氧化應(yīng)激易導(dǎo)致多種衰老相關(guān)疾病的發(fā)生,如心血管疾病和癌癥等。在衰老過(guò)程中,活性氧產(chǎn)生的增加通常伴隨著氧化應(yīng)激的適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)的下降。這種下降主要是由于抗氧化劑生產(chǎn)的減少。核因子E2相關(guān)因子2(NRF2)是調(diào)節(jié)氧化和親電應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,同時(shí)它也被證實(shí)在細(xì)胞代謝調(diào)控中發(fā)揮作用。NRF2在衰老過(guò)程中表達(dá)會(huì)下降,但機(jī)制尚不清楚。2018年6月22號(hào)Redox Biology(IF=7.126)雜志上發(fā)表了題為“MicroRNAs mediate the senescence-associated decline of NRF2 in endothelial cells”的論文,在這項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn),在老內(nèi)皮細(xì)胞豐富的microRNA(miRNA)通過(guò)直接靶向NRF2 mRNA從而降低NRF2表達(dá)。這種現(xiàn)象在miRNA抑制劑作用下會(huì)逆轉(zhuǎn)。與衰老相關(guān)的NRF2下調(diào)會(huì)降低內(nèi)皮糖酵解活性和應(yīng)激耐受性,兩者在恢復(fù)NRF2表達(dá)后也會(huì)恢復(fù)。操縱與衰老相關(guān)miRNA水平與NRF2結(jié)果一致也會(huì)影響糖酵解活性和應(yīng)激耐受性。本研究結(jié)論是衰老相關(guān)miRNA會(huì)使NRF2的表達(dá)下降,從而有助于抑制細(xì)胞衰老過(guò)程中的適應(yīng)性反應(yīng)。
技術(shù)路線
結(jié)果
1. NRF2在衰老的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)下降。
圖1. NRF2在衰老的內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)下降
A. qPCR 檢測(cè)NRF2 表達(dá)基因、核因子、Erythroid 2 Like 2 (NFE2L2) (n=3)以及NRF2在年輕(p4)和衰老(p16) HUVECs中的WB檢測(cè)。B. NRF2靶基因HMOX1在年輕 (p4) 和衰老 (p16) HUVECs中的表達(dá)。C. NFE2L2 和HMOX1 的mRNA (n=6) in oxPAPC處理后的細(xì)胞(30 μg/ml, 10 h)中的表達(dá). 差異倍數(shù)是根據(jù)各自的對(duì)照值計(jì)算的。(所有數(shù)據(jù):平均值 ± SD, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
2.在衰老內(nèi)皮細(xì)胞中增加NRF2表達(dá)可恢復(fù)糖酵解過(guò)程。
圖2. NRF2過(guò)表達(dá)恢復(fù)糖酵解活性和耐受性
A-B. 糖酵解壓力測(cè)試在年輕 (p4, p8)和衰老的(p12, p16) HUVECs中 (A) and NRF2過(guò)表達(dá)HUVECs中(B). 數(shù)據(jù)用細(xì)胞外酸化率(ECAR)表示,歸一化為蛋白濃度。糖酵解速率是細(xì)胞在加入飽和葡萄糖后所達(dá)到的ECAR速率。糖酵解能力是加入寡聚霉素后細(xì)胞群達(dá)到的最大ECAR速率,它能抑制氧化磷酸化。值得注意的是,(B)的結(jié)果來(lái)自于單獨(dú)運(yùn)行,因此不能將樣品之間的值進(jìn)行比較。(所有的數(shù)據(jù):平均值 ± SEM, n=5, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
3.增加NRF2表達(dá)不能恢復(fù)衰老內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
圖3. 過(guò)表達(dá)NRF2和信號(hào)通路激活沒(méi)有恢復(fù)增殖能力
年輕(p4) 和衰老(p16) 的(A), 衰老(p16) NRF2過(guò)表達(dá)的 (B),和衰老(p16) oxPAPC處理過(guò)(C)的 HUVECs中細(xì)胞增殖和基因表達(dá)。A. 增殖和qPCR的差異倍數(shù)是根據(jù)年輕細(xì)胞的值計(jì)算的 (增殖:n=18 ,qPCR :n=9)。B. 增殖和qPCR的差異倍數(shù)是根據(jù)對(duì)照組年輕和衰老細(xì)胞的值計(jì)算的(增殖:n=48,qPCR :n=6). C. 增殖和qPCR的差異倍數(shù)是根據(jù)oxPAPC對(duì)照組年輕和衰老細(xì)胞的值計(jì)算的 (增殖:n=36,qPCR :n=3)。(所有的數(shù)據(jù):平均值±SD, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
4.在衰老的內(nèi)皮細(xì)胞中存在著豐富的microRNAs,衰老相關(guān)的microRNAs靶向 NRF2。
圖4. miRNAs有助于衰老相關(guān)的NRF2下降
A. 在正常HUVECs(n=4)中miR21、miR100和mi-126的標(biāo)準(zhǔn)化microRNA測(cè)序數(shù)據(jù)(每百萬(wàn)個(gè)標(biāo)簽,TPM)?!癟op 50”顯示了數(shù)據(jù)中50個(gè)最豐富的miRNA的平均值。B. 用生物素化miRNA進(jìn)行miRNA-126、miR21、mi-100和CEL-miR-39(對(duì)照miRNA,ctrl)的Pull-down 測(cè)定。NRF2的富集是根據(jù)對(duì)照(CEL-miR-39)值的差異倍數(shù)(n=8)計(jì)算的。C. 在HUVECs中轉(zhuǎn)染miRNA-126、miR21、miR-100和miR-34類似物進(jìn)行NRF2進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn),用于miRNA的過(guò)表達(dá)和miRNA抑制劑。對(duì)照(CTRL)指miRN類似物和抑制劑(P6,n=3)各自的對(duì)照。D. NFR2在miRNA沉默的衰老(p16)HUVEC中的表達(dá)(qPCR:n=9;Western blot:n=3)。根據(jù)各自的對(duì)照組計(jì)算差異倍數(shù)。顯示一個(gè)代表性的WB實(shí)驗(yàn)。E. miRNA過(guò)度表達(dá)年輕(P4)HUVECs中糖酵解應(yīng)力測(cè)試(n=10)。計(jì)算數(shù)據(jù)為胞外酸化速率(ECAR)歸一化蛋白濃度,并根據(jù)類似物對(duì)照值計(jì)算差異倍數(shù)。F. NFR2靶基因NQO1在基礎(chǔ)條件下抑制miRNA和oxPAPC處理過(guò)miRNA過(guò)表達(dá)的衰老(P12)HUVECs中的表達(dá)。抑制劑的結(jié)果是根據(jù)抑制劑的對(duì)照計(jì)算的,類似物的值是根據(jù)基礎(chǔ)條件下類似物對(duì)照計(jì)算的。線表示在基礎(chǔ)條件下抑制劑/類似物對(duì)照的表達(dá)。(所有條形圖:平均值±SD,*p<0.05,*p<0.01,*** p<0.001)。
參考文獻(xiàn):Kuosmanen, S. M., Sihvola, V., Kansanen, E., Kaikkonen, M. U., & Levonen, A. L. (2018). MicroRNAs mediate the senescence-associated decline of NRF2 in endothelial cells. Redox Biology.
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