高分文章揭示miRNA最新調(diào)控機(jī)制

隨著非編碼RNA研究成果的不斷涌現(xiàn)，要發(fā)高分文章就需要尋找新的模型、研究最新的機(jī)制。目前 lncRNA染色質(zhì)調(diào)控和ceRNA機(jī)制的研究比較成熟，然而其作為miRNA cluster前體在腫瘤及耐藥上的作用研究還比較少。近日（10月16），范德堡大學(xué)的研究者在Nature Medicine（IF=29.8）上以“l(fā)ncRNA MIR100HG-derived miR-100 and miR-125b mediate cetuximab resistance via Wnt/β-catenin signaling”為題，報(bào)道了lncRNA作為miRNA cluster前體，誘導(dǎo)癌癥耐西妥昔單抗（cetuximab）的新機(jī)制。

亮點(diǎn)：

1、首次發(fā)現(xiàn)lncRNA MIR100HG 及其衍生的miR-100, miR-125b在藥物耐藥中的作用。

2、miR-100 和miR-125b cluster的協(xié)同耐藥作用。

3、GATA6和MIR100HG/ miR-125b的負(fù)調(diào)控回路。

研究思路：

1、3D細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建耐藥細(xì)胞模型：作者使用3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)將cetuximab敏感的結(jié)直腸癌細(xì)胞連續(xù)4個(gè)月暴露在cetuximab中，獲得耐藥細(xì)胞。

2、篩查耐藥相關(guān)基因：作者對(duì)耐藥和非耐藥CRC細(xì)胞進(jìn)行全外顯子測(cè)序、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和small RNA 測(cè)序，最后發(fā)現(xiàn)lnc MIR100HG、mir - 100和mir - 125b在耐藥細(xì)胞中上調(diào)。作者發(fā)現(xiàn)lnc MIR100HG是mir - 100和mir - 125b的宿主機(jī)因， 隨后利用qPCR、 FISH、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和不同耐藥程度細(xì)胞檢測(cè)表達(dá)，驗(yàn)證這幾基因在耐藥中上調(diào)。

3、miR-100 和 miR-125b 協(xié)同耐藥功能研究： 通過慢病毒過表達(dá)miR-100、miR-125b及它們雙順反子，通過對(duì)應(yīng)的spongs 消減；然后檢測(cè)克隆數(shù)、利用免疫熒光檢測(cè)生長(zhǎng)和凋亡marker、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證腫瘤大小和重量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙順反子促耐藥細(xì)胞生存能力最強(qiáng)，證明兩個(gè)miRNA的協(xié)同耐藥作用。

4、miR-100 和miR-125b 耐藥機(jī)制研究：預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等證明wnt的幾個(gè)抑制劑可作為miR-100 或miR-125b的靶基因，同時(shí)通過免疫熒光、qPCR和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-100 或miR-125b通過wnt 通路調(diào)控耐藥。

5、調(diào)控miR-100 和miR-125b的機(jī)制：為研究miR-100 和miR-125b上調(diào)的原因，首先尋找宿主基因lnc MIR100HG啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄因子。通過wb、免疫熒光和免疫組化證明轉(zhuǎn)錄因子GATA6在耐藥細(xì)胞中下調(diào)；通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、敲除等實(shí)驗(yàn)證明GATA6抑制lnc MIR100HG啟動(dòng)活性。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn) GATA6 具miR-125b結(jié)合位點(diǎn)，通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及過表達(dá)/敲除實(shí)驗(yàn)證明它們的負(fù)調(diào)控。從而證明GATA6和MIR100HG/ miR-125b的負(fù)調(diào)控回路。

6、臨床樣本驗(yàn)證cetuximab治療結(jié)直腸癌耐藥后MIR100HG、miR-100和miR-125b上調(diào)。