（紅色）和細胞核（4'，6-二咪啶-2-苯基吲哚）藍色）。將ZFPM2-AS1用50nM siMIF或?qū)φ誷iRNA（siNC）共轉(zhuǎn)染到AGS和MKN-45細胞中48小時。 Western印跡顯示ZFPM2-AS1通過激活MIF表達抑制p53的核轉(zhuǎn)位